Etiqueta HUH

Las endonucleasas HUH (HUH-tags) son proteínas de unión a ADN monocatenario (ssDNA) específicas de secuencia que se originan a partir de numerosas especies de bacterias y virus. ^[1] Las endonucleasas HUH virales están involucradas en el inicio de la replicación de círculo rodante, mientras que las de origen bacteriano inician la conjugación bacteriana . En biotecnología, se pueden utilizar para crear enlaces proteína-ADN, ^[2] similar a otros métodos como SNAP-tag . Al hacerlo, crean un enlace covalente 5' entre el ssDNA y la proteína. Las endonucleasas HUH se pueden fusionar con otras proteínas o usarse como etiquetas de proteínas .

El nombre HUH significa " histidina -histidina hidrofóbica", en referencia a los tres aminoácidos en el sitio activo de la endonucleasa. Algunos virus de ADN codifican una endonucleasa HUH que inicia la replicación en círculo rodante del genoma viral, y este proceso define el reino Monodnaviria . ^[3]

Tipos de endonucleasas HUH

Las endonucleasas HUH se dividen en dos categorías de enzimas : proteínas iniciadoras de replicación (Rep) o relaxasas /proteínas de movilización. Ambas contienen pequeños dominios proteicos que reconocen orígenes de replicación específicos de la secuencia o el origen de transferencia en el sitio en el que cortan el ADN. El dominio de corte de las Reps tiende a ser más pequeño, del orden de 10-20 kDa, mientras que los dominios de corte de las relaxasas son más grandes, de aproximadamente 20-40 kDa de tamaño. ^[2]

Modo de acción

Las endonucleasas HUH generalmente tienen dos residuos de histidina (H) en el sitio activo que coordinan un catión metálico ( Mg ²⁺ o Mn ²⁺ ) que interactúa con la cadena principal de fosfato del ADN. Estos residuos permiten un ataque nucleofílico , más comúnmente por una tirosina activada del fosfato escindible en la cadena principal del ADN, generando un enlace covalente 5' con el ssADN. A diferencia de otros enfoques de enlace de proteína-ADN, esta reacción ocurre en condiciones ambientales y no requiere modificaciones adicionales. La cristalografía de rayos X y las estructuras de RMN han proporcionado información sobre la especificidad de la secuencia de la unión del ADN. ^[4]^[5]

Aplicaciones

La relaxasa MobA se incorpora a la cápside viral del virus adenoasociado para unir un conjugado ADN-anticuerpo y dirigir el virus a tipos de células específicos ^[6]
La proteína Rep de PCV2 se fusionó con Cas9 para unir covalentemente una plantilla de reparación de ADN a Cas9, lo que resultó en una mayor reparación dirigida por homología en células humanas ^[7]
De manera similar al enfoque mencionado anteriormente, la relaxasa VirD2 de Agrobacterium se fusionó con Cas9, lo que permitió la unión de una plantilla de reparación de ADN para aumentar la reparación dirigida por homología en plantas ^[8].
La proteína Rep de PCV2 se fusionó con partículas similares a elastina (ELP) unidas a un aptámero de ADN Mucin-1 para administrar medicamentos a las células cancerosas ^[9]
Relajasas TraI, MobA y TrwC utilizadas en el ensamblaje ortogonal en nanoestructuras de ADN ^[10]
La proteína Rep de PCV2 se fusionó con la luciferasa vinculada a aptámeros de ADN que detectaron los niveles de trombina en una muestra ^[11]
"Editores de clic": proteína Rep de PCV2 fusionada a nCas9 y un fragmento de ADN polimerasa para permitir la edición genómica basada en plantillas ^[12]

Referencias

^ Chandler, Michael; de la Cruz, Fernando; Dyda, Fred; Hickman, Alison B.; Moncalian, Gabriel; Ton-Hoang, Bao (8 de julio de 2013). "Rompiendo y uniendo ADN monocatenario: la superfamilia de endonucleasas HUH". Nature Reviews Microbiology . 11 (8): 525–538. doi :10.1038/nrmicro3067. ISSN 1740-1526. PMC 6493337 . PMID 23832240.
^ ab Lovendahl, Klaus N.; Hayward, Amanda N.; Gordon, Wendy R. (24 de mayo de 2017). "Enlaces covalentes proteína-ADN dirigidos por secuencia en un solo paso utilizando etiquetas HUH". Revista de la Sociedad Química Estadounidense . 139 (20): 7030–7035. doi :10.1021/jacs.7b02572. ISSN 0002-7863. PMC 5517037. PMID 28481515 .
^ Koonin EV, Dolja VV, Krupovic M, Varsani A, Wolf YI, Yutin N, Zerbini M, Kuhn JH (18 de octubre de 2019). "Crear un marco megataxonómico, que llene todos los rangos taxonómicos principales, para virus ssDNA" (docx) . Comité Internacional de Taxonomía de Virus . Consultado el 27 de mayo de 2020 .
^ Vega-Rocha, Susana; Byeon, In-Ja L.; Gronenborn, Bruno; Gronenborn, Angela M.; Campos-Olivas, Ramón (2007). "Estructura de la solución, metal divalente y unión al ADN del dominio endonucleasa de la proteína de iniciación de la replicación del circovirus porcino 2". Revista de Biología Molecular . 367 (2): 473–487. doi :10.1016/j.jmb.2007.01.002. ISSN 0022-2836. PMID 17275023.
^ Everett, Blake A.; Litzau, Lauren A.; Tompkins, Kassidy; Shi, Ke; Nelson, Andrew; Aihara, Hideki; Evans Iii, Robert L.; Gordon, Wendy R. (1 de diciembre de 2019). "Estructura cristalina del dominio Rep del virus del enanismo del trigo". Acta Crystallographica Sección F. 75 ( Pt 12): 744–749. doi :10.1107/S2053230X19015796. ISSN 2053-230X. PMC 6891580. PMID 31797816 .
^ Zdechlik, Alina C.; He, Yungui; Aird, Eric J.; Gordon, Wendy R.; Schmidt, Daniel (6 de diciembre de 2019). "Ensamblaje programable de compuestos de virus y anticuerpos adenoasociados para la administración de genes mediada por receptores". Química bioconjugada . 31 (4): 1093–1106. doi :10.1021/acs.bioconjchem.9b00790. ISSN 1043-1802. PMC 7676631 . PMID 31809024.
^ Aird, Eric J.; Lovendahl, Klaus N.; Martin, Amber St.; Harris, Reuben S.; Gordon, Wendy R. (31 de mayo de 2018). "Aumento de la eficiencia de la reparación dirigida por homología mediada por Cas9 a través de la unión covalente de la plantilla de reparación del ADN". Communications Biology . 1 (1): 54. doi :10.1038/s42003-018-0054-2. ISSN 2399-3642. PMC 6123678 . PMID 30271937.
^ Ali, Zahir; Shami, Ashwag; Sedeek, Khalid; Kamel, Radwa; Alhabsi, Abdulrahman; Tehseen, Mahoma; Hassan, Norhan; Trasero, Haroon; Kababji, Ahad; Hamdan, Samir M.; Mahfouz, Magdy M. (23 de enero de 2020). "La fusión de la endonucleasa Cas9 y la relaxasa VirD2 facilita la reparación dirigida por homología para la ingeniería genómica precisa en el arroz". Biología de las Comunicaciones . 3 (1): 44. doi :10.1038/s42003-020-0768-9. ISSN 2399-3642. PMC 6978410 . PMID 31974493.
^ Guo, Wei; Mashimo, Yasumasa; Kobatake, Eiry; Mie, Masayasu (16 de marzo de 2020). "Construcción de nanopartículas que muestran ADN mediante conjugación enzimática de ADN y polipéptidos similares a elastina utilizando una proteína de iniciación de replicación". Nanotecnología . 31 (25): 255102. doi :10.1088/1361-6528/ab8042. ISSN 0957-4484. PMID 32176872.
^ Sagredo, Sandra; Pirzer, Tobías; Aghebat Rafat, Ali; Goetzfried, Marisa A.; Moncalian, Gabriel; Simmel, Friedrich C.; de la Cruz, Fernando (2016). "Ensamblaje de proteínas ortogonales en nanoestructuras de ADN utilizando relaxasas". Edición internacional Angewandte Chemie . 55 (13): 4348–4352. doi :10.1002/anie.201510313. ISSN 1521-3773. PMC 5067690 . PMID 26915475.
^ Mie, Masayasu; Niimi, Takahiro; Mashimo, Yasumasa; Kobatake, Eiry (3 de enero de 2019). "Construcción de conjugados de luciferasa de ADN-NanoLuc para el ensayo sándwich basado en aptámeros de ADN utilizando la proteína Rep". Biotechnology Letters . 41 (3): 357–362. doi :10.1007/s10529-018-02641-7. ISSN 0141-5492. PMID 30603832.
^ Ferreira da Silva, Joana; Tou, Connor J.; King, Emily M.; Eller, Madeline L.; Rufino-Ramos, David; Ma, Linyuan; Cromwell, Christopher R.; Metovic, Jasna; Benning, Friederike MC; Chao, Luke H.; Eichler, Florian S.; Kleinstiver, Benjamin P. (22 de julio de 2024). "La edición con clic permite la escritura programable del genoma utilizando ADN polimerasas y endonucleasas HUH". Nature Biotechnology : 1–13. doi :10.1038/s41587-024-02324-x. ISSN 1546-1696.