Los conjuntos de microelectrodos ( MEA ) (también conocidos como conjuntos de electrodos múltiples) son dispositivos que contienen múltiples (decenas a miles) microelectrodos a través de los cuales se obtienen o entregan señales neuronales , y sirven esencialmente como interfaces neuronales que conectan las neuronas a los circuitos electrónicos . Hay dos clases generales de AAM: AAM implantables, utilizados in vivo , y AAM no implantables, utilizados in vitro .
Las neuronas y las células musculares crean corrientes iónicas a través de sus membranas cuando se excitan, provocando un cambio de voltaje entre el interior y el exterior de la célula. Al grabar, los electrodos de un MEA transducen el cambio de voltaje del entorno transportado por iones en corrientes transportadas por electrones (corrientes electrónicas). Al estimular, los electrodos transducen corrientes electrónicas en corrientes iónicas a través del medio. Esto activa los canales iónicos dependientes de voltaje en las membranas de las células excitables, lo que hace que la célula se despolarice y desencadene un potencial de acción si es una neurona o una contracción si es una célula muscular. [ cita necesaria ]
El tamaño y la forma de una señal registrada dependen de varios factores: la naturaleza del medio en el que se encuentran la célula o células (por ejemplo, la conductividad eléctrica , la capacitancia y la homogeneidad del medio ); la naturaleza del contacto entre las celdas y el electrodo MEA (por ejemplo, área de contacto y estanqueidad); la naturaleza del propio electrodo MEA (por ejemplo, su geometría, impedancia y ruido); el procesamiento de señales analógicas (por ejemplo, la ganancia del sistema , el ancho de banda y el comportamiento fuera de las frecuencias de corte ); y las propiedades de muestreo de datos (por ejemplo, frecuencia de muestreo y procesamiento de señales digitales ). [1] Para el registro de una sola celda que cubre parcialmente un electrodo plano, el voltaje en la almohadilla de contacto es aproximadamente igual al voltaje de la región superpuesta de la celda y el electrodo multiplicado por la relación entre el área de superficie de la región superpuesta y el área de todo el electrodo, o:
suponiendo que el área alrededor de un electrodo está bien aislada y tiene una capacitancia muy pequeña asociada. [1] Sin embargo, la ecuación anterior se basa en modelar el electrodo, las celdas y sus alrededores como un diagrama de circuito equivalente . Un medio alternativo para predecir el comportamiento de los electrodos de las celdas es modelar el sistema utilizando un análisis de elementos finitos basado en la geometría en un intento de eludir las limitaciones de simplificar excesivamente el sistema en un diagrama de elementos de circuito agrupado. [2]
Se puede utilizar un MEA para realizar experimentos electrofisiológicos en cortes de tejido o cultivos celulares disociados. Con cortes de tejido agudos, las conexiones entre las células dentro de los cortes de tejido antes de la extracción y el recubrimiento se conservan más o menos, mientras que las conexiones intercelulares en cultivos disociados se destruyen antes del recubrimiento. Con cultivos neuronales disociados, las neuronas forman redes espontáneamente . [3]
Se puede ver que la amplitud de voltaje que experimenta un electrodo está inversamente relacionada con la distancia a partir de la cual se despolariza una celda. [4] Por lo tanto, puede ser necesario cultivar las células o colocarlas lo más cerca posible de los electrodos. Con cortes de tejido, se forma una capa de células muertas eléctricamente pasivas alrededor del sitio de la incisión debido al edema . [5] Una forma de solucionar esto es fabricando un MEA con electrodos tridimensionales fabricados mediante enmascaramiento y grabado químico . Estos electrodos tridimensionales penetran la capa de células muertas del tejido cortado, disminuyendo la distancia entre las células vivas y los electrodos. [6] En cultivos disociados, la adherencia adecuada de las células al sustrato MEA es importante para obtener señales sólidas.
Los primeros arreglos implantables fueron arreglos de microcables desarrollados en la década de 1950. [7] El primer experimento que implicó el uso de una serie de electrodos planos para registrar células cultivadas fue realizado en 1972 por CA Thomas, Jr. y sus colegas. [4] La configuración experimental utilizó una matriz de 2 x 15 de electrodos de oro recubiertos con negro platino , cada uno espaciado 100 μm entre sí. Los miocitos recolectados de polluelos embrionarios se disociaron y cultivaron en los MEA, y se registraron señales de hasta 1 mV de amplitud. [8] Los MEA fueron construidos y utilizados para explorar la electrofisiología de los ganglios del caracol de forma independiente por Guenter Gross y sus colegas en el Centro de Neurociencia de Redes en 1977 sin conocimiento previo del trabajo de Thomas y sus colegas. [4] En 1982, Gross observó la actividad electrofisiológica espontánea de las neuronas disociadas de la médula espinal y descubrió que la actividad dependía en gran medida de la temperatura. Por debajo de aproximadamente 30˚C, las amplitudes de la señal disminuyen rápidamente hasta un valor relativamente pequeño a temperatura ambiente . [4]
Antes de la década de 1990, existían importantes barreras de entrada para los nuevos laboratorios que buscaban realizar investigaciones sobre MEA debido a la fabricación personalizada de MEA y al software que tenían que desarrollar. [3] Sin embargo, con la llegada de una potencia informática asequible [1] y hardware y software comercial de MEA, [3] muchos otros laboratorios pudieron realizar investigaciones utilizando MEA.
Las matrices de microelectrodos se pueden dividir en subcategorías según su uso potencial: matrices in vitro e in vivo .
El tipo estándar de MEA in vitro viene en un patrón de 8 x 8 o 6 x 10 electrodos. Los electrodos suelen estar compuestos de óxido de indio y estaño , negro de platino o nitruro de titanio y tienen diámetros entre 10 y 30 μm. Estas matrices se utilizan normalmente para cultivos unicelulares o cortes cerebrales agudos. [1]
Un desafío entre los MEA in vitro ha sido obtener imágenes de ellos con microscopios que utilizan lentes de alta potencia, lo que requiere distancias de trabajo bajas, del orden de micrómetros. Para evitar este problema, se han creado MEA "delgados" utilizando cubreobjetos de vidrio. Estas matrices tienen aproximadamente 180 μm, lo que permite utilizarlas con lentes de alta potencia. [1] [9]
En otro diseño especial, 60 electrodos se dividen en matrices de 6 × 5 separadas por 500 μm. Los electrodos dentro de un grupo están separados por 30 µm con diámetros de 10 µm. Matrices como esta se utilizan para examinar las respuestas locales de las neuronas y al mismo tiempo estudiar la conectividad funcional de cortes organotípicos. [1] [10]
La resolución espacial es una de las ventajas clave de los MEA y permite que las señales enviadas a larga distancia se tomen con mayor precisión cuando se utiliza un MEA de alta densidad. Estas matrices suelen tener un patrón de rejilla cuadrada de 256 electrodos que cubren un área de 2,8 por 2,8 mm. [1]
Una mayor resolución espacial es proporcionada por conjuntos de microelectrodos de alta densidad basados en CMOS que cuentan con miles de electrodos junto con circuitos integrados de lectura y estimulación en chips compactos del tamaño de una miniatura. [11] Incluso se ha demostrado la resolución de señales que se propagan a lo largo de axones individuales. [12]
Para obtener señales de calidad, los electrodos y el tejido deben estar en estrecho contacto entre sí. El diseño MEA perforado aplica presión negativa a las aberturas del sustrato para que se puedan colocar cortes de tejido en los electrodos para mejorar el contacto y las señales registradas. [1]
Un enfoque diferente para reducir la impedancia del electrodo es mediante la modificación del material de la interfaz, por ejemplo mediante el uso de nanotubos de carbono , [13] [14] o mediante la modificación de la estructura de los electrodos, con, por ejemplo, nanopilares de oro [15] o nanocavidades. [dieciséis]
Las tres categorías principales de MEA implantables son microcables, basados en silicio [17] y matrices de microelectrodos flexibles. Los MEA de microcables están hechos en gran parte de acero inoxidable o tungsteno y pueden usarse para estimar la posición de neuronas individuales registradas mediante triangulación. Las matrices de microelectrodos a base de silicio incluyen dos modelos específicos: las matrices de Michigan y Utah. Las matrices de Michigan permiten una mayor densidad de sensores para la implantación, así como una resolución espacial más alta que los MEA de microcables. También permiten obtener señales a lo largo de la longitud del vástago, en lugar de solo en los extremos de los vástagos. A diferencia de los conjuntos de Michigan, los conjuntos de Utah son tridimensionales y constan de 100 agujas de silicio conductoras. Sin embargo, en una matriz de Utah, las señales solo se reciben desde las puntas de cada electrodo, lo que limita la cantidad de información que se puede obtener al mismo tiempo. Además, los arreglos de Utah se fabrican con dimensiones y parámetros establecidos, mientras que el arreglo de Michigan permite una mayor libertad de diseño. Las matrices flexibles, fabricadas con poliimida , parileno o benzociclobuteno , proporcionan una ventaja sobre las matrices de microelectrodos rígidos porque proporcionan una coincidencia mecánica más estrecha, ya que el módulo de Young del silicio es mucho mayor que el del tejido cerebral, lo que contribuye a la inflamación inducida por cizallamiento . [7]
La unidad fundamental de comunicación de las neuronas es, al menos eléctricamente, el potencial de acción. Este fenómeno de todo o nada se origina en el montículo del axón , [18] lo que resulta en una despolarización del entorno intracelular que se propaga hacia abajo por el axón . Este flujo de iones a través de la membrana celular genera un cambio brusco de voltaje en el entorno extracelular, que es lo que finalmente detectan los electrodos MEA. Por lo tanto, el conteo y clasificación de picos de voltaje se utiliza a menudo en la investigación para caracterizar la actividad de la red. El análisis del tren de picos también puede ahorrar tiempo de procesamiento y memoria informática en comparación con las mediciones de voltaje. Las marcas de tiempo de pico se identifican como momentos en los que el voltaje medido por un electrodo individual excede un umbral (a menudo definido por desviaciones estándar de la media de un período de tiempo inactivo). Estas marcas de tiempo se pueden procesar aún más para identificar ráfagas (múltiples picos muy próximos). Un análisis más detallado de estos trenes puede revelar la organización de los picos y los patrones temporales. [19]
En general, las principales ventajas de las matrices in vitro en comparación con métodos más tradicionales, como el parche de sujeción, incluyen: [20]
Además, las matrices in vitro no son invasivas en comparación con la sujeción con parche porque no requieren romper la membrana celular.
Sin embargo, con respecto a las matrices in vivo , la principal ventaja sobre la fijación con parches es la alta resolución espacial. Las matrices implantables permiten obtener señales de neuronas individuales, lo que permite obtener información como la posición o la velocidad del movimiento motor que se puede utilizar para controlar un dispositivo protésico . Es posible realizar registros paralelos a gran escala con decenas de electrodos implantados, al menos en roedores, durante el comportamiento animal. Esto hace que estos registros extracelulares sean el método elegido para identificar circuitos neuronales y estudiar sus funciones. Sin embargo, la identificación inequívoca de la neurona registrada mediante matrices extracelulares de electrodos múltiples sigue siendo un problema hasta la fecha.
Los MEA in vitro son menos adecuados para registrar y estimular células individuales debido a su baja resolución espacial en comparación con los sistemas de abrazadera de parche y abrazadera dinámica. La complejidad de las señales que un electrodo MEA podría transmitir eficazmente a otras celdas es limitada en comparación con las capacidades de las abrazaderas dinámicas.
También existen varias respuestas biológicas a la implantación de una matriz de microelectrodos, particularmente en lo que respecta a la implantación crónica. Los más notables entre estos efectos son la pérdida de células neuronales, la cicatrización glial y una caída en el número de electrodos en funcionamiento. [21] La respuesta del tejido a la implantación depende de muchos factores, incluido el tamaño de los vástagos de MEA, la distancia entre los vástagos, la composición del material de MEA y el período de tiempo de inserción. La respuesta del tejido normalmente se divide en respuesta a corto y largo plazo. La respuesta a corto plazo se produce a las pocas horas de la implantación y comienza con un aumento de la población de astrocitos y células gliales que rodean el dispositivo. La microglía reclutada inicia entonces la inflamación y comienza un proceso de fagocitosis del material extraño. Con el tiempo, los astrocitos y la microglía reclutados en el dispositivo comienzan a acumularse, formando una vaina que rodea la matriz que se extiende decenas de micrómetros alrededor del dispositivo. Esto no sólo aumenta el espacio entre las sondas de los electrodos, sino que también aísla los electrodos y aumenta las mediciones de impedancia. Los problemas con la implantación crónica de matrices han sido una fuerza impulsora en la investigación de estos dispositivos. Un nuevo estudio examinó los efectos neurodegenerativos de la inflamación causada por la implantación crónica. [22] Los marcadores inmunohistoquímicos mostraron una sorprendente presencia de tau hiperfosforilada, un indicador de la enfermedad de Alzheimer , cerca del sitio de registro del electrodo. La fagocitosis del material de los electrodos también pone en duda la cuestión de la respuesta de biocompatibilidad, que, según las investigaciones, ha sido menor y se vuelve casi inexistente después de 12 semanas in vivo . La investigación para minimizar los efectos negativos de la inserción de dispositivos incluye el recubrimiento de la superficie de los dispositivos con proteínas que estimulan la unión de las neuronas, como la laminina o sustancias liberadoras de fármacos. [23]
La naturaleza de las redes neuronales disociadas no parece cambiar ni disminuir el carácter de su respuesta farmacológica en comparación con los modelos in vivo , lo que sugiere que los MEA pueden usarse para estudiar los efectos farmacológicos en cultivos neuronales disociados en un entorno más simple y controlado. [24] Varios estudios farmacológicos utilizan MEA en redes neuronales disociadas, por ejemplo, estudios con etanol . [25] La validación entre laboratorios se ha realizado utilizando AAM. [26]
Además, se llevó a cabo una importante cantidad de trabajo sobre diversos aspectos biofísicos de la función de la red reduciendo los fenómenos normalmente estudiados en el nivel conductual al nivel de la red cortical disociada. Por ejemplo, la capacidad de dichas redes para extraer características espaciales [27] y temporales [28] de diversas señales de entrada, dinámica de sincronización, [29] sensibilidad a la neuromodulación [30] [31] [32] y cinética de aprendizaje mediante sistemas cerrados. regímenes de bucle. [33] [34] Finalmente, la combinación de la tecnología MEA con microscopía confocal permite estudiar las relaciones entre la actividad de la red y la remodelación sináptica. [9]
Los MEA se han utilizado para interconectar redes neuronales con sistemas no biológicos como controlador. Por ejemplo, se puede crear una interfaz neuronal-computadora utilizando MEA. Se integraron neuronas corticales de rata disociadas en un circuito cerrado de retroalimentación estímulo-respuesta para controlar un animal en un entorno virtual. [35] Potter, Mandhavan y DeMarse, [36] y Mark Hammond, Kevin Warwick y Ben Whalley también construyeron un sistema de estímulo-respuesta de circuito cerrado utilizando un MEA en la Universidad de Reading . Se colocaron alrededor de 300.000 neuronas de rata disociadas en un MEA, que estaba conectado a motores y sensores de ultrasonido en un robot, y estaba acondicionado para evitar obstáculos cuando se detectaba. [37] En este sentido, Shimon Marom y sus colegas del Technion conectaron redes neuronales disociadas que crecían en MEA a un robot Lego Mindstorms ; La red clasificó el campo visual del robot y se enviaron comandos a las ruedas del robot de manera que evite por completo chocar con obstáculos. [27] Este "vehículo Braitenberg" se utilizó para demostrar la indeterminación de la neuroingeniería inversa, mostrando que incluso en una configuración simple con acceso prácticamente ilimitado a cada pieza de información relevante, [38] era imposible deducir con certeza la estructura neuronal específica. Esquema de codificación que se utilizó para impulsar el comportamiento de los robots.
Los MEA se han utilizado para observar la activación de la red en cortes del hipocampo . [39]
Actualmente hay varias interfaces implantables disponibles para uso del consumidor, incluidos estimuladores cerebrales profundos , implantes cocleares y marcapasos cardíacos . La estimulación cerebral profunda (ECP) ha sido eficaz en el tratamiento de trastornos del movimiento como la enfermedad de Parkinson , [40] y los implantes cocleares han ayudado a muchas personas a mejorar su audición al ayudar a estimular el nervio auditivo . Debido a su notable potencial, los AAM son un área destacada de la investigación en neurociencia. Las investigaciones sugieren que los AAM pueden proporcionar información sobre procesos como la formación y la percepción de la memoria y también pueden tener valor terapéutico para afecciones como la epilepsia , la depresión y el trastorno obsesivo-compulsivo [ cita requerida ] . En un proyecto titulado BrainGate se han iniciado ensayos clínicos que utilizan dispositivos de interfaz para restaurar el control motor después de una lesión de la médula espinal o como tratamiento para la ELA (ver vídeo de demostración: BrainGate). Los MEA proporcionan la alta resolución necesaria para registrar señales que varían en el tiempo, lo que les da la capacidad de usarse para controlar y obtener retroalimentación de dispositivos protésicos, como lo demostraron Kevin Warwick , Mark Gasson y Peter Kyberd . [41] [42] Las investigaciones sugieren que el uso de MEA puede ayudar a restaurar la visión estimulando la vía óptica . [7]
Cada dos años se celebra en Reutlingen una reunión científica de usuarios organizada por el Instituto de Ciencias Naturales y Médicas (NMI) de la Universidad de Tubinga . Las reuniones ofrecen una visión general completa de todos los aspectos relacionados con los nuevos desarrollos y las aplicaciones actuales de los conjuntos de microelectrodos en neurociencia básica y aplicada, así como en el descubrimiento de fármacos industriales, farmacología de seguridad y neurotecnología. La conferencia bianual se ha convertido en un foro internacional para científicos que desarrollan y utilizan AAM tanto de la industria como del mundo académico, y es reconocido como un foro científico repleto de información de alta calidad. Las contribuciones de la reunión están disponibles como libros de actas de acceso abierto.
Además de utilizarse con fines científicos, los AAM se han utilizado en el arte contemporáneo para investigar cuestiones filosóficas sobre la relación entre tecnología y biología. Tradicionalmente, dentro del pensamiento occidental, la biología y la tecnología se han separado en dos categorías distintas: bios y technê. [43] En 2002, MEART: The Semi-living Artist fue creado como un proyecto colaborativo de arte y ciencia entre SymbioticA en la Universidad de Australia Occidental en Perth y el Potter Lab en el Instituto de Tecnología de Georgia en Atlanta , para cuestionar la relación. entre biología y tecnología. [44] [45] [46] [47] MEART consistía en neuronas corticales de rata cultivadas in vitro en un MEA en Atlanta, un brazo robótico neumático capaz de dibujar con bolígrafos sobre papel en Perth y un software para controlar las comunicaciones entre los dos. Las señales de las neuronas se transmitieron en un circuito cerrado entre Perth y Atlanta mientras el MEA estimulaba el brazo neumático. MEART se exhibió por primera vez al público en la exposición Biofeel en el Instituto de Arte Contemporáneo de Perth en 2002. [46] [48]
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