La angiogénesis es el proceso fisiológico mediante el cual se forman nuevos vasos sanguíneos a partir de vasos preexistentes, [1] [2] [3] formados en la etapa anterior de la vasculogénesis . La angiogénesis continúa el crecimiento de la vasculatura principalmente mediante procesos de brotación y división, pero procesos como la angiogénesis coalescente , [4] el alargamiento de los vasos y la cooptación de los vasos también desempeñan un papel. [2] La vasculogénesis es la formación embrionaria de células endoteliales a partir de precursores de células del mesodermo , [5] y de la neovascularización , aunque las discusiones no siempre son precisas (especialmente en textos más antiguos). Los primeros vasos en el embrión en desarrollo se forman mediante vasculogénesis, después de lo cual la angiogénesis es responsable de la mayor parte, si no de todo, el crecimiento de los vasos sanguíneos durante el desarrollo y en la enfermedad. [6]
La angiogénesis es un proceso normal y vital en el crecimiento y desarrollo, así como en la cicatrización de heridas y en la formación de tejido de granulación . Sin embargo, también es un paso fundamental en la transición de los tumores de un estado benigno a uno maligno , lo que lleva al uso de inhibidores de la angiogénesis en el tratamiento del cáncer . [7] El papel esencial de la angiogénesis en el crecimiento tumoral fue propuesto por primera vez en 1971 por Judah Folkman , quien describió los tumores como "calientes y sanguinolentos", [8] ilustrando que, al menos para muchos tipos de tumores, la perfusión e incluso la hiperemia son características. .
La angiogénesis por brotes fue la primera forma identificada de angiogénesis y, debido a esto, se comprende mucho más que la angiogénesis intususceptiva. Ocurre en varias etapas bien caracterizadas. La señal inicial proviene de áreas de tejido que carecen de vasculatura. La hipoxia que se nota en estas zonas hace que los tejidos demanden la presencia de nutrientes y oxígeno que permitirán al tejido realizar actividades metabólicas. Debido a esto, las células parenquimatosas secretarán factor de crecimiento endotelial vascular ( VEGF-A ), que es un factor de crecimiento proangiogénico. [9] Estas señales biológicas activan receptores en las células endoteliales presentes en los vasos sanguíneos preexistentes. En segundo lugar, las células endoteliales activadas, también conocidas como células punta , [10] comienzan a liberar enzimas llamadas proteasas que degradan la membrana basal para permitir que las células endoteliales escapen de las paredes del vaso original (padre). Luego, las células endoteliales proliferan en la matriz circundante y forman brotes sólidos que conectan los vasos vecinos. Las células que están proliferando se encuentran detrás de las células de la punta y se conocen como células del tallo . [10] La proliferación de estas células permite que el brote capilar crezca en longitud simultáneamente.
A medida que los brotes se extienden hacia la fuente del estímulo angiogénico, las células endoteliales migran en tándem , utilizando moléculas de adhesión llamadas integrinas . Estos brotes luego forman bucles para convertirse en una luz vascular completa a medida que las células migran al sitio de angiogénesis. La brotación se produce a un ritmo de varios milímetros por día y permite que crezcan nuevos vasos a través de los huecos de la vasculatura . Es marcadamente diferente de la angiogénesis por división porque forma vasos completamente nuevos en lugar de dividir los vasos existentes.
La angiogénesis intususceptiva , también conocida como angiogénesis por división , es la formación de un nuevo vaso sanguíneo al dividir un vaso sanguíneo existente en dos.
La invaginación intestinal se observó por primera vez en ratas recién nacidas . En este tipo de formación de vasos, la pared capilar se extiende hacia la luz para dividir un vaso en dos. Hay cuatro fases de angiogénesis intususceptiva. Primero, las dos paredes capilares opuestas establecen una zona de contacto. En segundo lugar, se reorganizan las uniones de las células endoteliales y se perfora la bicapa del vaso para permitir que los factores de crecimiento y las células penetren en la luz. En tercer lugar, se forma un núcleo entre los 2 nuevos vasos en la zona de contacto que se llena de pericitos y miofibroblastos . Estas células comienzan a colocar fibras de colágeno en el núcleo para proporcionar una matriz extracelular para el crecimiento de la luz del vaso. Finalmente, se desarrolla el núcleo sin alterar la estructura básica. La intususcepción es importante porque es una reorganización de las células existentes. Permite un gran aumento en el número de capilares sin un aumento correspondiente en el número de células endoteliales . Esto es especialmente importante en el desarrollo embrionario, ya que no hay suficientes recursos para crear una microvasculatura rica con nuevas células cada vez que se desarrolla un nuevo vaso. [11]
La angiogénesis coalescente es un modo de angiogénesis, considerado lo opuesto a la angiogénesis intususceptiva, donde los capilares se fusionan o coalescen para formar un vaso sanguíneo más grande, aumentando así el flujo sanguíneo y la circulación. [12] La angiogénesis coalescente se ha extendido fuera del dominio de la embriología. Se supone que desempeña un papel en la formación de neovasculatura, como en un tumor. [13]
La estimulación mecánica de la angiogénesis no está bien caracterizada. Existe una gran controversia con respecto a la tensión de corte que actúa sobre los capilares para causar angiogénesis, aunque el conocimiento actual sugiere que el aumento de las contracciones musculares puede aumentar la angiogénesis. [14] Esto puede deberse a un aumento en la producción de óxido nítrico durante el ejercicio. El óxido nítrico produce vasodilatación de los vasos sanguíneos.
La estimulación química de la angiogénesis se realiza mediante diversas proteínas angiogénicas, por ejemplo, integrinas y prostaglandinas, incluidos varios factores de crecimiento , por ejemplo, VEGF, FGF.
La familia del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) con sus miembros prototipo FGF-1 (FGF ácido) y FGF-2 (FGF básico) consta hasta la fecha de al menos 22 miembros conocidos. [19] La mayoría son péptidos monocatenarios de 16-18 kDa y muestran una alta afinidad por la heparina y el heparán sulfato. En general, los FGF estimulan una variedad de funciones celulares uniéndose a los receptores de FGF de la superficie celular en presencia de proteoglicanos de heparina. La familia de receptores de FGF está compuesta por siete miembros, y todas las proteínas receptoras son tirosina quinasas receptoras monocatenarias que se activan mediante autofosforilación inducida por un mecanismo de dimerización del receptor mediada por FGF. La activación del receptor da lugar a una cascada de transducción de señales que conduce a la activación genética y a diversas respuestas biológicas, incluida la diferenciación celular, la proliferación y la disolución de la matriz, iniciando así un proceso de actividad mitogénica fundamental para el crecimiento de células endoteliales, fibroblastos y células del músculo liso. . El FGF-1, único entre los 22 miembros de la familia FGF, puede unirse a los siete subtipos de receptores de FGF, lo que lo convierte en el miembro de acción más amplia de la familia FGF y en un potente mitógeno para los diversos tipos de células necesarios para montar un sistema angiogénico. respuesta en tejidos dañados (hipóxicos), donde se produce una regulación positiva de los receptores de FGF. [20] FGF-1 estimula la proliferación y diferenciación de todos los tipos de células necesarias para construir un vaso arterial, incluidas las células endoteliales y las células del músculo liso; este hecho distingue al FGF-1 de otros factores de crecimiento proangiogénicos , como el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), que impulsa principalmente la formación de nuevos capilares. [21] [22]
Además del FGF-1, una de las funciones más importantes del factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF-2 o bFGF ) es la promoción de la proliferación de células endoteliales y la organización física de las células endoteliales en estructuras tubulares, promoviendo así la angiogénesis. FGF-2 es un factor angiogénico más potente que VEGF o PDGF ( factor de crecimiento derivado de plaquetas ); sin embargo, es menos potente que el FGF-1. Además de estimular el crecimiento de los vasos sanguíneos, el aFGF (FGF-1) y el bFGF (FGF-2) son actores importantes en la cicatrización de heridas. Estimulan la proliferación de fibroblastos y células endoteliales que dan lugar a la angiogénesis y al desarrollo del tejido de granulación; ambos aumentan el suministro de sangre y llenan el espacio/cavidad de la herida en las primeras etapas del proceso de curación de la herida.
Se ha demostrado que el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) contribuye de manera importante a la angiogénesis, aumentando el número de capilares en una red determinada. Los estudios iniciales in vitro demostraron que las células endoteliales capilares bovinas proliferarán y mostrarán signos de estructuras tubulares tras la estimulación con VEGF y bFGF , aunque los resultados fueron más pronunciados con VEGF. [23] La regulación positiva del VEGF es un componente importante de la respuesta fisiológica al ejercicio y se sospecha que su papel en la angiogénesis es un posible tratamiento en las lesiones vasculares. [24] [25] [26] [27] Los estudios in vitro demuestran claramente que el VEGF es un potente estimulador de la angiogénesis porque, en presencia de este factor de crecimiento, las células endoteliales en placas proliferarán y migrarán, formando eventualmente estructuras tubulares que se asemejan a los capilares. [14] VEGF provoca una cascada de señalización masiva en las células endoteliales . La unión al receptor 2 de VEGF (VEGFR-2) inicia una cascada de señalización de tirosina quinasa que estimula la producción de factores que estimulan de diversas formas la permeabilidad de los vasos (eNOS, que produce NO), la proliferación/supervivencia (bFGF) y la migración (ICAM/VCAM/MMP). y finalmente diferenciación en vasos sanguíneos maduros. Mecánicamente, el VEGF se regula positivamente con las contracciones musculares como resultado del aumento del flujo sanguíneo a las áreas afectadas. El aumento del flujo también provoca un gran aumento en la producción de ARNm de los receptores 1 y 2 de VEGF. El aumento en la producción de receptores significa que las contracciones musculares podrían provocar una regulación positiva de la cascada de señalización relacionada con la angiogénesis. Como parte de la cascada de señalización angiogénica, se considera ampliamente que el NO es un importante contribuyente a la respuesta angiogénica porque la inhibición del NO reduce significativamente los efectos de los factores de crecimiento angiogénicos. Sin embargo, la inhibición del NO durante el ejercicio no inhibe la angiogénesis, lo que indica que existen otros factores implicados en la respuesta angiogénica. [14]
Las angiopoyetinas , Ang1 y Ang2, son necesarias para la formación de vasos sanguíneos maduros, como lo demuestran los estudios de inactivación en ratones . [28] Ang1 y Ang2 son factores de crecimiento proteicos que actúan uniéndose a sus receptores, Tie-1 y Tie-2 ; Si bien esto es algo controvertido, parece que las señales celulares se transmiten principalmente por Tie-2 ; aunque algunos artículos también muestran señales fisiológicas a través de Tie-1 . Estos receptores son tirosina quinasas . Por tanto, pueden iniciar la señalización celular cuando la unión del ligando provoca una dimerización que inicia la fosforilación en tirosinas clave.
Otro contribuyente importante a la angiogénesis es la metaloproteinasa de matriz (MMP). Las MMP ayudan a degradar las proteínas que mantienen sólidas las paredes de los vasos. Esta proteólisis permite que las células endoteliales escapen a la matriz intersticial, como se ve en la angiogénesis por brotes. La inhibición de las MMP previene la formación de nuevos capilares . [29] Estas enzimas están altamente reguladas durante el proceso de formación de vasos porque la destrucción de la matriz extracelular disminuiría la integridad de la microvasculatura. [14]
El ligando 4 tipo delta (Dll4) es una proteína con un efecto regulador negativo sobre la angiogénesis. [30] [31] Dll4 es un ligando transmembrana, para la familia de receptores notch . Se han realizado muchos estudios que han servido para determinar las consecuencias del ligando 4 tipo Delta. Un estudio en particular evaluó los efectos de Dll4 sobre la vascularización y el crecimiento del tumor. [32] Para que un tumor crezca y se desarrolle, debe tener la vasculatura adecuada. La vía VEGF es vital para el desarrollo de la vasculatura que, a su vez, ayuda a que los tumores crezcan. El bloqueo combinado de VEGF y Dll4 da como resultado la inhibición de la progresión tumoral y la angiogénesis en todo el tumor. Esto se debe al obstáculo de la señalización en las células endoteliales que corta la proliferación y el brote de estas células endoteliales. Con esta inhibición, las células no crecen descontroladamente, por lo que el cáncer se detiene en este punto. Sin embargo, si se levantara el bloqueo, las células comenzarían de nuevo su proliferación. [33]
Las semaforinas de clase 3 (SEMA3) regulan la angiogénesis modulando la adhesión, migración, proliferación, supervivencia y reclutamiento de pericitos de las células endoteliales . [16] Además, las semaforinas pueden interferir con la angiogénesis mediada por VEGF ya que tanto SEMA3 como VEGF-A compiten por la unión del receptor de neuropilina en las células endoteliales. [34] [35] Por lo tanto, los niveles de expresión relativos de SEMA3 y VEGF-A pueden ser importantes para la angiogénesis. [dieciséis]
Un inhibidor de la angiogénesis puede ser endógeno o provenir del exterior como fármaco o componente dietético .
La angiogénesis puede ser un objetivo para combatir enfermedades como las enfermedades cardíacas caracterizadas por una vascularización deficiente o una vasculatura anormal. [36] La aplicación de compuestos específicos que pueden inhibir o inducir la creación de nuevos vasos sanguíneos en el cuerpo puede ayudar a combatir tales enfermedades. La presencia de vasos sanguíneos donde no debería haberlos puede afectar las propiedades mecánicas de un tejido, aumentando la probabilidad de falla. La ausencia de vasos sanguíneos en un tejido en reparación o metabólicamente activo puede inhibir la reparación u otras funciones esenciales. Varias enfermedades, como las heridas crónicas isquémicas , son el resultado de una falla o una formación insuficiente de vasos sanguíneos y pueden tratarse mediante una expansión local de los vasos sanguíneos, aportando así nuevos nutrientes al sitio, facilitando la reparación. Otras enfermedades, como la degeneración macular relacionada con la edad , pueden deberse a una expansión local de los vasos sanguíneos, lo que interfiere con los procesos fisiológicos normales.
La aplicación clínica moderna del principio de angiogénesis se puede dividir en dos áreas principales: terapias antiangiogénicas, con las que comenzó la investigación angiogénica, y terapias proangiogénicas. Mientras que se emplean terapias antiangiogénicas para combatir el cáncer y las neoplasias malignas, [37] [38] que requieren una gran cantidad de oxígeno y nutrientes para proliferar, se están explorando terapias proangiogénicas como opciones para tratar las enfermedades cardiovasculares , la causa número uno de Muerte en el mundo occidental . Una de las primeras aplicaciones de métodos proangiogénicos en humanos fue un ensayo alemán que utilizó el factor de crecimiento de fibroblastos 1 (FGF-1) para el tratamiento de la enfermedad de las arterias coronarias. [21] [39] [40]
En cuanto al mecanismo de acción , los métodos proangiogénicos se pueden diferenciar en tres categorías principales: terapia génica , dirigida a genes de interés para su amplificación o inhibición; terapia de reemplazo de proteínas , que manipula principalmente factores de crecimiento angiogénico como FGF-1 o factor de crecimiento endotelial vascular , VEGF; y terapias basadas en células, que implican la implantación de tipos de células específicas.
Todavía quedan graves problemas sin resolver relacionados con la terapia génica. Las dificultades incluyen la integración efectiva de los genes terapéuticos en el genoma de las células diana, la reducción del riesgo de una respuesta inmune no deseada, la toxicidad potencial, la inmunogenicidad , las respuestas inflamatorias y la oncogénesis relacionadas con los vectores virales utilizados en la implantación de genes y la enorme complejidad de la genética. base de la angiogénesis. Los trastornos que ocurren con más frecuencia en los seres humanos, como las enfermedades cardíacas, la presión arterial alta, la diabetes y la enfermedad de Alzheimer , son causados muy probablemente por los efectos combinados de variaciones en muchos genes y, por lo tanto, inyectar un solo gen puede no ser significativamente beneficioso en tales enfermedades. [ cita necesaria ]
Por el contrario, la terapia con proteínas proangiogénicas utiliza proteínas bien definidas y estructuradas con precisión, con dosis óptimas previamente definidas de la proteína individual para los estados patológicos y con efectos biológicos bien conocidos. [1] Por otro lado, un obstáculo de la terapia con proteínas es el modo de administración. Las vías de administración de proteínas orales, intravenosas, intraarteriales o intramusculares no siempre son tan efectivas, ya que la proteína terapéutica puede metabolizarse o eliminarse antes de que pueda ingresar al tejido objetivo. Las terapias proangiogénicas basadas en células aún se encuentran en las primeras etapas de investigación, con muchas preguntas abiertas sobre los mejores tipos de células y las dosis a utilizar.
Las células cancerosas son células que han perdido su capacidad de dividirse de forma controlada. Un tumor maligno consiste en una población de células cancerosas que se dividen y crecen rápidamente y que progresivamente acumulan mutaciones . Sin embargo, los tumores necesitan un suministro de sangre específico para proporcionar el oxígeno y otros nutrientes esenciales que necesitan para crecer más allá de un cierto tamaño (generalmente 1 a 2 mm 3 ). [41] [42]
Los tumores inducen el crecimiento de vasos sanguíneos (angiogénesis) mediante la secreción de diversos factores de crecimiento (p. ej., VEGF ) y proteínas. Los factores de crecimiento como bFGF y VEGF pueden inducir el crecimiento capilar en el tumor, que algunos investigadores sospechan que suministra los nutrientes necesarios, lo que permite la expansión del tumor. A diferencia de los vasos sanguíneos normales, los vasos sanguíneos tumorales están dilatados y tienen una forma irregular. [43] Otros médicos creen que la angiogénesis realmente sirve como una vía de desechos, eliminando los productos biológicos finales secretados por las células cancerosas que se dividen rápidamente. En cualquier caso, la angiogénesis es un paso necesario y requerido para la transición de un pequeño grupo inofensivo de células, que a menudo se dice que tiene aproximadamente el tamaño de la bola de metal en la punta de un bolígrafo, a un tumor grande. La angiogénesis también es necesaria para la diseminación de un tumor o metástasis . [7] Las células cancerosas individuales pueden desprenderse de un tumor sólido establecido, ingresar al vaso sanguíneo y ser transportadas a un sitio distante, donde pueden implantarse y comenzar el crecimiento de un tumor secundario. La evidencia ahora sugiere que el vaso sanguíneo en un tumor sólido determinado puede, de hecho, ser vasos en mosaico, compuestos de células endoteliales y células tumorales. [7] Esta mosaicidad permite una liberación sustancial de células tumorales en la vasculatura, lo que posiblemente contribuya a la aparición de células tumorales circulantes en la sangre periférica de pacientes con neoplasias malignas. [44] El crecimiento posterior de tales metástasis también requerirá un suministro de nutrientes y oxígeno y una vía de eliminación de desechos.
Durante mucho tiempo se ha considerado que las células endoteliales son genéticamente más estables que las células cancerosas. Esta estabilidad genómica confiere una ventaja al atacar las células endoteliales mediante terapia antiangiogénica, en comparación con la quimioterapia dirigida a las células cancerosas, que mutan rápidamente y adquieren resistencia a los medicamentos al tratamiento. Por este motivo, se cree que las células endoteliales son un objetivo ideal para las terapias dirigidas contra ellas. [45]
El mecanismo de formación de vasos sanguíneos por angiogénesis se inicia mediante la división espontánea de células tumorales debido a una mutación. Luego, las células tumorales liberan estimuladores angiogénicos. Luego viajan a los vasos sanguíneos cercanos ya establecidos y activan sus receptores de células endoteliales. Esto induce una liberación de enzimas proteolíticas de la vasculatura. Estas enzimas se dirigen a un punto particular del vaso sanguíneo y provocan la formación de un poro. Este es el punto desde donde crecerá el nuevo vaso sanguíneo. La razón por la que las células tumorales necesitan un suministro de sangre es porque no pueden crecer más de 2 a 3 milímetros de diámetro sin un suministro de sangre establecido, lo que equivale a unas 50 a 100 células. [46] Ciertos estudios han indicado que los vasos formados dentro del tejido tumoral son de mayor irregularidad y mayor tamaño, lo que también se asocia con un peor pronóstico. [47] [48]
La angiogénesis representa una excelente diana terapéutica para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares. Es un potente proceso fisiológico que subyace a la forma natural en que nuestros cuerpos responden a una disminución del suministro de sangre a órganos vitales, concretamente la neoangiogénesis : la producción de nuevos vasos colaterales para superar el insulto isquémico. [21] Se ha realizado una gran cantidad de estudios preclínicos con terapias basadas en proteínas, genes y células en modelos animales de isquemia cardíaca, así como modelos de enfermedad arterial periférica. Los éxitos reproducibles y creíbles en estos primeros estudios con animales generaron un gran entusiasmo por el hecho de que este nuevo enfoque terapéutico pudiera traducirse rápidamente en un beneficio clínico para millones de pacientes en el mundo occidental con estos trastornos. Sin embargo, una década de pruebas clínicas de terapias basadas en genes y proteínas diseñadas para estimular la angiogénesis en tejidos y órganos insuficientemente perfundidos ha llevado de una decepción a otra. Aunque todas estas lecturas preclínicas, que ofrecían una gran promesa para la transición de la terapia de angiogénesis de animales a humanos, fueron incorporadas de una manera u otra en ensayos clínicos en etapa inicial, la FDA, hasta la fecha (2007), ha insistido en que el principal El criterio de valoración para la aprobación de un agente angiogénico debe ser una mejora en el rendimiento del ejercicio de los pacientes tratados. [49]
Estos fracasos sugirieron que estos son objetivos moleculares incorrectos para inducir la neovascularización, que solo pueden usarse de manera efectiva si se formulan y administran correctamente, o que su presentación en el contexto del microambiente celular general puede desempeñar un papel vital en su utilidad. Puede ser necesario presentar estas proteínas de una manera que imite eventos de señalización naturales, incluida la concentración , los perfiles espaciales y temporales , y su presentación simultánea o secuencial con otros factores apropiados. [50]
La angiogénesis generalmente se asocia con el ejercicio aeróbico y el ejercicio de resistencia . Mientras que la arteriogénesis produce cambios en la red que permiten un gran aumento en la cantidad de flujo total en una red, la angiogénesis provoca cambios que permiten una mayor entrega de nutrientes durante un largo período de tiempo. Los capilares están diseñados para proporcionar la máxima eficiencia en la entrega de nutrientes, por lo que un aumento en la cantidad de capilares permite que la red entregue más nutrientes en la misma cantidad de tiempo. Un mayor número de capilares también permite un mayor intercambio de oxígeno en la red. Esto es de vital importancia para el entrenamiento de resistencia, porque permite a una persona continuar entrenando durante un período de tiempo prolongado. Sin embargo, ninguna evidencia experimental sugiere que se requiera una mayor capilaridad en el ejercicio de resistencia para aumentar el suministro máximo de oxígeno. [14]
La sobreexpresión de VEGF provoca una mayor permeabilidad en los vasos sanguíneos además de estimular la angiogénesis. En la degeneración macular húmeda , el VEGF provoca la proliferación de capilares en la retina. Dado que el aumento de la angiogénesis también provoca edema , la sangre y otros fluidos retinianos se filtran hacia la retina , provocando la pérdida de visión. Actualmente se utilizan con éxito fármacos antiangiogénicos dirigidos a las vías del VEGF para tratar este tipo de degeneración macular.
La angiogénesis de los vasos del cuerpo huésped en construcciones diseñadas con tejido implantado es esencial. El éxito de la integración depende a menudo de una vascularización completa del implante, ya que proporciona oxígeno y nutrientes y previene la necrosis en las zonas centrales del implante. [51] Se ha demostrado que el PDGF estabiliza la vascularización en estructuras de colágeno-glucosaminoglicano. [52]
El primer informe sobre la angiogénesis se remonta al libro Tratado sobre la sangre, la inflamación y las heridas de bala publicado en 1794, donde se recopilaron los resultados de la investigación del anatomista escocés John Hunter . En su estudio, Hunter observó el proceso de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos en conejos. Sin embargo, no acuñó el término "angiogénesis", que ahora es ampliamente utilizado por los estudiosos. Hunter también atribuyó erróneamente el proceso de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos al efecto de un principio vital innato dentro de la sangre. Se cree que el término "angiogénesis" no surgió hasta el siglo XX. El inicio de la investigación moderna sobre la angiogénesis está marcado por el informe de Judah Folkman sobre el papel fundamental de la angiogénesis en el crecimiento tumoral. [8] [53] [54]
La cuantificación de parámetros de vasculatura, como la densidad microvascular, tiene varias complicaciones debido a la tinción preferencial o la representación limitada de los tejidos mediante secciones histológicas. Investigaciones recientes han demostrado una reconstrucción tridimensional completa de la estructura vascular del tumor y la cuantificación de las estructuras de los vasos en tumores completos en modelos animales. [55]
{{cite book}}: Mantenimiento CS1: DOI inactivo a partir de enero de 2024 ( enlace )