Los conjuntos de microelectrodos ( MEA ) (también denominados conjuntos multielectrodos) son dispositivos que contienen múltiples (decenas a miles) microelectrodos a través de los cuales se obtienen o envían señales neuronales , y que sirven esencialmente como interfaces neuronales que conectan las neuronas a los circuitos electrónicos . Existen dos clases generales de MEA: MEA implantables, utilizados in vivo , y MEA no implantables, utilizados in vitro .
Las neuronas y las células musculares crean corrientes de iones a través de sus membranas cuando se excitan, lo que provoca un cambio de voltaje entre el interior y el exterior de la célula. Al registrar, los electrodos de un electroencefalograma transducen el cambio de voltaje del entorno transportado por iones en corrientes transportadas por electrones (corrientes electrónicas). Al estimular, los electrodos transducen corrientes electrónicas en corrientes iónicas a través del medio. Esto activa los canales iónicos dependientes del voltaje en las membranas de las células excitables, lo que hace que la célula se despolarice y desencadene un potencial de acción si es una neurona o una contracción si es una célula muscular. [ cita requerida ]
El tamaño y la forma de una señal registrada dependen de varios factores: la naturaleza del medio en el que se encuentran la celda o celdas (por ejemplo, la conductividad eléctrica , la capacitancia y la homogeneidad del medio ); la naturaleza del contacto entre las celdas y el electrodo MEA (por ejemplo, el área de contacto y la estanqueidad); la naturaleza del electrodo MEA en sí (por ejemplo, su geometría, impedancia y ruido); el procesamiento de la señal analógica (por ejemplo, la ganancia , el ancho de banda y el comportamiento del sistema fuera de las frecuencias de corte ); y las propiedades de muestreo de datos (por ejemplo, la frecuencia de muestreo y el procesamiento de la señal digital ). [1] Para la grabación de una sola celda que cubre parcialmente un electrodo plano, el voltaje en la almohadilla de contacto es aproximadamente igual al voltaje de la región superpuesta de la celda y el electrodo multiplicado por la relación entre el área de superficie de la región superpuesta y el área de todo el electrodo, o:
suponiendo que el área alrededor de un electrodo está bien aislada y tiene una capacitancia muy pequeña asociada con ella. [1] Sin embargo, la ecuación anterior se basa en modelar el electrodo, las celdas y sus alrededores como un diagrama de circuito equivalente . Un medio alternativo para predecir el comportamiento de la celda y el electrodo es modelar el sistema utilizando un análisis de elementos finitos basado en la geometría en un intento de eludir las limitaciones de simplificar demasiado el sistema en un diagrama de elementos de circuito concentrado. [2]
Se puede utilizar un MEA para realizar experimentos electrofisiológicos en cortes de tejido o cultivos de células disociadas. Con cortes de tejido agudos, las conexiones entre las células dentro de los cortes de tejido antes de la extracción y la siembra se conservan más o menos, mientras que las conexiones intercelulares en cultivos disociados se destruyen antes de la siembra. Con cultivos neuronales disociados, las neuronas forman redes espontáneamente . [3]
Se puede observar que la amplitud de voltaje que experimenta un electrodo está inversamente relacionada con la distancia desde la cual una célula se despolariza. [4] Por lo tanto, puede ser necesario que las células se cultiven o se coloquen lo más cerca posible de los electrodos. Con cortes de tejido, se forma una capa de células muertas eléctricamente pasivas alrededor del sitio de la incisión debido al edema . [5] Una forma de lidiar con esto es fabricar un MEA con electrodos tridimensionales fabricados mediante enmascaramiento y grabado químico . Estos electrodos 3-D penetran la capa de células muertas del tejido del corte, disminuyendo la distancia entre las células vivas y los electrodos. [6] En cultivos disociados, la adherencia adecuada de las células al sustrato MEA es importante para obtener señales robustas.
Las primeras matrices implantables fueron matrices de microalambres desarrolladas en la década de 1950. [7] El primer experimento que implicó el uso de una matriz de electrodos planos para registrar células cultivadas fue realizado en 1972 por CA Thomas, Jr. y sus colegas. [4] La configuración experimental utilizó una matriz de 2 x 15 electrodos de oro chapados con platino negro , cada uno espaciado a 100 μm entre sí. Los miocitos recolectados de polluelos embrionarios se disociaron y se cultivaron en los MEA, y se registraron señales de hasta 1 mV de amplitud alta. [8] Los MEA fueron construidos y utilizados para explorar la electrofisiología de los ganglios del caracol de forma independiente por Guenter Gross y sus colegas en el Centro de Neurociencia de Redes en 1977 sin conocimiento previo del trabajo de Thomas y sus colegas. [4] En 1982, Gross observó actividad electrofisiológica espontánea de neuronas de la médula espinal disociadas y descubrió que la actividad dependía mucho de la temperatura. Por debajo de unos 30 °C, las amplitudes de la señal disminuyen rápidamente hasta alcanzar valores relativamente pequeños a temperatura ambiente . [4]
Antes de la década de 1990, existían importantes barreras de entrada para los nuevos laboratorios que buscaban realizar investigaciones sobre MEA debido a la fabricación de MEA a medida y al software que tenían que desarrollar. [3] Sin embargo, con la llegada de la potencia informática asequible [1] y el hardware y software comerciales de MEA, [3] muchos otros laboratorios pudieron realizar investigaciones utilizando MEA.
Las matrices de microelectrodos se pueden dividir en subcategorías según su uso potencial: matrices in vitro y matrices in vivo .
El tipo estándar de MEA in vitro viene en un patrón de electrodos de 8 x 8 o 6 x 10. Los electrodos suelen estar compuestos de óxido de indio y estaño , platino negro o nitruro de titanio y tienen diámetros entre 10 y 30 μm. Estas matrices se utilizan normalmente para cultivos de células individuales o cortes cerebrales agudos. [1]
Uno de los desafíos que se presentan con los MEA in vitro es la obtención de imágenes de ellos con microscopios que utilizan lentes de alta potencia, lo que requiere distancias de trabajo bajas, del orden de micrómetros. Para evitar este problema, se han creado MEA "delgados" utilizando vidrio de cubierta. Estos conjuntos tienen aproximadamente 180 μm, lo que permite su uso con lentes de alta potencia. [1] [9]
En otro diseño especial, 60 electrodos se dividen en conjuntos de 6 × 5 separados por 500 μm. Los electrodos dentro de un grupo están separados por 30 μm con diámetros de 10 μm. Conjuntos como este se utilizan para examinar las respuestas locales de las neuronas mientras se estudia también la conectividad funcional de cortes organotípicos. [1] [10]
La resolución espacial es una de las principales ventajas de los MEA y permite captar con mayor precisión las señales enviadas a larga distancia cuando se utiliza un MEA de alta densidad. Estos conjuntos suelen tener una cuadrícula cuadrada de 256 electrodos que cubren un área de 2,8 x 2,8 mm. [1]
Se logra una mayor resolución espacial mediante matrices de microelectrodos de alta densidad basadas en CMOS que incluyen miles de electrodos junto con circuitos de lectura y estimulación integrados en chips compactos del tamaño de una uña del pulgar. [11] Incluso se ha demostrado la resolución de señales que se propagan a lo largo de axones individuales. [12]
Para obtener señales de calidad, los electrodos y el tejido deben estar en estrecho contacto entre sí. El diseño de MEA perforado aplica presión negativa a las aberturas en el sustrato para que las rebanadas de tejido se puedan colocar sobre los electrodos para mejorar el contacto y las señales registradas. [1]
Un enfoque diferente para reducir la impedancia de los electrodos es mediante la modificación del material de la interfaz, por ejemplo, utilizando nanotubos de carbono , [13] [14] o mediante la modificación de la estructura de los electrodos, por ejemplo con nanopilares de oro [15] o nanocavidades. [16]
Las tres categorías principales de MEA implantables son los microalambres, los basados en silicio [17] y los conjuntos de microelectrodos flexibles. Los MEA de microalambres están hechos principalmente de acero inoxidable o tungsteno y se pueden utilizar para estimar la posición de neuronas individuales registradas por triangulación. Los conjuntos de microelectrodos basados en silicio incluyen dos modelos específicos: los conjuntos Michigan y Utah. Los conjuntos Michigan permiten una mayor densidad de sensores para la implantación, así como una mayor resolución espacial que los MEA de microalambres. También permiten obtener señales a lo largo de la longitud del vástago, en lugar de solo en los extremos de los vástagos. A diferencia de los conjuntos Michigan, los conjuntos Utah son tridimensionales y constan de 100 agujas de silicio conductoras. Sin embargo, en un conjunto Utah, las señales solo se reciben de las puntas de cada electrodo, lo que limita la cantidad de información que se puede obtener a la vez. Además, los conjuntos Utah se fabrican con dimensiones y parámetros establecidos, mientras que el conjunto Michigan permite una mayor libertad de diseño. Las matrices flexibles, hechas con poliimida , parileno o benzociclobuteno , proporcionan una ventaja sobre las matrices de microelectrodos rígidos porque proporcionan una correspondencia mecánica más cercana, ya que el módulo de Young del silicio es mucho mayor que el del tejido cerebral, lo que contribuye a la inflamación inducida por cizallamiento . [7]
La unidad fundamental de comunicación de las neuronas es, al menos eléctricamente, el potencial de acción. Este fenómeno de todo o nada se origina en el cono axónico , [18] lo que resulta en una despolarización del entorno intracelular que se propaga a través del axón . Este flujo de iones a través de la membrana celular genera un cambio brusco de voltaje en el entorno extracelular, que es lo que los electrodos MEA detectan en última instancia. Por lo tanto, el recuento y la clasificación de picos de voltaje se utilizan a menudo en la investigación para caracterizar la actividad de la red. El análisis de trenes de picos también puede ahorrar tiempo de procesamiento y memoria de cómputo en comparación con las mediciones de voltaje. Las marcas de tiempo de los picos se identifican como momentos en los que el voltaje medido por un electrodo individual excede un umbral (a menudo definido por desviaciones estándar de la media de un período de tiempo inactivo). Estas marcas de tiempo se pueden procesar aún más para identificar ráfagas (picos múltiples en estrecha proximidad). Un análisis más detallado de estos trenes puede revelar la organización de los picos y los patrones temporales. [19]
En general, las principales ventajas de las matrices in vitro en comparación con métodos más tradicionales, como el patch clamping, incluyen: [20]
Además, las matrices in vitro no son invasivas en comparación con el método de fijación de parche porque no requieren romper la membrana celular.
Sin embargo, en lo que respecta a los arrays in vivo , la principal ventaja sobre el patch clamping es la alta resolución espacial. Los arrays implantables permiten obtener señales de neuronas individuales, lo que permite obtener información como la posición o la velocidad del movimiento motor que se puede utilizar para controlar un dispositivo protésico . Es posible realizar grabaciones paralelas a gran escala con decenas de electrodos implantados, al menos en roedores, durante el comportamiento animal. Esto hace que estos registros extracelulares sean el método de elección para identificar circuitos neuronales y estudiar sus funciones. Sin embargo, la identificación inequívoca de la neurona registrada mediante arrays extracelulares de múltiples electrodos sigue siendo un problema hasta la fecha.
Los electrodos MEA in vitro son menos adecuados para registrar y estimular células individuales debido a su baja resolución espacial en comparación con los sistemas de pinza de parche y pinza dinámica. La complejidad de las señales que un electrodo MEA podría transmitir de manera efectiva a otras células es limitada en comparación con las capacidades de las pinzas dinámicas.
También existen varias respuestas biológicas a la implantación de una matriz de microelectrodos, particularmente en lo que respecta a la implantación crónica. Entre estos efectos, los más notables son la pérdida de células neuronales, la cicatrización glial y una caída en el número de electrodos funcionales. [21] La respuesta del tejido a la implantación depende de muchos factores, incluidos el tamaño de los vástagos de MEA, la distancia entre los vástagos, la composición del material de MEA y el período de inserción. La respuesta del tejido generalmente se divide en respuesta a corto y largo plazo. La respuesta a corto plazo ocurre dentro de las horas posteriores a la implantación y comienza con un aumento de la población de astrocitos y células gliales que rodean el dispositivo. La microglía reclutada luego inicia la inflamación y comienza un proceso de fagocitosis del material extraño. Con el tiempo, los astrocitos y la microglía reclutados al dispositivo comienzan a acumularse, formando una vaina que rodea la matriz que se extiende decenas de micrómetros alrededor del dispositivo. Esto no solo aumenta el espacio entre las sondas de electrodos, sino que también aísla los electrodos y aumenta las mediciones de impedancia. Los problemas con la implantación crónica de matrices han sido una fuerza impulsora en la investigación de estos dispositivos. Un estudio novedoso examinó los efectos neurodegenerativos de la inflamación causada por la implantación crónica. [22] Los marcadores inmunohistoquímicos mostraron una presencia sorprendente de tau hiperfosforilada, un indicador de la enfermedad de Alzheimer , cerca del sitio de registro del electrodo. La fagocitosis del material del electrodo también pone en tela de juicio el problema de una respuesta de biocompatibilidad, que la investigación sugiere que ha sido menor y se vuelve casi inexistente después de 12 semanas in vivo . La investigación para minimizar los efectos negativos de la inserción del dispositivo incluye el recubrimiento de la superficie de los dispositivos con proteínas que fomentan la adhesión de las neuronas, como la laminina o sustancias liberadoras de fármacos . [23]
La naturaleza de las redes neuronales disociadas no parece cambiar o disminuir el carácter de su respuesta farmacológica en comparación con los modelos in vivo , lo que sugiere que los MEA se pueden utilizar para estudiar los efectos farmacológicos en cultivos neuronales disociados en un entorno más simple y controlado. [24] Se han realizado varios estudios farmacológicos que utilizan MEA en redes neuronales disociadas, por ejemplo, estudios con etanol . [25] Se ha realizado una validación interlaboratorio utilizando MEA. [26]
Además, se ha llevado a cabo un importante trabajo sobre diversos aspectos biofísicos del funcionamiento de las redes, reduciendo fenómenos que habitualmente se estudian a nivel conductual al nivel de red cortical disociado. Por ejemplo, la capacidad de dichas redes para extraer características espaciales [27] y temporales [28] de diversas señales de entrada, la dinámica de la sincronización, [29] la sensibilidad a la neuromodulación [30] [31] [32] y la cinética del aprendizaje utilizando regímenes de bucle cerrado. [33] [34] Por último, la combinación de la tecnología MEA con la microscopía confocal permite estudiar las relaciones entre la actividad de la red y la remodelación sináptica. [9]
Los MEA se han utilizado para interconectar redes neuronales con sistemas no biológicos como controlador. Por ejemplo, se puede crear una interfaz neuronal-computadora utilizando MEA. Se integraron neuronas corticales de rata disociadas en un bucle de retroalimentación de estímulo-respuesta cerrado para controlar un animat en un entorno virtual. [35] Potter, Mandhavan y DeMarse también construyeron un sistema de estímulo-respuesta de bucle cerrado utilizando un MEA, [36] y Mark Hammond, Kevin Warwick y Ben Whalley en la Universidad de Reading . Aproximadamente 300.000 neuronas de rata disociadas se sembraron en un MEA, que se conectó a motores y sensores de ultrasonido en un robot, y se condicionó para evitar obstáculos cuando los detectaba. [37] En esta línea, Shimon Marom y sus colegas en el Technion engancharon redes neuronales disociadas que crecían en MEA a un robot Lego Mindstorms ; El campo visual del robot fue clasificado por la red y se enviaron comandos a las ruedas del robot de manera que evitara completamente chocar con obstáculos. [27] Este "vehículo Braitenberg" se utilizó para demostrar la indeterminación de la neuroingeniería inversa mostrando que incluso en una configuración simple con acceso prácticamente ilimitado a cada pieza de información relevante, [38] era imposible deducir con certeza el esquema de codificación neuronal específico que se utilizó para impulsar el comportamiento de los robots.
Los MEA se han utilizado para observar la activación de la red en cortes del hipocampo . [39]
Existen varias interfaces implantables que están actualmente disponibles para uso del consumidor, incluidos los estimuladores cerebrales profundos , los implantes cocleares y los marcapasos cardíacos . La estimulación cerebral profunda (ECP) ha sido eficaz en el tratamiento de trastornos del movimiento como la enfermedad de Parkinson , [40] y los implantes cocleares han ayudado a muchos a mejorar su audición al ayudar a la estimulación del nervio auditivo . Debido a su notable potencial, los MEA son un área destacada de la investigación en neurociencia. La investigación sugiere que los MEA pueden proporcionar información sobre procesos como la formación de la memoria y la percepción y también pueden tener valor terapéutico para afecciones como la epilepsia , la depresión y el trastorno obsesivo-compulsivo [ cita requerida ] . Se han iniciado ensayos clínicos que utilizan dispositivos de interfaz para restaurar el control motor después de una lesión de la médula espinal o como tratamiento para la ELA en un proyecto llamado BrainGate (ver demostración en video: BrainGate). Los MEA proporcionan la alta resolución necesaria para registrar señales que varían en el tiempo, lo que les da la capacidad de usarse tanto para controlar como para obtener retroalimentación de dispositivos protésicos, como lo demostraron Kevin Warwick , Mark Gasson y Peter Kyberd . [41] [42] Las investigaciones sugieren que el uso de MEA puede ayudar a restaurar la visión al estimular la vía óptica . [7]
Se celebra una reunión científica de usuarios bianual en Reutlingen , organizada por el Instituto de Ciencias Naturales y Médicas (NMI) de la Universidad de Tübingen . Las reuniones ofrecen una descripción general completa de todos los aspectos relacionados con los nuevos desarrollos y las aplicaciones actuales de los conjuntos de microelectrodos en neurociencia básica y aplicada, así como en el descubrimiento de fármacos industriales, la farmacología de seguridad y la neurotecnología. La conferencia bianual se ha convertido en un foro internacional para científicos que desarrollan y utilizan microelectrodos tanto de la industria como del mundo académico, y es reconocida como un foro científico repleto de información de alta calidad. Las contribuciones de la reunión están disponibles como libros de actas de acceso abierto.
Además de usarse con fines científicos, los MEA se han utilizado en el arte contemporáneo para investigar cuestiones filosóficas sobre la relación entre la tecnología y la biología. Tradicionalmente, dentro del pensamiento occidental, la biología y la tecnología se han separado en dos categorías distintas: bios y technê. [43] En 2002, MEART: The Semi-living Artist fue creado como un proyecto colaborativo de arte y ciencia entre SymbioticA en la Universidad de Australia Occidental en Perth y el Laboratorio Potter en el Instituto de Tecnología de Georgia en Atlanta , para cuestionar la relación entre la biología y la tecnología. [44] [45] [46] [47] MEART consistió en neuronas corticales de rata cultivadas in vitro en un MEA en Atlanta, un brazo robótico neumático capaz de dibujar con bolígrafos sobre papel en Perth y un software para gobernar las comunicaciones entre los dos. Las señales de las neuronas se retransmitieron en un circuito cerrado entre Perth y Atlanta mientras el MEA estimulaba el brazo neumático. MEART se exhibió por primera vez al público en la exposición Biofeel en el Instituto de Artes Contemporáneas de Perth en 2002. [46] [48]
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