Los polipéptidos similares a la elastina ( ELP ) son biopolímeros sintéticos con posibles aplicaciones en los campos de la terapia del cáncer , el andamiaje tisular , la recuperación de metales y la purificación de proteínas . Para la terapia del cáncer, la adición de grupos funcionales a los ELP puede permitirles conjugarse con fármacos citotóxicos. [1] Además, los ELP pueden funcionar como andamiajes poliméricos, que promueven la regeneración tisular. Esta capacidad de los ELP se ha estudiado particularmente en el contexto del crecimiento óseo. [2] Los ELP también pueden diseñarse para reconocer proteínas específicas en solución. La capacidad de los ELP de sufrir cambios morfológicos a ciertas temperaturas permite que las proteínas específicas que están unidas a los ELP se separen del resto de la solución mediante técnicas experimentales como la centrifugación. [3]
La estructura general de los ELP poliméricos es (VPGXG) n , donde la unidad monomérica es Val - Pro - Gly -X- Gly , y la "X" denota un aminoácido variable que puede tener consecuencias en las propiedades generales del ELP, como la temperatura de transición (T t ). Específicamente, la hidrofilicidad o hidrofobicidad y la presencia o ausencia de una carga en el residuo huésped juegan un papel importante en la determinación de la T t . Además, la solubilización del residuo huésped puede afectar la T t . La "n" denota el número de unidades monoméricas que comprenden el polímero. [4] [5] [6] [7] En general, estos polímeros son lineales por debajo de la T t , pero se agregan en grumos esféricos por encima de la T t. . [3]
Aunque se diseñaron y modificaron en un entorno de laboratorio, las ELP comparten características estructurales con las proteínas intrínsecamente desordenadas (IDP) que se encuentran naturalmente en el cuerpo, como la tropoelastina , de la que las ELP obtuvieron su nombre. Las secuencias repetidas que se encuentran en el biopolímero le dan a cada ELP una estructura distinta, además de influir en la temperatura crítica inferior de la solución (LCST), también conocida comúnmente como T t . Es a esta temperatura que las ELP pasan de un estado lineal, relativamente desordenado a un estado más densamente agregado, parcialmente ordenado [7]. Aunque se da como una sola temperatura, T t, el proceso de cambio de fase de las ELP generalmente comienza y termina dentro de un rango de temperatura de aproximadamente 2 °C. Además, T t se altera por la adición de proteínas únicas a las ELP libres. [5]
La tropoelastina es una proteína de 72 kDa que se une mediante enlaces cruzados para formar elastina en la matriz extracelular de la célula. El proceso de formación de enlaces cruzados está mediado por la lisil oxidasa. [8] Una de las principales razones por las que la elastina puede soportar altos niveles de estrés en el cuerpo sin experimentar ninguna deformación física es que la tropoelastina subyacente contiene dominios que son altamente hidrofóbicos. Estos dominios hidrofóbicos, que consisten abrumadoramente en alanina, prolina, glicina y valina, tienden a la inestabilidad y al desorden, lo que garantiza que la elastina no se bloquee en ninguna configuración específica. Por lo tanto, las ELP que consisten en las unidades monoméricas Val - Pro - Gly -X- Gly , que se parecen a los dominios hidrofóbicos repetitivos de la tropoelastina, están altamente desordenadas por debajo de su T t. Incluso por encima de su T t en su estado agregado, las ELP solo están parcialmente ordenadas. Esto se debe a que los aminoácidos prolina y glicina están presentes en grandes cantidades en el ELP. La glicina, debido a la falta de una cadena lateral voluminosa, permite que el biopolímero sea flexible y la prolina evita la formación de enlaces de hidrógeno estables en la estructura principal del ELP. Sin embargo, es importante señalar que ciertos segmentos del ELP pueden formar giros β instantáneos de tipo II, pero estos giros no son duraderos y no se parecen a verdaderas láminas β, cuando se comparan los desplazamientos químicos de RMN. [7]
Aunque las ELP generalmente forman agregados esféricos reversibles debido a su contenido de prolina y glicina, existe la posibilidad de que, en determinadas condiciones, como temperaturas extremadamente altas, las ELP formen amiloides o agregados irreversibles de proteína insoluble. También se cree que los cambios en la estructura de las ELP que conducen a una reducción del contenido de prolina y glicina pueden dar lugar a ELP con una mayor propensión al estado amiloide. Como los amiloides están implicados en la progresión de la enfermedad de Alzheimer , así como en enfermedades basadas en priones, como la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), el modelado de la formación de amiloide en las ELP puede ser útil desde un punto de vista biomédico. [7]
La temperatura de transición de un ELP depende en cierta medida de la identidad del residuo "X" que se encuentra en la cuarta posición de la unidad monomérica del pentapéptido. Los residuos que son altamente hidrofóbicos, como la leucina y la fenilalanina , tienden a disminuir la temperatura de transición. Por otro lado, los residuos que son altamente hidrofílicos, como la serina y la glutamina , tienden a aumentar la temperatura de transición. La presencia de un residuo potencialmente cargado en la posición "X" determinará cómo responde el ELP a los diferentes pH, con el ácido glutámico y el ácido aspártico aumentando el T t a valores de pH en los que los residuos están desprotonados y la lisina y la arginina aumentando el T t a valores de pH en los que los residuos están protonados. El pH debe ser compatible con los estados cargados de estos aminoácidos para poder aumentar el T t . Además, los ELP de mayor masa molecular y mayores concentraciones de ELP en solución hacen que sea mucho más fácil para el polímero formar agregados, lo que en efecto reduce el T t experimental . [9]
A menudo, las ELP no se utilizan de forma aislada, sino que se fusionan con otras proteínas para volverse funcionalmente activas. La estructura de estas otras proteínas tendrá un cierto efecto en la temperatura de transición. Es importante poder predecir la temperatura de transición que tendrán estas proteínas de fusión en relación con las ELP libres, ya que esta temperatura determinará la aplicabilidad y la transición de fase de la proteína fusionada . Existe un modelo teórico que relaciona el cambio en T t de la proteína fusionada con las proporciones variables de cada aminoácido individual que se encuentra en la proteína fusionada. El modelo implica calcular un índice de superficie (SI) asociado con cada aminoácido y luego extrapolar, en función de la proporción de cada aminoácido presente en la proteína fusionada, el cambio total en el T t asociado con la proteína de fusión, ΔT t,fusion : [10]
SI= (ASA XAA / ASA p )(T tc ) [10]
donde ASA p se refiere al área de toda la proteína fusionada que está disponible para el solvente que se está utilizando, ASA XAA se refiere al área del residuo huésped en la ELP que está disponible para el solvente, y T tc es la temperatura de transición que es única para el aminoácido. Sumando la contribución de cada residuo huésped potencial (XAA) se obtendrá un índice SI que es directamente proporcional a ΔT t,fusion. Se encontró que los aminoácidos que están cargados bajo un pH fisiológico de 7,4 tienen el mayor impacto en el SI general de una proteína fusionada. Esto se debe al hecho de que son más accesibles a los solventes que contienen agua, lo que aumenta el ASA XAA y también tienen altos valores de T tc . Por lo tanto, el conocimiento de la temperatura de transición de una proteína fusionada depende en gran medida de la presencia de estos residuos cargados. [10]
Debido a que los ELP son biopolímeros basados en proteínas, la síntesis implica la manipulación de genes para expresar continuamente la unidad monomérica repetida. Se han empleado varias técnicas en la producción de ELP de varios tamaños, incluida la ligadura o concatemerización unidireccional, la reacción en cadena de la polimerasa con extensión superpuesta (OEPCR) y la ligadura direccional recursiva (RDL). [5] [9] Además, los ELP se pueden modificar experimentalmente a través de la conjugación con otros polímeros o mediante la reacción SpyTag/SpyCatcher , [11] lo que permite la síntesis de copolímeros con morfología única. [12]
El proceso de concatemerización genera bibliotecas de concatámeros para los ELP. Los concatámeros son productos oligoméricos de la unión de un único gen consigo mismo. Esto dará como resultado segmentos repetidos de un gen, todos los cuales pueden transcribirse y traducirse inmediatamente para producir el ELP de interés. Un problema importante con esta ruta sintética es que no se puede controlar el número de segmentos repetidos de genes ligados para formar el concatámero, lo que da lugar a ELP de diferentes tamaños, de los cuales se debe aislar el ELP del tamaño deseado. [9]
El método OEPCR utiliza una pequeña cantidad del gen que codifica la unidad ELP monomérica y conduce a la amplificación de este segmento en gran medida. Esta amplificación se debe al hecho de que el segmento inicial añadido a la reacción funciona como una plantilla, a partir de la cual se pueden sintetizar segmentos génicos idénticos. El proceso dará como resultado la producción de ADN bicatenario que codifica la ELP de interés. Un importante obstáculo asociado con este método es la fidelidad potencialmente baja asociada con la polimerasa Taq utilizada. Esto podría conducir a la replicación a partir de la plantilla en la que se incorporan los nucleótidos incorrectos a la cadena de ADN en crecimiento. [9]
En la ligadura direccional recursiva, el gen que codifica el monómero se inserta en un plásmido con sitios de restricción que son reconocidos por al menos dos endonucleasas . Las endonucleasas cortarán el plásmido, liberando el gen de interés. Luego, este único gen se inserta en un vector plasmídico receptor que ya contiene una copia del gen del monómero ELP mediante la digestión del plásmido receptor con las mismas endonucleasas de restricción utilizadas en el plásmido donante y un paso de ligadura posterior. A partir de este proceso, se recupera una secuencia de dos genes del monómero ELP. RDL permite la síntesis controlada de oligómeros del gen ELP, en los que se agregan secuencialmente segmentos de un solo gen. Sin embargo, las endonucleasas de restricción utilizadas se limitan a aquellas que no cortan dentro del propio gen del monómero ELP, ya que esto conduciría a la pérdida de nucleótidos cruciales y una posible mutación por cambio de marco en la proteína. [5]
Los ELP se pueden conjugar sintéticamente con poli( etilenglicol ) añadiendo un motivo funcional ciclooctino al poli(etilenglicol) y un grupo azida al ELP. A través de una reacción de cicloadición que involucra a ambos grupos funcionales y la manipulación del pH del solvente, se pueden formar polímeros dibloque y estrella. En lugar de formar los grumos esféricos canónicos por encima de la temperatura de transición, este ELP conjugado específico forma una micela con propiedades anfifílicas , en la que los grupos de cabeza polares miran hacia afuera y los dominios hidrófobos miran hacia adentro. Estas micelas pueden ser útiles para administrar medicamentos no polares al cuerpo. [12]
Debido a la transición de fase dependiente de la temperatura que experimentan los ELP, en la que pasan de un estado lineal a un estado agregado esférico por encima de su T t , así como a la capacidad de los ELP de conjugarse fácilmente con otros compuestos, estos biopolímeros tienen numerosas aplicaciones. Algunas de estas aplicaciones implican el uso de ELP en la purificación de proteínas, la terapia contra el cáncer y el andamiaje de tejidos. [1] [2] [3]
El ELP se puede conjugar con un grupo funcional que puede unirse a una proteína de interés. A temperaturas inferiores a la T t, el ELP se unirá al ligando en su forma lineal. En este estado lineal, el complejo ELP-proteína no se puede distinguir fácilmente de las proteínas extrañas en la solución. Sin embargo, una vez que la solución se calienta a una temperatura superior a la T t, el ELP formará grumos esféricos. Estos grumos se asentarán en el fondo del tubo de solución después de la centrifugación, transportando la proteína de interés. Las proteínas que no se necesitan se encontrarán en el sobrenadante, que se puede separar físicamente de los agregados esféricos. Para garantizar que haya pocas impurezas en el complejo ELP-proteína aislado, la solución se puede enfriar por debajo de la T t, lo que permite que los ELP vuelvan a asumir su estructura lineal. A partir de este punto, se pueden repetir los ciclos de centrifugación en caliente y en frío, y luego se puede eluir la proteína de interés de los ELP mediante la adición de una sal. [3]
El comportamiento de fase basado en la temperatura de las ELP se puede utilizar para producir redes rígidas que pueden ser compatibles con aplicaciones de regeneración celular. En altas concentraciones (porcentaje en peso superior al 15 %), la transición de las ELP de un estado lineal a un estado agregado esférico por encima de la temperatura de transición se detiene, lo que conduce a la formación de geles frágiles. Estas redes, que de otro modo serían frágiles, se pueden modificar químicamente, a través del acoplamiento oxidativo, para producir hidrogeles que pueden soportar altos niveles de estrés y tensión mecánica. Además, las redes de gel modificadas contienen poros, a través de los cuales se pueden administrar fácilmente compuestos importantes para el mantenimiento de las células. Se ha descubierto que estos hidrogeles fuertes, cuando se bañan en un medio celular mínimo, promueven el crecimiento de poblaciones de células madre mesenquimales humanas . La capacidad de estas redes de ELP detenidas para promover el crecimiento celular puede resultar indispensable en la producción de andamiajes tisulares que promuevan la producción de cartílago, por ejemplo. Una intervención de este tipo puede resultar útil en el tratamiento de enfermedades óseas y artritis reumatoide . [2]
Los ELP modificados con ciertos grupos funcionales tienen la capacidad de ser conjugados con fármacos, incluidos los agentes quimioterapéuticos . [13] En conjunto, el complejo ELP-fármaco puede ser absorbido por las células tumorales en mayor medida, promoviendo la actividad citotóxica del fármaco. La razón por la que los complejos se dirigen preferentemente a las células tumorales es que estas células tienden a estar asociadas con vasos sanguíneos más permeables y también poseen una presencia linfática más débil. Esto significa esencialmente que los fármacos pueden pasar de los vasos a las células tumorales con mayor frecuencia y pueden permanecer en los vasos durante un período de tiempo más largo, sin ser filtrados. La transición de fase asociada con los ELP también se puede utilizar para promover la absorción del fármaco por las células tumorales. Al calentar localmente las regiones de células tumorales, el complejo ELP-fármaco se agregará en grumos esféricos. Si este complejo ELP-fármaco está diseñado para exponer dominios funcionales en forma de grupo esférico que son reconocidos por las superficies de las células tumorales, entonces esta interacción con la superficie celular promovería la absorción del fármaco ya que la célula tumoral confundiría el complejo ELP-fármaco con una sustancia inofensiva. [1] [9]
Un estudio reciente destaca el primer informe sobre una proteína selectiva de elementos de tierras raras (REE) termorresponsiva . El ELP y el dominio de unión a REE están fusionados genéticamente para formar un ELP codificado genéticamente termorresponsivo y selectivo para REE llamado RELP para la extracción y recuperación selectiva de REE totales. RELP muestra una plataforma de biosorción selectiva y repetible para la recuperación de REE. Los autores destacaron que la tecnología se puede adaptar para recuperar otros metales preciosos y materias primas. [14]
