La α-Bungarotoxina es una de las bungarotoxinas , componentes del veneno de la elápida serpiente krait anillada taiwanesa ( Bungarus multicinctus ). Es un tipo de α-neurotoxina , una proteína neurotóxica que se sabe que se une competitivamente y de manera relativamente irreversible al receptor nicotínico de acetilcolina que se encuentra en la unión neuromuscular , causando parálisis , insuficiencia respiratoria y muerte en la víctima. [2] También se ha demostrado que desempeña un papel antagónico en la unión del receptor nicotínico de acetilcolina α7 en el cerebro y, como tal, tiene numerosas aplicaciones en la investigación de neurociencia.
Las bungarotoxinas son un grupo de toxinas que están estrechamente relacionadas con las proteínas neurotóxicas predominantemente presentes en el veneno de los kraits . Estas toxinas están directamente relacionadas con la superfamilia de toxinas de los tres dedos . Entre ellas destaca la α-bungarotoxina (α-BTX), siendo una toxina peptídica producida por la serpiente krait anillada taiwanesa elápida, también conocida como krait de muchas bandas o krait taiwanesa o china. [3]
La serpiente krait de la familia de bandas taiwanesas elápidas ( Bungarus multicinctus ) es parte de la familia de serpientes elápidas . El veneno de krait, como la mayoría de los venenos de serpientes, implica una combinación de proteínas que juntas conducen a una notable variedad de consecuencias neurológicas. La familia de serpientes Elapid es conocida por su potente veneno α-neurotóxico, que tiene un mecanismo de acción postsináptico. [ cita necesaria ] Estas neurotoxinas afectan principalmente el sistema nervioso , bloqueando la transmisión del impulso nervioso, [4] provocando parálisis y potencialmente la muerte si no se tratan. [5] [6]
La primera vez que se describió el krait de muchas bandas fue en 1861 por el científico Edward Blyth. Se caracterizaba por su distintivo patrón de bandas blancas y negras a lo largo de su cuerpo, con una longitud máxima de 1,85 m. Esta especie muy venenosa se encuentra en el centro y sur de China y el sudeste asiático. Su veneno contiene diversas neurotoxinas , siendo la α-BTX una de ellas. Según investigaciones posteriores sobre su mecanismo de acción, la α-bungarotoxina se une irreversiblemente al receptor nicotínico de acetilcolina postsináptico (nAChR) en la unión neuromuscular . De esta forma, inhibe competitivamente la acción de la acetilcolina , provocando insuficiencia respiratoria , parálisis e incluso la muerte. [6] [7] [8]
En el sur y sudeste de Asia, el envenenamiento por la picadura del krait de muchas bandas es una afección médica común y potencialmente mortal si no se trata a tiempo. Tras la mordedura de serpiente , el veneno se inyecta en los tejidos de la víctima. Comienza a difundirse y extenderse por los tejidos circundantes a través del torrente sanguíneo . Una vez que el veneno está en el sistema circulatorio , puede llegar a los órganos y tejidos diana. En este caso, la α-bungarotoxina se dirige específicamente al sistema nervioso , interfiriendo con la transmisión del impulso nervioso. Sin embargo, las picaduras de krait suelen producirse por la noche y no muestran ningún síntoma local , por lo que las víctimas no son conscientes de la picadura. Esto retrasa la recepción de atención médica , lo que lo convierte en la principal causa de mortalidad asociada con el envenenamiento por krait . [9] [10]
El objetivo principal de las neurotoxinas es la unión neuromuscular de los músculos esqueléticos , donde la terminal nerviosa motora y el receptor nicotínico de acetilcolina son los principales sitios objetivo. [11] Su efecto neurotóxico a menudo se conoce como neurotoxicidad resistente . Esto se debe al daño causado a las terminales nerviosas que conduce al agotamiento de la acetilcolina en la unión neuromuscular. La regeneración de las sinapsis puede tardar días, lo que prolonga el proceso de parálisis y recuperación de la víctima. [12] Además, la gravedad de la parálisis varía desde leve hasta potencialmente mortal dependiendo del grado de envenenamiento, su composición y la intervención terapéutica temprana. [13]
La terapia antiveneno es el tratamiento estándar actual para el envenenamiento por serpientes. En China se produce el antiveneno monovalente Bungarus multicinctus (BMMAV) y, en Taiwán, el antiveneno neurobivalente (NBAV). Ambos antivenenos son inmunorreactivos a las neurotoxinas que se encuentran en el veneno, incluida la α-BTX, que neutraliza la letalidad del veneno . BMMAV está diseñado específicamente para neutralizar el veneno del Bungarus multicinctus , por lo que es más eficaz en comparación con NBAV. Por otro lado, NBAV se dirige al veneno de múltiples especies de serpientes que producen efectos neurotóxicos, incluida la Bungarus multicinctus. El uso de BMMAV o NBAV puede diferir según la disponibilidad , los protocolos regionales y la serpiente venenosa específica que esté presente en el área. [12]
La α-Bungarotoxina consiste en una única cadena polipeptídica de 8 kDa que contiene 74 residuos de aminoácidos . Esta cadena polipeptídica está entrecruzada por cinco puentes disulfuro , clasificando a la α-bungarotoxina como una α-neurotoxina de tipo II dentro de la familia de las toxinas de tres dedos . Estos puentes disulfuro se forman entre residuos de cisteína específicos y son importantes para la estabilidad y función de la toxina. Además, la α-bungarotoxina contiene diez residuos de media cisteína por molécula. Las disposiciones específicas de los puentes disulfuro formados por estos residuos de cisteína dan como resultado la estructura de 11 anillos dentro de la molécula de toxina. Esta estructura de 11 anillos es particularmente esencial para las interacciones de la toxina con los receptores objetivo y la modulación de la neurotransmisión en la unión neuromuscular . [14] [15] [16]
La secuencia de aminoácidos de la α-bungarotoxina contiene una alta frecuencia de homodipéptidos, con diez pares presentes donde los dipéptidos de serina y prolina aparecen dos veces en la secuencia. El sitio activo de la toxina está ubicado en la región desde la posición 24 a la posición 45 dentro de la secuencia. Hay algunos aminoácidos clave que se encuentran comúnmente en esta región que incluyen cisteína , arginina , glicina , lisina y valina . Como se mencionó anteriormente, la cisteína es crucial para la formación de puentes disulfuro en las proteínas. La arginina y la lisina pueden participar en interacciones con moléculas o residuos cargados negativamente, por lo que pueden desempeñar un papel en la unión a receptores o sustratos específicos. La glicina puede contribuir a la flexibilidad y la dinámica conformacional de la α-bungarotoxina. Por último, el residuo de valina puede ayudar a mantener el núcleo hidrofóbico de la toxina. [15]
Al igual que otras α-neurotoxinas dentro de la familia de las toxinas de tres dedos, la α-bungarotoxina exhibe una estructura terciaria que se caracteriza por tres bucles de "dedos" salientes, una cola C-terminal y un pequeño núcleo globular estabilizado por cuatro enlaces disulfuro . En particular, está presente un enlace disulfuro adicional en el segundo bucle, lo que facilita una unión adecuada mediante la movilidad de las puntas de los dedos I y II. Además, los enlaces de hidrógeno contribuyen a la formación de una lámina β antiparalela , manteniendo la orientación paralela del segundo y tercer bucle. La integridad estructural de la toxina de tres dedos se preserva mediante cuatro de los puentes disulfuro, mientras que el quinto puente, ubicado en la punta del segundo bucle, se puede reducir sin comprometer la toxicidad.
La cadena polipeptídica de la α-bungarotoxina muestra una homología de secuencia significativa con otras neurotoxinas de los venenos de cobras y serpientes marinas , particularmente con la toxina α de Naja nivea . Al comparar la α-bungarotoxina con estas toxinas homólogas de los venenos de cobra y serpiente marina, se reveló que existe un alto grado de conservación en ciertos residuos. Por ejemplo, hay 18 residuos constantes, que incluyen las ocho semicisteínas, que se observan en todas las secuencias de toxinas. Por tanto, la α-bungarotoxina comparte motivos estructurales comunes con otras toxinas de la familia de los tres dedos. Por ejemplo, la toxina α-cobra , la erabutoxina A [17] y la candoxina [18] contienen tres bucles adyacentes que surgen de un núcleo globular, pequeño e hidrofóbico que está entrecruzado por cuatro puentes disulfuro conservados. Esta conservación sugiere la presencia de elementos funcionales esenciales que son compartidos entre estas neurotoxinas . [15] [16]
Por último, la abundancia de enlaces disulfuro y la limitada estructura secundaria que se observa en la α-bungarotoxina explica su excepcional estabilidad, que la hace resistente a la desnaturalización incluso en condiciones extremas como la ebullición y la exposición a ácidos fuertes .
Debido a su estructura muy grande y compleja, sintetizar α-bungarotoxina ha representado un gran desafío para los químicos sintéticos. [16] Un estudio realizado por O. Brun et al . propuso un mecanismo para la síntesis química de esta neurotoxina . [19] Se trata de una estrategia que utiliza fragmentos de péptidos y ligación química nativa (NCL). Debido a su longitud, no es posible sintetizar un péptido lineal completo mediante la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS), por lo que la síntesis se realizó eligiendo tres fragmentos de péptidos que pueden someterse a la ligación química nativa. Este método produce un enlace peptídico nativo entre dos fragmentos al hacer reaccionar tioéster (C-terminal) con cisteína (N-terminal). [20] La estrategia de síntesis empleada fue desde el extremo C hacia el extremo N. En primer lugar, los fragmentos peptídicos más cortos se sintetizan mediante SPPS automatizado. Los dos primeros péptidos tienen un punto de ligadura Trp-Cys, mientras que la ligación con el último fragmento se produce en un punto de ligadura Gly-Cys. Además, en este estudio, se introdujo una funcionalidad alquino en el extremo N de la cadena peptídica. Esto permite la conjugación de diferentes moléculas como los fluoróforos mediante reacciones bioortogonales . Al marcar con fluorescencia el péptido sintetizado químicamente, se demostró que tiene el mismo efecto y funcionalidad sobre los receptores nicotínicos que la α-bungarotoxina natural. [19]
Debido a la difícil síntesis química de la neurotoxina, la mayoría de los estudios se realizaron utilizando una forma purificada. Para investigar los efectos de la α-bungarotoxina, es necesario aislar la toxina del veneno de la serpiente elápida. La purificación del polipéptido se realiza mediante cromatografía en columna . En primer lugar, el veneno se disuelve en tampón de acetato de amonio y luego se carga en la columna CM-Sephadex. La elución del compuesto se realiza en dos pasos diferentes utilizando un tampón de acetato de amonio a un caudal de 35 nl/h. Los pasos implican el uso de dos gradientes lineales de tampones mientras se aumenta el pH. [21]
La α-Bungarotoxina es un péptido, por lo que sigue la vía de síntesis de proteínas, que implica transcripción y traducción. Los genes específicos que codifican la proteína se transcriben en ARNm, que luego se traduce a través de los ribosomas, lo que conduce a la síntesis del prepropéptido. Por último, se producen modificaciones y plegamientos postraduccionales. El péptido maduro se almacena en la glándula venenosa hasta el envenenamiento cuando se libera.
El veneno de las serpientes contiene numerosas proteínas y toxinas peptídicas que exhiben una alta afinidad y especificidad por una gama más amplia de receptores. [23] La α-Bungarotoxina es un antagonista del receptor nicotínico que se une irreversiblemente al receptor, inhibiendo la acción de la acetilcolina en las uniones neuromusculares. Los receptores nicotínicos son uno de los dos subtipos de receptores colinérgicos que responden al neurotransmisor acetilcolina . [24]
Los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) son canales iónicos activados por ligando , formando parte de los receptores ionotrópicos . Cuando se une un ligando a él, regula la excitabilidad controlando el flujo de iones durante el potencial de acción durante la neurotransmisión, principalmente mediante la activación de canales iónicos dependientes de voltaje tras la despolarización de la membrana plasmática. La despolarización es inducida por una entrada de cationes, principalmente de iones de sodio. Para la modulación general de la excitabilidad celular es necesaria una entrada de iones de sodio y una salida de iones de potasio al espacio intracelular. [25]
En el sistema nervioso central y periférico , la α-bungarotoxina actúa induciendo parálisis en los músculos esqueléticos al unirse a un subtipo de receptores nicotínicos α7. Las α-neurotoxinas se conocen como "toxinas curare-miméticas" debido a sus efectos similares a los del veneno de flecha tubocurarina . Una diferencia entre las α-neurotoxinas y los alcaloides del curare es que se unen de forma irreversible y reversible de forma específica. Las α-neurotoxinas bloquean la acción de la acetilcolina (ACh) en la membrana postsináptica al inhibir irreversiblemente el flujo de iones. [26]
De la misma familia de toxinas de Bungarotoxinas (BTX), se demostró que la κ-BTX actúa postsinápticamente sobre los receptores nicotínicos neuronales α3 y α4 con poco efecto sobre los nAChR musculares, a los que se dirige la α-BTX. Por el contrario, β- y γ-BTX actúan presinápticamente reduciendo la liberación de ACh. Es importante tener en cuenta que las neurotoxinas reciben nombres según el tipo de receptor al que se dirigen. [26]
Los receptores nicotínicos se componen de cinco subunidades cada uno y contienen dos sitios de unión para las neurotoxinas del veneno de serpiente.[20] El α7-nAChR es un homopentámero que consta de cinco subunidades α7 idénticas. Se sabe que el receptor α7 tiene una mayor permeabilidad al Ca2+ en comparación con otros receptores nicotínicos. Los cambios en el Ca2+ intracelular pueden activar vías celulares importantes como la vía STAT o la señalización NF-κB . [27]
La coherencia con los datos experimentales sobre la cantidad de toxina por receptor es evidente en la observación de que una sola molécula de toxina es adecuada para inhibir la apertura del canal. [28] Algunos estudios computacionales del mecanismo de inhibición utilizando dinámica de modo normal [29] sugieren que un movimiento similar a un giro causado por la unión de ACh puede ser responsable de la apertura de los poros y que este movimiento es inhibido por la unión de la toxina. [29] [30]
La siguiente sección describe la ADME (absorción, distribución, metabolismo y excreción) de la α-bungarotoxina. Es importante señalar que existe información limitada disponible sobre la farmacocinética de esta neurotoxina . Se necesita más investigación para poder comprender completamente el metabolismo de esta neurotoxina dentro del cuerpo.
Absorción : La α-bungarotoxina ingresa al cuerpo después del envenenamiento y pasa al torrente sanguíneo en el lugar de la picadura. A través del veneno ingresa al cuerpo una mezcla de proteínas y diferentes moléculas.
Distribución : Una vez en el torrente sanguíneo, la α-bungarotoxina circula por todo el cuerpo. Su distribución puede verse influenciada por factores como el flujo sanguíneo, la permeabilidad tisular y la presencia de proteínas de unión. Además, sabiendo que se une a los nAChR, se puede predecir dónde estaría presente la neurotoxina: uniones neuromusculares , ganglios autónomos , nervios periféricos y médula suprarrenal . Una de las localizaciones principales sería también el sistema nervioso central (SNC), incluido el cerebro . Regiones específicas como el hipocampo , la corteza y los ganglios basales contienen estos receptores. [31]
Metabolismo : las vías metabólicas de estas neurotoxinas aún no se han comprendido completamente; sin embargo, se cree que se metabolizan en el hígado . Investigar el metabolismo del veneno es un desafío debido a los múltiples componentes presentes en él. Las toxinas que no están unidas pueden sufrir eliminación mediante opsonización por el sistema reticuloendotelial, que afecta principalmente al hígado y los riñones, o pueden sufrir degradación mediante internalización celular facilitada por los lisosomas . [32]
Excreción : Es común que las proteínas y péptidos se excreten por vía hepática y renal . En el hígado, los aminoácidos presentes sufren una transaminación. De esta forma los aminoácidos se convierten en amoníaco y cetoácidos. Por último, estas sustancias se excretan por vía renal. [33]
Sin embargo, es importante tener en cuenta que la α-bungarotoxina se une irreversiblemente a los receptores, lo que daría como resultado una tasa metabólica y de excreción muy baja, ya que la mayor parte de la neurotoxina estaría presente en los sitios receptores. [24]
La α-bungarotoxina se encuentra entre las toxinas de serpientes mejor caracterizadas, con su alta afinidad y especificidad por los receptores nicotínicos de acetilcolina. Es un antagonista competitivo del nAChR, donde bloquea de forma irreversible y competitiva el receptor en los sitios de unión de acetilcolina. [34] Se une a la subunidad α1 contenida en los nAChR musculares, así como a subconjuntos de nAChR neuronales como α7-α10. Además, se demostró que la α-bungarotoxina se une y bloquea un subconjunto de receptores GABA A donde las subunidades β3 se conectan entre sí. Con este conocimiento en mente, los investigadores pueden utilizar la α-bungarotoxina como herramienta experimental para estudiar las propiedades de los receptores colinérgicos . [26]
Además, al conocer los sitios de unión diferentes y específicos , los investigadores pueden visualizar y rastrear la localización y la dinámica del receptor dentro de las células. Se ha demostrado que esta técnica es sencilla con el uso de un mimotopo de 13 aminoácidos (WRYYESSLEPYPD) [35] , que forma un sitio de unión de α-bungarotoxina de alta afinidad con los receptores. [36]
Se ha utilizado ampliamente en investigaciones para estudiar la localización y distribución de estos receptores. A través de técnicas como la conjugación de fluoróforos o enzimas seguidas de microscopía o tinción inmunohistoquímica , respectivamente, se podrían proporcionar conocimientos sobre la compleja organización y función del sistema nervioso. Con las técnicas mencionadas, los investigadores pueden trabajar en el desarrollo de un fármaco y comprender el mecanismo de la enfermedad. Pueden identificar posibles objetivos farmacológicos regulando selectivamente la actividad de ciertos receptores. Por lo tanto, al observar cómo se comportan los receptores cuando están en contacto con la α-bungarotoxina en comparación con cuando no hay toxina, los investigadores pueden estudiar el mecanismo de la toxina.
La α-Bungarotoxina está disponible para su compra en múltiples empresas biotecnológicas, como Sigma-Aldrich o Biotium. Los investigadores pueden comprarlo allí para realizar una variedad de investigaciones sobre la toxina.
En cuanto a la biodisponibilidad , los investigadores realizaron un estudio en la médula espinal durante el desarrollo embrionario en embriones de polluelos. Descubrieron que la unión de la α-bungarotoxina era específica y saturable dentro del rango de concentración de 1 a 34 mM. Es decir, a medida que aumentaba la concentración de α-bungarotoxina, el sitio de unión se hacía cada vez más limitado. Alcanzando el número máximo a 34 mM. Una vez que ya no hubo sitios de unión disponibles, la nicotina se comportó de manera competitiva y expulsó la α-bungarotoxina ya unida. Otra cosa que encontraron fue que la constante de disociación (Kd) era de 8,0 nM, una concentración de α-bungarotoxina en la que la mitad del sitio de unión estaba ocupada. Además, se encontró que la capacidad de unión máxima (Bmax) era 106 +/- 12 fmol/mg, el número máximo de sitios de unión disponibles por unidad de proteína. Finalmente, la α-bungarotoxina administrada exógenamente demostró penetrar el tejido de la médula espinal y unirse a sus sitios específicos después de 7 días. [37]
La eficacia de la α-bungarotoxina se puede evaluar analizando su afinidad de unión . Afecta la forma en que se transmite la señal en la unión neuromuscular esquelética al unirse a los nAChR postsinápticos con alta afinidad. La afinidad de la toxina por este receptor se mide con una constante de disociación (Kd), que oscila entre 10-11 y 10-9 M. Además de unirse a las uniones neuromusculares esqueléticas, puede unirse específicamente a diferentes subconjuntos neuronales, como el α7. . Esta afinidad de unión es sólo ligeramente menor con Kd medido en el rango de 10-9 a 10-8 M. [38]
También se puede analizar mediante la inhibición del receptor, inhibiendo específicamente la acción de la acetilcolina sobre los nAChR. Un estudio encontró que 5 miligramos/ml de la toxina bloquean completamente el potencial de la placa terminal y la sensibilidad extrauncional a la acetilcolina de las fibras superficiales, en aproximadamente 35 minutos en músculos normales y crónicamente denervados. Realizaron un período de lavado de 6,5 horas, que resultó en una recuperación parcial del potencial de la placa terminal, con una amplitud de 0,72 +/- 0,033 mV en músculos normales. En los músculos denervados se observó una recuperación parcial de la sensibilidad a la acetilholina, con una amplitud de 41,02 +/- 3,95 mV/nC en comparación con una amplitud de control de 1215 +/- 197 mV/nC. Este mismo estudio también encontró que una pequeña población de receptores de acetilcolina (1% de la población total) reacciona con la α-bungarotoxina de manera reversible. Con la toxina, se utilizó carbamilcolina 20 microM o decametonio simultáneamente en músculos normales. Una vez que se eliminaron la toxina y el medicamento, el músculo restableció la contracción para controlar los niveles en 2 horas. [39]
La susceptibilidad de diferentes especies al veneno de una serpiente krait, que contiene alfa-bungarotoxina, varía según su composición genética . La α-Bungarotoxina se une mejor a la subunidad alfa de acetilholina que contiene residuos de aminoácidos aromáticos en las posiciones 187 y 189, por ejemplo, musarañas, gatos y ratones. En especies como los humanos y los erizos, que tienen residuos de aminoácidos no aromáticos en las mismas posiciones, tienen una afinidad de unión disminuida de la α-bungarotoxina. Finalmente, las serpientes y las mangostas tienen sustituciones de aminoácidos específicas en las subunidades alfa 187, 189 y 194, lo que hace que la unión de la toxina sea inexistente. [40]
En los seres humanos, la exposición a la α-bungarotoxina puede provocar diversos síntomas, como dolor de cabeza, mareos, pérdida del conocimiento, alteraciones visuales y del habla y, ocasionalmente, convulsiones. Inicio de dolor abdominal intenso y parálisis muscular en 10 horas y puede durar 4 días. Finalmente, la parálisis respiratoria puede provocar la muerte. [41] Además, también puede provocar síntomas leves como dermatitis y reacciones alérgicas, o síntomas más fuertes como coagulación sanguínea , coagulación intravascular diseminada , lesión tisular y hemorragia . [42]
En animales se han realizado estudios para analizar el efecto de la α-bungarotoxina en animales. Un estudio demostró que esta toxina causa parálisis en pollos al bloquear la transmisión neuromuscular en la placa terminal motora. Esto provocó debilidad muscular y, en última instancia, parálisis. [43]
En la antigüedad, estos venenos ya estaban extendidos por todo el mundo. Luego, la medicina popular utilizó compuestos inhibidores bioactivos y de origen vegetal para tratar las mordeduras de animales venenosos como serpientes y escorpiones. Este enfoque resultó exitoso en la prevención del envenenamiento , mitigando efectivamente los efectos nocivos del veneno en las víctimas. Hoy en día, el tratamiento para las picaduras de krait implica un antiveneno , que puede provocar diversos efectos secundarios indeseables y potencialmente mortales, como náuseas, urticaria , hipotensión , cianosis y reacciones alérgicas graves. [42]
La α-Bungarotoxina pertenece a un grupo de bungarotoxinas, que son un tipo de proteínas venenosas que se encuentran en el veneno de los kraits, una de las seis serpientes más mortíferas de Asia. Su picadura puede provocar parálisis respiratoria y la muerte. [42] La α-Bungarotoxina se une de manera irreversible y competitiva a los receptores de acetilcolina musculares y neuronales. La parálisis se produce debido al bloqueo de la transmisión neuromuscular en el sitio postsináptico.
Los valores de LD 50 , que representan la dosis letal necesaria para causar la muerte en un 50%, se estudiaron en ratones utilizando diferentes vías de administración. La administración subcutánea mostró que se necesitaban 0,108 mg/kg para matar al 50% de los ratones. La administración intravenosa dio como resultado un valor de LD50 ligeramente superior de 0,113 mg/kg. Sin embargo, cuando se administró por vía intraperitoneal , el valor LD50 fue de 0,08 mg/kg. Estos valores pueden ayudar en la evaluación del riesgo de la toxina. [44]