Etiqueta de proteína

Péptido artificial unido a proteína con fines de marcado

Las etiquetas de proteínas son secuencias de péptidos injertadas genéticamente en una proteína recombinante . Las etiquetas se adhieren a las proteínas con diversos fines. Se pueden agregar a cualquiera de los extremos de la proteína objetivo, por lo que son específicas del extremo C o N , o son específicas tanto del extremo C como del N. Algunas etiquetas también se insertan en sitios dentro de la proteína de interés; se conocen como etiquetas internas. ^[1]

Las etiquetas de afinidad se añaden a las proteínas para que puedan purificarse a partir de su fuente biológica cruda mediante una técnica de afinidad. Las etiquetas de afinidad incluyen la proteína de unión a quitina (CBP), la proteína de unión a maltosa (MBP), la etiqueta Strep ^[2] y la glutatión-S-transferasa (GST). La etiqueta poli(His) es una etiqueta de proteína ampliamente utilizada, que se une a matrices que contienen iones metálicos inmovilizados.

Las etiquetas de solubilización se utilizan, especialmente para proteínas recombinantes expresadas en especies como E. coli , para ayudar al plegamiento adecuado de las proteínas y evitar que se agreguen en cuerpos de inclusión . Estas etiquetas incluyen tiorredoxina (TRX) y poli(NANP). Algunas etiquetas de afinidad tienen una doble función como agente de solubilización, como MBP y GST.

Las etiquetas cromatográficas se utilizan para alterar las propiedades cromatográficas de la proteína y lograr una resolución diferente en una técnica de separación particular. A menudo, consisten en aminoácidos polianiónicos, como la etiqueta FLAG o la etiqueta de poliglutamato. ^[3]

Las etiquetas de epítopos son secuencias peptídicas cortas que se eligen porque los anticuerpos de alta afinidad se pueden producir de manera confiable en muchas especies diferentes. Por lo general, se derivan de genes virales, lo que explica su alta inmunorreactividad. Las etiquetas de epítopos incluyen ALFA-tag, V5-tag, Myc-tag , HA-tag , Spot-tag , T7-tag y NE-tag . Estas etiquetas son particularmente útiles para experimentos de inmunotransferencia , inmunofluorescencia e inmunoprecipitación , aunque también se utilizan en la purificación de anticuerpos.

Las etiquetas de fluorescencia se utilizan para proporcionar una lectura visual de una proteína. Las etiquetas de fluorescencia más utilizadas son la proteína fluorescente verde (GFP) y sus variantes. ^[4] Las aplicaciones más avanzadas de la GFP incluyen su uso como un indicador de plegamiento (fluorescente si está plegada, incolora si no lo está).

Las etiquetas de proteínas pueden permitir una modificación enzimática específica (como la biotinilación por la ligasa de biotina) o una modificación química (como el acoplamiento a otras proteínas a través de SpyCatcher o la reacción con FlAsH-EDT2 para la obtención de imágenes de fluorescencia). A menudo, las etiquetas se combinan para conectar las proteínas a varios otros componentes. Sin embargo, con la adición de cada etiqueta viene el riesgo de que la función nativa de la proteína pueda verse comprometida por interacciones con la etiqueta. Por lo tanto, después de la purificación, las etiquetas a veces se eliminan mediante proteólisis específica (por ejemplo, mediante la proteasa TEV , la trombina , el factor Xa o la enteropeptidasa ) o el empalme de inteína .

Lista de etiquetas de proteínas

(Ver Aminoácido proteinogénico#Propiedades químicas para los códigos de aminoácidos de la A a la Z)

Etiquetas de péptidos

• Etiqueta ALFA, una etiqueta peptídica helicoidal diseñada de novo (SRLEEELRRRLTE) para aplicaciones bioquímicas y de microscopía. La etiqueta es reconocida por un repertorio de anticuerpos de dominio único ^[5]
• AviTag, un péptido que permite la biotinilación por la enzima BirA y así la proteína puede ser aislada por estreptavidina (GLNDIFEAQKIEWHE)
• C-tag, un péptido que se une a un anticuerpo de camélido de dominio único desarrollado a través de presentación de fagos (EPEA) ^{[6] [7]}
• Etiqueta de calmodulina, un péptido unido a la proteína calmodulina (KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL)
• i CapTag™ ( etiqueta de captura de inteína ), una etiqueta basada en péptidos que se autoelimina (MIKIATRKYLGKQNVYGIGVERDHNFALKNGFIAHN). La i CapTag™ se controla mediante cambios de pH (normalmente de pH 8,5 a pH 6,2). Por lo tanto, esta tecnología se puede adaptar a una amplia gama de tampones ajustados a los valores de pH objetivo de 8,5 y 6,2. La pureza esperada de las proteínas o péptidos objetivo está entre el 95 y el 99 %. La i CapTag™ contiene un componente patentado derivado de la inteína Nostoc punctiforme (Npu) . Esta etiqueta se utiliza para la purificación de proteínas recombinantes y sus fragmentos. Se puede utilizar en laboratorios de investigación y también está destinada a la purificación a gran escala durante el proceso de fabricación posterior. El complejo i CapTag™-proteína objetivo se puede expresar en una amplia gama de huéspedes de expresión ( por ejemplo, células CHO y E. coli ). No está destinado a mAb completamente expresados ^{​​[8] [9] [10]}
• etiqueta de poliglutamato, un péptido que se une de manera eficiente a la resina de intercambio aniónico como Mono-Q (EEEEEE) ^[3]
• etiqueta de poliarginina, un péptido que se une de manera eficiente a la resina de intercambio catiónico (de 5 a 9 R consecutivas)
• E-tag, un péptido reconocido por un anticuerpo (GAPVPYPDPLEPR)
• Etiqueta FLAG , un péptido reconocido por un anticuerpo (DYKDDDDK) ^[11]
• HA-tag , un péptido de la hemaglutinina reconocido por un anticuerpo (YPYDVPDYA) ^[12]
• Etiqueta His , 5-10 histidinas unidas por un quelato de níquel o cobalto (HHHHHH)
  • Las etiquetas Gly-His son variantes de etiqueta His N-terminal (por ejemplo, GHHHH, o GHHHHHH, o GSSHHHHHH) que aún se unen a cationes metálicos inmovilizados, pero también se pueden activar a través de azidogluconoilación para permitir aplicaciones de química de clic ^[13].
• Myc-tag , un péptido derivado de c- myc reconocido por un anticuerpo (EQKLISEEDL)
• NE-tag , un péptido sintético de 18 aminoácidos (TKENPRSNQEESYDDNES) reconocido por un anticuerpo monoclonal IgG1, que es útil en un amplio espectro de aplicaciones que incluyen transferencia Western, ELISA, citometría de flujo, inmunocitoquímica, inmunoprecipitación y purificación por afinidad de proteínas recombinantes ^[14]
• La etiqueta Rho1D4 hace referencia a los últimos 9 aminoácidos del extremo C intracelular de la rodopsina bovina (TETSQVAPA). Es una etiqueta muy específica que se puede utilizar para la purificación de proteínas de membrana .
• S-tag , un péptido derivado de la ribonucleasa A (KETAAAKFERQHMDS)
• Etiqueta SBP , un péptido que se une a la estreptavidina (MDEKTTGWRGGHVVEGLAGELEQLRARLEHHPQGQREP) ^[15]
• Softag 1, para expresión en mamíferos (SLAELLNAGLGGS)
• Softag 3, para expresión procariota (TQDPSRVG)
• Spot-tag , un péptido reconocido por un nanocuerpo (PDRVRAVSHWSS) para inmunoprecipitación, purificación por afinidad, inmunofluorescencia y microscopía de súper resolución
• Strep-tag , un péptido que se une a la estreptavidina o a la estreptavidina modificada llamada estreptactina (Strep-tag II: WSHPQFEK) ^[2]
• Etiqueta T7, una etiqueta de epítopo derivada de la proteína principal de la cápside T7 del gen T7 (MASMTGGQQMG). Se utiliza en diferentes inmunoensayos, así como en la purificación por afinidad. Se utiliza principalmente ^[16]
• Etiqueta TC , una etiqueta de tetracisteína que es reconocida por los compuestos biarsenicales FlAsH y ReAsH (CCPGCC)
• Etiqueta de agradecimiento (EVHTNQDPLD)
• Etiqueta V5, un péptido reconocido por un anticuerpo (GKPIPNPLLGLDST) ^[17]
• Etiqueta VSV, un péptido reconocido por un anticuerpo (YTDIEMNRLGK)
• Etiqueta Xpress (DLYDDDDK), un péptido reconocido por un anticuerpo

Etiquetas peptídicas covalentes

• Isopeptag , un péptido que se une covalentemente a la proteína pilina-C (TDKDMTITFTNKKDAE) ^[18]
• SpyTag , un péptido que se une covalentemente a la proteína SpyCatcher (AHIVMVDAYKPTK) ^[19]
• SnoopTag, un péptido que se une covalentemente a la proteína SnoopCatcher (KLGDIEFIKVNK). ^[20] También se desarrolló una segunda generación, SnoopTagJr, para unirse a SnoopCatcher o DogTag (mediada por SnoopLigase) (KLGSIEFIKVNK) ^[21]
• DogTag, un péptido que se une covalentemente a DogCatcher (DIPATYEFTDGKHYITNEPIPPK), ^[22] y también puede unirse covalentemente a SnoopTagJr, mediado por SnoopLigase ^[21]
• SdyTag, un péptido que se une covalentemente a la proteína SdyCatcher (DPIVMIDNDKPIT). ^[23] SdyTag/SdyCatcher tiene una reactividad cruzada dependiente de la cinética con SpyTag/SpyCatcher.

Etiquetas de proteínas

• BCCP (proteína transportadora de carboxilo de biotina), un dominio proteico biotinilado por BirA que permite el reconocimiento por estreptavidina
• BromoTag, una versión mutada de "protuberancia y agujero" del segundo bromodominio de Brd4, Brd4-BD2 L387A, que puede ser unido de forma altamente selectiva por el degradador PROTAC específico de la etiqueta AGB1 para formar un complejo ternario entre la proteína "BromoTagged" y la ligasa E3 VHL, lo que lleva a la ubiquitinación de la proteína marcada y su posterior degradación proteasomal rápida y efectiva en las células. ^[24]
• FAST (etiqueta activadora de fluorescencia y de cambio de absorción), una proteína amarilla fotoactiva mutada (PYP) que se une de manera reversible a ligandos fluorogénicos cognados
• CL7-tag, una variante diseñada de Colicin E7 que tiene una fuerte afinidad de unión y especificidad para la proteína de inmunidad inmovilizada 7 (Im7). ^[25]
• Glutatión-S-transferasa -tag, una proteína que se une al glutatión inmovilizado
• Etiqueta de proteína fluorescente verde , ^[4] una proteína que es espontáneamente fluorescente y a la que pueden unirse nanocuerpos.
• HaloTag , una deshalogenasa de haloalcanos bacteriana mutada que se une covalentemente a los sustratos de haloalcanos
• SNAP-tag , una metiltransferasa de ADN eucariota mutada que se une covalentemente a los derivados de bencilguanina
• CLIP-tag , una metiltransferasa de ADN eucariota mutada que se une covalentemente a los derivados de bencilcitosina
• Etiqueta HUH , una proteína de unión a ADN monocatenario específica de secuencia que se une covalentemente a su secuencia objetivo
• Proteína de unión a maltosa -tag, una proteína que se une a la amilosa agarosa ^[26]
• Etiqueta nus
• Tiorredoxina -tag
• La etiqueta Fc , derivada del dominio Fc de inmunoglobulina, permite la dimerización y la solubilización. Puede utilizarse para la purificación en proteína A Sepharose.
• Etiquetas intrínsecamente desordenadas diseñadas que contienen aminoácidos que promueven el desorden (P, E, S, T, A, Q, G,...) ^[27]
• Dominio de reconocimiento de carbohidratos o etiqueta CRDSAT, una proteína que se une a la lactosa agarosa o sefarosa ^[28]

Otros

La etiqueta HiBiT fue desarrollada por científicos de Promega . Es una etiqueta peptídica de 11 aminoácidos y se puede fusionar con el extremo N o C o con ubicaciones internas de las proteínas. ^[29] Su pequeño tamaño permite una rápida incorporación de esta etiqueta a otras proteínas mediante la tecnología CRISPR/Cas9. ^[29]

Aplicaciones

• Purificación por afinidad
• Matriz de proteínas
• Etiquetado de proteínas TimeSTAMP
• Western blot

Referencias

1. Mahmoudi Gomari, Mohammad; Saraygord-Afshari, Neda; Farsimadan, Marziye; Rostami, Neda; Aghamiri, Shahin; Farajollahi, Mohammad M. (diciembre de 2020). "Oportunidades y desafíos de las técnicas de purificación de proteínas asistidas por etiquetas: aplicaciones en la industria farmacéutica". Avances en biotecnología . 45 : 107653. doi : 10.1016/j.biotechadv.2020.107653. ISSN  0734-9750. PMID  33157154. S2CID  226276355.
2. Schmidt, Thomas GM; Koepke, Jürgen; Frank, Ronald; Skerra, Arne (1996). "Interacción molecular entre el péptido de afinidad Strep-tag y su diana cognada, la estreptavidina". Journal of Molecular Biology . 255 (5): 753–66. doi :10.1006/jmbi.1996.0061. PMID  8636976.
3. Fairhead M, Krndija D, Lowe ED, Howarth M (enero de 2014). "Emparejamiento plug-and-play mediante estreptavidinas divalentes definidas". Revista de biología molecular . 426 (1): 199–214. doi :10.1016/j.jmb.2013.09.016. PMC 4047826 . PMID  24056174. 
4. Zhang, Jin; Campbell, Robert; Ting, Alice; Tsien, Roger (2002). "Creación de nuevas sondas fluorescentes para biología celular". Nat Rev Mol Cell Biol . 3 (12): 906–918. doi :10.1038/nrm976. PMID  12461557. S2CID  11588100.
5. Götzke, Hansjörg; Kilisch, Markus; Martínez-Carranza, Markel; Sograte-Idrissi, Shama; Rajavel, Abirami; Schlichthaerle, Thomas; Engels, Niklas; Jungmann, Ralf; Stenmark, Pal; Opazo, Felipe; Frey, Steffen (2019). "La etiqueta ALFA es una herramienta muy versátil para aplicaciones de biociencia basadas en nanocuerpos". Comunicaciones de la naturaleza . 10 (1): 4403. Código bibliográfico : 2019NatCo..10.4403G. doi :10.1038/s41467-019-12301-7. PMC 6764986 . PMID  31562305. 
6. De Genst, Erwin J.; Guilliams, Tim; Wellens, Broma; O'Day, Elizabeth M.; Waudby, Christopher A.; Meehan, Sara; Dumoulin, Mireille; Hsu, Shang-Te Danny; Cremades, Nunilo; Verschueren, Koen HG; Perdón, Els; Wyns, Loda; Steyaert, enero; Cristodoulou, John; Dobson, Christopher M. (septiembre de 2010). "Estructura y propiedades de un complejo de α-sinucleína y un anticuerpo camélido de dominio único" (PDF) . Revista de biología molecular . 402 (2): 326–343. doi :10.1016/j.jmb.2010.07.001. PMID  20620148.
7. "Matriz de afinidad de etiquetas C CaptureSelect - Thermo Fisher Scientific". www.thermofisher.com .
8. Cooper, Merideth A.; Taris, Joseph E.; Shi, Changhua; Wood, David W. (2018). "Un método conveniente de etiqueta de inteína dividida para la purificación de proteínas objetivo sin etiqueta". Protocolos actuales en ciencia de proteínas . 91 (1): 5.29.1–5.29.23. doi :10.1002/cpps.46. ISSN  1934-3655. PMID  29516483. S2CID  3749506.
9. Prabhala, Sai Vivek; Gierach, Izabela; Wood, David W. (2022). "La evolución de los métodos de afinidad basados ​​en inteínas reflejada en 30 años de historia de las patentes". Frontiers in Molecular Biosciences . 9 : 857566. doi : 10.3389/fmolb.2022.857566 . ISSN  2296-889X. PMC 9033041 . PMID  35463948. 
10. "Tecnología iCapTag™: ciencia de captura de proteínas". www.proteincapturescience.com .
11. Einhauer, A.; Jungbauer, A. (2001). "El péptido FLAG™, una etiqueta de fusión versátil para la purificación de proteínas recombinantes". Journal of Biochemical and Biophysical Methods . 49 (1–3): 455–65. doi :10.1016/S0165-022X(01)00213-5. PMID  11694294.
12. Prakriya, Murali; Feske, Stefan; Gwack, Yousang; Srikanth, Sonal; Rao, Anjana; Hogan, Patrick G. (2006). "Orai1 es una subunidad esencial del poro del canal CRAC". Nature . 443 (7108): 230–3. Bibcode :2006Natur.443..230P. doi :10.1038/nature05122. PMID  16921383. S2CID  4310221.
13. Bruna, Karl D.; Liekniņa, Ilva; Sutov, Grigorij; Morris, Alejandro R.; Jovicevic, Dejana; Kalniņš, Gints; Kazaks, Andris; Kluga, Rihards; Kastaljana, Sabine; Zajakina, Anna; Jansons, Juris; Skrastiņa, Dace; Spunde, Karina; Cohen, Alejandro A.; Bjorkman, Pamela J.; Morris, Howard R.; Suna, Edgars; Tārs, Kaspars (16 de noviembre de 2021). "Modificación N-terminal de proteínas etiquetadas con Gly-His con azidogluconolactona". ChemBioChem . 22 (22): 3199–3207. doi :10.1002/cbic.202100381. Revista  de Biología  Molecular y Genética  .
14. Ho, Philip WL.; Tse, Zero HM.; Liu, HF.; Lu, S.; Ho, Jessica WM.; Kung, Michelle HW.; Ramsden, David B.; Ho, SL. (2013). "Evaluación de la actividad estrogénica celular basada en la reducción mediada por el receptor de estrógeno de la expresión de la catecol-O-metiltransferasa (COMT) en forma soluble en un sistema basado en ELISA". PLOS ONE . ​​8 (9): e74065. Bibcode :2013PLoSO...874065H. doi : 10.1371/journal.pone.0074065 . PMC 3765251 . PMID  24040167. 
15. Keefe, Anthony D.; Wilson, David S.; Seelig, Burckhard; Szostak, Jack W. (2001). "Purificación en un solo paso de proteínas recombinantes utilizando un péptido de unión a estreptavidina con afinidad nanomolar, el SBP-Tag". Expresión y purificación de proteínas . 23 (3): 440–6. doi :10.1006/prep.2001.1515. PMID  11722181.
16. "Etiquetas de epítopos y proteínas de fusión – antibodies-online". www.antibodies-online.com .
17. McNutt, Markey C.; Lagace, Thomas A.; Horton, Jay D. (2007). "La actividad catalítica no es necesaria para que la PCSK9 secretada reduzca los receptores de lipoproteínas de baja densidad en las células HepG2". Journal of Biological Chemistry . 282 (29): 20799–803. doi : 10.1074/jbc.C700095200 . PMID  17537735.
18. Zakeri, Bijan; Howarth, Mark (2010). "Formación espontánea de enlaces amida intermoleculares entre cadenas laterales para la orientación irreversible de péptidos". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 132 (13): 4526–7. doi :10.1021/ja910795a. PMID  20235501.
19. Zakeri, Bijan; Fierer, Jacob O.; Celik, Emrah; Chittock, Emily C.; Schwarz-Linek, Ulrich; Moy, Vincent T.; Howarth, Mark (2012). "Etiqueta peptídica que forma un enlace covalente rápido con una proteína, mediante la ingeniería de una adhesina bacteriana". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 109 (12): E690–7. Bibcode :2012PNAS..109E.690Z. doi : 10.1073/pnas.1115485109 . PMC 3311370 . PMID  22366317. 
20. Veggiani, Gianluca; Nakamura, Tomohiko; Brenner, Michael; Gayet, Raphael; Yan, Jun; Robinson, Carol; Howarth, Mark (2016). "Poliproteínas programables construidas utilizando superpegamentos de péptidos gemelos". Actas de la Academia Nacional de Ciencias . 113 (5): 1202–7. Bibcode :2016PNAS..113.1202V. doi : 10.1073/pnas.1519214113 . PMC 4747704 . PMID  26787909. 
21. Buldun, Can M.; Jean, Jisoo X.; Bedford, Michael R.; Howarth, Mark (14 de febrero de 2018). "SnoopLigase cataliza el bloqueo péptido-péptido y permite el aislamiento de conjugados en fase sólida". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 140 (8): 3008–3018. doi :10.1021/jacs.7b13237. PMID  29402082. S2CID  207189163.
22. Keeble, Anthony H.; Yadav, Vikash K.; Ferla, Matteo P.; Bauer, Claudia C.; Chuntharpursat-Bon, Eulashini; Huang, Jin; Bon, Robin S.; Howarth, Mark (julio de 2021). "DogCatcher permite la ligación proteína-proteína sin necesidad de bucles". Biología química celular . 29 (2): 339–350.e10. doi : 10.1016/j.chembiol.2021.07.005 . ISSN  2451-9456. PMC 8878318 . PMID  34324879. 
23. Tan, Lee Ling; Hoon, Shawn S.; Wong, Fong T.; Ahmed, S. Ashraf (26 de octubre de 2016). "Interacciones cinéticas controladas Tag-Catcher para el ensamblaje covalente dirigido de proteínas". PLOS ONE . ​​11 (10): e0165074. Bibcode :2016PLoSO..1165074T. doi : 10.1371/journal.pone.0165074 . PMC 5082641 . PMID  27783674. 
24. Ciulli, Bond; Alessi, Craigon (octubre de 2021). "Desarrollo de BromoTag: un sistema PROTAC de "protuberancias y agujeros" para inducir una degradación potente, rápida y selectiva de proteínas diana marcadas". J Med Chem . 64 (20): 15477–15502. doi : 10.1021/acs.jmedchem.1c01532 . PMC 8558867 . PMID  34652918. 
25. Chow, Louise T.; Vassylyev, Dmitry G. (2022). "Aplicación de un nuevo sistema de afinidad CL7/Im7 en la purificación de proteínas complejas y farmacéuticas". Cromatografía de afinidad . Métodos en biología molecular. Vol. 2466. págs. 61–82. doi :10.1007/978-1-0716-2176-9_5. ISBN 978-1-0716-2175-2.
26. Bedouelle, Hugues; Duplay, Pascale (febrero de 1988). "Producción en Escherichia coli y purificación en un solo paso de proteínas híbridas bifuncionales que se unen a la maltosa. Exportación de la polimerasa Klenow al espacio periplásmico". Eur J Biochem . 171 (3): 541–549. doi : 10.1111/j.1432-1033.1988.tb13823.x . PMID  3278900.
27. Minde, David P; Halff, Els F; Tans, Sander (2013). "Diseñando el desorden: cuentos de colas inesperadas". Proteínas intrínsecamente desordenadas . 1 (1): 5–15. doi :10.4161/idp.26790. PMC 5424805 . PMID  28516025. 
28. Kriznik, Alejandro; Yéléhé-Okouma, Mélissa; Lec, Jean-Christophe; Groshenry, Guillaume; Le Cordier, Hélène; Charrón, Christophe; Quinternet, Marc; Mazón, Hortensia; Talfournier, François; Boschi-Müller, Sandrine; Jouzeau, Jean-Yves; Reboul, Pascal (octubre de 2018). "CRDSAT generado por pCARGHO: un nuevo método eficiente de etiqueta de afinidad basado en lectina para la purificación de proteínas segura, simple y de bajo costo". Biotecnología J. 14 (4): 1800214. doi : 10.1002/biot.201800214. PMID  30298550. S2CID  52942568.
29. Schwinn, Marie K.; Machleidt, Thomas; Zimmerman, Kris; Eggers, Christopher T.; Dixon, Andrew S.; Hurst, Robin; Hall, Mary P.; Encell, Lance P.; Binkowski, Brock F.; Wood, Keith V. (16 de febrero de 2018). "Etiquetado de proteínas endógenas mediado por CRISPR con un péptido luminiscente". ACS Chemical Biology . 13 (2): 467–474. doi : 10.1021/acschembio.7b00549 . ISSN  1554-8929. PMID  28892606.