La cromatografía de afinidad es un método para separar una biomolécula de una mezcla, basado en una interacción de unión macromolecular altamente específica entre la biomolécula y otra sustancia. El tipo específico de interacción de unión depende de la biomolécula de interés; las interacciones de unión de antígeno y anticuerpo , enzima y sustrato , receptor y ligando , o proteína y ácido nucleico [1] se explotan con frecuencia para el aislamiento de varias biomoléculas. La cromatografía de afinidad es útil por su alta selectividad y resolución de separación, [2] [3] en comparación con otros métodos cromatográficos.
La cromatografía de afinidad tiene la ventaja de interacciones de unión específicas entre el analito de interés (normalmente disuelto en la fase móvil ) y un socio de unión o ligando (inmovilizado en la fase estacionaria ). En un experimento típico de cromatografía de afinidad, el ligando se une a una matriz sólida e insoluble, generalmente un polímero como agarosa o poliacrilamida , modificado químicamente para introducir grupos funcionales reactivos con los que el ligando puede reaccionar, formando enlaces covalentes estables. [4] La fase estacionaria se carga primero en una columna en la que se introduce la fase móvil. Las moléculas que se unen al ligando permanecerán asociadas con la fase estacionaria. Luego se aplica un tampón de lavado para eliminar biomoléculas no objetivo al interrumpir sus interacciones más débiles con la fase estacionaria, mientras que las biomoléculas de interés permanecerán unidas. Las biomoléculas objetivo pueden luego eliminarse aplicando un llamado tampón de elución, que interrumpe las interacciones entre las biomoléculas objetivo unidas y el ligando. De esta forma, la molécula objetivo se recupera en la solución eluyente. [5] [ página necesaria ]
La cromatografía de afinidad no requiere que se conozcan el peso molecular, la carga, la hidrofobicidad u otras propiedades físicas del analito de interés, aunque el conocimiento de sus propiedades de unión es útil en el diseño de un protocolo de separación. [5] Los tipos de interacciones de unión comúnmente explotadas en los procedimientos de cromatografía de afinidad se resumen en la siguiente tabla.
La unión a la fase sólida se puede lograr mediante cromatografía en columna, en la que el medio sólido se empaqueta en una columna, la mezcla inicial se hace pasar por la columna para permitir la sedimentación, se hace pasar un tampón de lavado por la columna y posteriormente se aplica el tampón de elución a la columna y se recoge. Estos pasos se realizan habitualmente a presión ambiente. Alternativamente, la unión se puede lograr utilizando un tratamiento por lotes, por ejemplo, añadiendo la mezcla inicial a la fase sólida en un recipiente, mezclando, separando la fase sólida, eliminando la fase líquida, lavando, volviendo a centrifugar, añadiendo el tampón de elución, volviendo a centrifugar y eliminando el eluido.
A veces se emplea un método híbrido, en el que la unión se realiza mediante el método por lotes, pero la fase sólida con la molécula objetivo unida se empaqueta en una columna y el lavado y la elución se realizan en la columna.
Los ligandos utilizados en la cromatografía de afinidad se obtienen de fuentes tanto orgánicas como inorgánicas. Ejemplos de fuentes biológicas son las proteínas séricas, las lectinas y los anticuerpos. Las fuentes inorgánicas son el ácido morónico, los quelatos metálicos y los colorantes de triazina. [7]
También se ha desarrollado un tercer método, la absorción en lecho expandido, que combina las ventajas de los dos métodos mencionados anteriormente. Las partículas de la fase sólida se colocan en una columna donde la fase líquida se bombea desde abajo y sale por la parte superior. La gravedad de las partículas garantiza que la fase sólida no salga de la columna junto con la fase líquida.
Las columnas de afinidad se pueden eluir cambiando las concentraciones de sal, el pH, el pI, la carga y la fuerza iónica directamente o mediante un gradiente para resolver las partículas de interés.
Más recientemente, se han desarrollado configuraciones que emplean más de una columna en serie. La ventaja en comparación con las configuraciones de una sola columna es que el material de resina se puede cargar completamente ya que el producto no aglutinante pasa directamente a una columna consecutiva con material de columna nuevo. Estos procesos cromatográficos se conocen como cromatografía periódica en contracorriente (PCC). De este modo, los costos de resina por cantidad de producto producido se pueden reducir drásticamente. Dado que siempre se puede eluir y regenerar una columna mientras se carga la otra columna, ya son suficientes dos columnas para aprovechar al máximo las ventajas. [8] Las columnas adicionales pueden brindar flexibilidad adicional para los tiempos de elución y regeneración, a costa de equipos y costos de resina adicionales.
La cromatografía de afinidad se puede utilizar en diversas aplicaciones, incluida la purificación de ácidos nucleicos, la purificación de proteínas [9] a partir de extractos libres de células y la purificación de sangre.
Mediante la cromatografía de afinidad, se pueden separar las proteínas que se unen a un fragmento determinado de las proteínas que no se unen a ese fragmento específico. [10] Debido a que esta técnica de purificación depende de las propiedades biológicas de la proteína necesaria, es una técnica útil y las proteínas se pueden purificar muchas veces en un solo paso. [11] [ página necesaria ]
Existen muchos medios de afinidad diferentes para una variedad de usos posibles. [12] [9] [13] En resumen, son medios activados/funcionalizados (generalizados) que funcionan como espaciadores funcionales, matrices de soporte y eliminan la manipulación de reactivos tóxicos.
Los medios de aminoácidos se utilizan con una variedad de proteínas séricas, proteínas, péptidos y enzimas, así como ARNr y ADNbc. Los medios de avidina y biotina se utilizan en el proceso de purificación de biotina/avidina y sus derivados.
La unión de carbohidratos se utiliza con mayor frecuencia con glicoproteínas o cualquier otra sustancia que contenga carbohidratos; los carbohidratos se utilizan con lectinas, glicoproteínas o cualquier otra proteína metabolito de carbohidratos. El medio de unión con ligando de colorante no es específico, pero imita los sustratos y proteínas biológicas. El glutatión es útil para la separación de proteínas recombinantes marcadas con GST. La heparina es un ligando de afinidad generalizada y es más útil para la separación de proteínas de coagulación plasmática, junto con enzimas de ácidos nucleicos y lipasas.
Los medios de interacción hidrofóbica se utilizan con mayor frecuencia para apuntar a grupos carboxilo libres y proteínas.
Los medios de inmunoafinidad (detallados a continuación) utilizan la alta especificidad de los antígenos y anticuerpos para separar; la cromatografía de afinidad de metales inmovilizados se detalla más adelante y utiliza interacciones entre iones metálicos y proteínas (generalmente marcadas especialmente) para separar; nucleótido/coenzima que funciona para separar deshidrogenasas, quinasas y transaminasas.
Los ácidos nucleicos funcionan para atrapar ARNm, ADN, ARNr y otros ácidos nucleicos/oligonucleótidos. El método de proteína A/G se utiliza para purificar inmunoglobulinas.
Los medios especiales están diseñados para una clase o tipo específico de proteína/coenzima; este tipo de medio solo funcionará para separar una proteína o coenzima específica.
Otro uso del procedimiento es la purificación por afinidad de anticuerpos del suero sanguíneo. Si se sabe que el suero contiene anticuerpos contra un antígeno específico (por ejemplo, si el suero proviene de un organismo inmunizado contra el antígeno en cuestión), se puede utilizar para la purificación por afinidad de ese antígeno. Esto también se conoce como cromatografía de inmunoafinidad. Por ejemplo, si un organismo se inmuniza contra una proteína de fusión GST, producirá anticuerpos contra la proteína de fusión y, posiblemente, también contra la etiqueta GST. La proteína se puede acoplar covalentemente a un soporte sólido, como la agarosa, y se puede utilizar como ligando de afinidad en las purificaciones de anticuerpos del suero inmune.
Para que sea más minucioso, la proteína GST y la proteína de fusión GST se pueden acoplar por separado. Inicialmente, se permite que el suero se una a la matriz de afinidad GST. Esto eliminará los anticuerpos contra la parte GST de la proteína de fusión. Luego, el suero se separa del soporte sólido y se deja que se una a la matriz de proteína de fusión GST. Esto permite que cualquier anticuerpo que reconozca el antígeno sea capturado en el soporte sólido. La elución de los anticuerpos de interés se logra con mayor frecuencia utilizando un tampón de pH bajo , como glicina pH 2,8. El eluato se recoge en un tampón de tris o fosfato neutro, para neutralizar el tampón de elución de pH bajo y detener cualquier degradación de la actividad del anticuerpo. Este es un buen ejemplo, ya que la purificación por afinidad se utiliza para purificar la proteína de fusión GST inicial, para eliminar los anticuerpos anti-GST indeseables del suero y para purificar el anticuerpo objetivo.
Los anticuerpos monoclonales también pueden seleccionarse para unirse a proteínas con gran especificidad, donde la proteína se libera en condiciones relativamente suaves. Esto puede resultar útil para futuras investigaciones. [14]
A menudo se emplea una estrategia simplificada para purificar los anticuerpos generados contra antígenos peptídicos . Cuando los antígenos peptídicos se producen sintéticamente, se añade un residuo de cisteína terminal en el extremo N o C del péptido. Este residuo de cisteína contiene un grupo funcional sulfhidrilo que permite que el péptido se conjugue fácilmente con una proteína transportadora (por ejemplo, hemocianina de lapa (KLH)). El mismo péptido que contiene cisteína también se inmoviliza sobre una resina de agarosa a través del residuo de cisteína y luego se utiliza para purificar el anticuerpo.
La mayoría de los anticuerpos monoclonales se han purificado mediante cromatografía de afinidad basada en proteína A o proteína G específicas de inmunoglobulina , derivadas de bacterias. [15]
La cromatografía de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales inmovilizados en una columna monolítica se ha utilizado con éxito para capturar vesículas extracelulares (por ejemplo, exosomas y exómeros) del plasma sanguíneo humano al apuntar a las tetraspaninas e integrinas que se encuentran en la superficie de las EV. [16] [17]
La cromatografía de inmunoafinidad también es la base de las tiras de prueba inmunocromatográficas (ICT), que proporcionan un medio rápido de diagnóstico en la atención al paciente. Mediante la ICT, un técnico puede hacer una determinación junto a la cama de un paciente, sin necesidad de un laboratorio. [18] La detección de la ICT es altamente específica para el microbio que causa una infección. [19]
La cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados (IMAC) se basa en el enlace covalente coordinado específico de aminoácidos, en particular histidina, a metales. Esta técnica funciona permitiendo que las proteínas con afinidad por iones metálicos se retengan en una columna que contiene iones metálicos inmovilizados, como cobalto, níquel o cobre para la purificación de proteínas o péptidos que contienen histidina, hierro, zinc o galio para la purificación de proteínas o péptidos fosforilados. Muchas proteínas naturales no tienen afinidad por iones metálicos, por lo tanto, se puede utilizar la tecnología de ADN recombinante para introducir dicha etiqueta de proteína en el gen relevante. Los métodos utilizados para eluir la proteína de interés incluyen cambiar el pH o agregar una molécula competitiva, como imidazol . [20] [21]
Posiblemente el uso más común de la cromatografía de afinidad es para la purificación de proteínas recombinantes. Las proteínas con una afinidad conocida se etiquetan con proteínas para ayudar a su purificación. La proteína puede haber sido modificada genéticamente para permitir que se la seleccione para la unión por afinidad; esto se conoce como proteína de fusión. Las etiquetas de proteínas incluyen hexahistidina ( His ), glutatión -S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa (MBP) y la etiqueta CL7 variante de colicina E7. Las etiquetas de histidina tienen afinidad por los iones de níquel , cobalto , zinc , cobre y hierro que se han inmovilizado formando enlaces covalentes coordinados con un quelante incorporado en la fase estacionaria. Para la elución, se utiliza una cantidad en exceso de un compuesto capaz de actuar como ligando de iones metálicos, como imidazol . La GST tiene afinidad por el glutatión, que está disponible comercialmente inmovilizado como glutatión agarosa. Durante la elución, se utiliza un exceso de glutatión para desplazar la proteína marcada. CL7 tiene afinidad y especificidad por la proteína de inmunidad 7 (Im7), que se encuentra disponible comercialmente inmovilizada como resina de agarosa Im7. Para la elución, se aplica una proteasa activa y específica del sitio a la resina Im7 para liberar la proteína sin etiqueta. [22]
La cromatografía de afinidad de lectinas es una forma de cromatografía de afinidad en la que se utilizan lectinas para separar los componentes de la muestra. Las lectinas, como la concanavalina A, son proteínas que pueden unirse a moléculas de carbohidratos alfa-D-manosa y alfa-D-glucosa específicas. Algunas moléculas de carbohidratos comunes que se utilizan en la cromatografía de afinidad de lectinas son Con A-Sepharose y WGA-agarosa. [23] Otro ejemplo de lectina es la aglutinina de germen de trigo, que se une a la DN-acetil-glucosamina. [24] La aplicación más común es separar las glicoproteínas de las proteínas no glicosiladas, o una glicoforma de otra glicoforma. [25] Aunque existen varias formas de realizar la cromatografía de afinidad de lectinas, el objetivo es extraer un ligando de azúcar de la proteína deseada. [23]
Otro uso de la cromatografía de afinidad es la purificación de proteínas específicas utilizando una matriz de gel que es exclusiva de una proteína específica. Por ejemplo, la purificación de la β-galactosidasa de E. coli se logra mediante cromatografía de afinidad utilizando p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa como matriz de afinidad. La p-aminobenil-1-tio-β-D-galactopiranosil agarosa se utiliza como matriz de afinidad porque contiene un grupo galactopiranosilo, que sirve como un buen sustrato análogo para la β-galactosidasa de E. coli. Esta propiedad permite que la enzima se una a la fase estacionaria de la matriz de afinidad y la β-galactosidasa se eluye añadiendo concentraciones crecientes de sal a la columna. [26]
La fosfatasa alcalina de E. coli se puede purificar utilizando una matriz de celulosa DEAE. La fosfatasa alcalina tiene una ligera carga negativa, lo que le permite unirse débilmente a los grupos amina con carga positiva en la matriz. La enzima se puede eluir añadiendo un tampón con concentraciones de sal más altas. [27]
La cromatografía de afinidad por boronato consiste en utilizar ácido borónico o boronatos para eluir y cuantificar cantidades de glicoproteínas . En las adaptaciones clínicas se ha aplicado este tipo de cromatografía para su uso en la determinación de la evaluación a largo plazo de pacientes diabéticos mediante el análisis de su hemoglobina glucosilada . [24]
La purificación por afinidad de la contaminación por albúmina y macroglobulina es útil para eliminar el exceso de contaminación por albúmina y α 2 -macroglobulina, al realizar la espectrometría de masas. En la purificación por afinidad de la albúmina sérica, el material estacionario utilizado para recolectar o atraer las proteínas séricas puede ser Cibacron Blue-Sepharose. Luego, las proteínas séricas se pueden eluir del adsorbente con un tampón que contenga tiocianato (SCN − ). [28]
La cromatografía de afinidad débil [29] ( WAC ) es una técnica de cromatografía de afinidad para la detección de afinidad en el desarrollo de fármacos. [30] [31] La WAC es una técnica cromatográfica líquida basada en la afinidad que separa compuestos químicos en función de sus diferentes afinidades débiles con un objetivo inmovilizado. Cuanto mayor sea la afinidad de un compuesto hacia el objetivo, más tiempo permanecerá en la unidad de separación, y esto se expresará como un mayor tiempo de retención. La medida de afinidad y la clasificación de la afinidad se pueden lograr procesando los tiempos de retención obtenidos de los compuestos analizados. La cromatografía de afinidad es parte de un conjunto más amplio de técnicas utilizadas en la identificación de objetivos de fármacos basada en la quimioproteómica .
La tecnología WAC se ha demostrado frente a una serie de diferentes dianas proteicas ( proteasas , quinasas , chaperonas y dianas de interacción proteína-proteína ). Se ha demostrado que la tecnología WAC es más eficaz que los métodos establecidos para el cribado basado en fragmentos. [31]
La cromatografía de afinidad fue concebida y desarrollada por primera vez por Pedro Cuatrecasas y Meir Wilchek . [32] [33]
La cromatografía de afinidad es una técnica novedosa concebida por Cuatrecasas y Wilchek