El FlAsH-EDT 2 es un compuesto organoarsénico con fórmula molecular C 24 H 18 As 2 O 5 S 4 . Su estructura se basa en un núcleo de fluoresceína con dos sustituyentes 1,3,2 - ditiarsolano. Se utiliza en la investigación bioanalítica como etiqueta fluorescente para visualizar proteínas en células vivas. [1] El FlAsH-EDT 2 es una abreviatura de aglutinante de horquilla fluorescinar senical - etano di tiol , y es un sólido fluorogénico de color amarillo pálido o rosado . Tiene una fórmula semiestructural ( C 2 H 4 AsS 2 ) 2 - ( C 13 H 5 O 3 ) -C 6 H 4 COOH, que representa los sustituyentes ditiarsolano unidos al núcleo hidroxi xantona , unido a una molécula o -sustituida de ácido benzoico .
FlAsH-EDT 2 se utiliza para el marcaje específico del sitio, uniéndose selectivamente a proteínas que contienen el motivo tetracisteína ( TC) Cys-Cys-Xxx-Xxx-Cys-Cys y volviéndose fluorescente cuando se une. Muestra una unión no específica a proteínas endógenas ricas en cisteína, lo que significa que se une a sitios distintos del de interés (CCXXCC). Una mayor optimización del motivo TC ha revelado una mejor afinidad de unión de FlAsH por un motivo CCPGCC [2] y un mayor rendimiento cuántico cuando el motivo tetracisteína está flanqueado por residuos específicos (HRWCCPGCCKTF o FLNCCPGCCMEP). [3]
El FlAsH-EDT 2 se puede preparar en tres pasos a partir de fluoresceína (ver figura). [1]
Muchos estudios muestran que los compuestos de arsénico trivalente se unen a pares de residuos de cisteína. Esta unión es responsable de la toxicidad de muchos compuestos de arsénico. [4] La unión se revierte por el 1,2-etanoditiol, que se une firmemente a los compuestos de arsénico, como lo demuestra la estabilidad de FlAsH-EDT 2 . [5] Este fuerte enlace azufre-arsénico se puede regular, de nuevo, diseñando un dominio peptídico que exhiba una mayor afinidad hacia el arsénico, como el motivo de tetracisteína. Al modular la distancia entre los dos pares de residuos de cisteína y el espacio entre los centros de arsénico de FlAsH-EDT 2 , se podría lograr un enlace ditiol-arsénico cooperativo y entrópicamente favorecido. [6]
Por lo tanto, la unión de FlAsH-EDT 2 está sujeta a equilibrio. La formación del aducto FlAsH-péptido puede verse favorecida en concentraciones bajas de EDT (por debajo de 10 μM ) y revertirse en concentraciones altas de EDT (por encima de 1 mM). [6]
La FlAsH se vuelve fluorescente al unirse al motivo de tetracisteína. Se excita a 508 nm y emite 528 nm, un verde-amarillo, de fluoresceína libre. El rendimiento cuántico es de 0,49 para 250 nM de FlAsH unido a un péptido modelo que contiene tetracisteína en una solución salina tamponada con fosfato a pH 7,4. [6]
En general, FlAsH-EDT 2 tiene eficiencias cuánticas de fluorescencia de 0,1 a 0,6 con varios límites de detección de μM para la etiqueta citosólica difusa y coeficientes de extinción de 30 a 80 L mmol −1 cm −1 . El complejo FlAsH-péptido también ha demostrado transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) a partir de proteínas fluorescentes, como la proteína fluorescente cian mejorada (ECFP) de la proteína fluorescente verde (GFP). [7]
El FlAsH-EDT 2 permite un marcaje fluorescente menos tóxico y más específico que es permeable a la membrana. [8] La modificación de la fracción de fluoresceína también permite el análisis multicolor. [9] Se ha demostrado que es una buena alternativa a las proteínas fluorescentes verdes (GFP) con la ventaja de que el FlAsH-EDT 2 es mucho más pequeño ( masa molar < 1 kDa ) en comparación con las GFP (~30 kDa), minimizando así la perturbación de la actividad de la proteína en estudio. [1] [10]
En el pasado, FlAsH-EDT 2 se ha utilizado ampliamente para estudiar una serie de eventos celulares in vivo y estructuras subcelulares en células animales, la proteína matriz del virus del Ébola y el plegamiento incorrecto de proteínas. Con la obtención de imágenes por microscopio electrónico, FlAsH-EDT 2 también se utiliza para estudiar los procesos de tráfico de proteínas in situ . [11] Más recientemente, se ha utilizado en un estudio ampliado de células vegetales como Arabidopsis y tabaco. [12]