El sistema SpyTag/SpyCatcher es una tecnología de conjugación irreversible de proteínas recombinantes . El péptido SpyTag (13 aminoácidos ) reacciona espontáneamente con la proteína SpyCatcher (12,3 kDa) para formar un enlace isopeptídico intermolecular entre el par. [1] La secuencia de ADN que codifica SpyTag o SpyCatcher se puede introducir de forma recombinante en la secuencia de ADN que codifica una proteína de interés, formando una proteína de fusión . Estas proteínas de fusión se pueden unir covalentemente cuando se mezclan en una reacción a través del sistema SpyTag/SpyCatcher.
Usando el par Tag/Catcher, se puede lograr una bioconjugación entre dos proteínas recombinantes que de otro modo sería restrictiva o imposible con la fusión genética directa tradicional entre las dos proteínas. Por ejemplo, los problemas relacionados con el plegamiento de proteínas, la expresión subóptima del huésped y las modificaciones postraduccionales especializadas se pueden aliviar separando la producción de las proteínas con la modularidad del sistema Tag/Catcher. [2]
SpyTag y SpyCatcher se formaron a partir de la división y la ingeniería del dominio CnaB2 de la proteína FbaB de Streptococcus pyogenes , que forma naturalmente un enlace isopéptido intramolecular para ayudar a la colonización de la célula huésped. [3] [4] Con la formación del enlace isopeptídico, el dominio CnaB2 se vuelve más tolerante a los cambios conformacionales, térmicos y de pH .
A partir de esto, se obtuvo SpyTag de CnaB2 extrayendo la cadena beta C-terminal que contiene el ácido aspártico reactivo en D556 y dejando el resto de las cadenas beta que contienen la lisina reactiva K470 y el ácido glutámico catalítico en E516 para convertirse en SpyCatcher, después de más ingeniería para eliminar algunos residuos superficiales hidrofóbicos . El SpyTag/SpyCatcher resultante puede reaccionar para formar el enlace isopéptido con una constante de velocidad de segundo orden de 1,4 ± 0,4 × 10 3 M −1 s −1 . Se postula [5] que el mecanismo de reacción se produce mediante un ataque nucleofílico de D556 a partir de K470, mediado por E516. Al reconstituir SpyTag:SpyCatcher, el complejo conjugado resultante adquiere la estabilidad del dominio CnaB2 original.
Luego se creó una SpyTag/SpyCatcher de segunda generación llamada SpyTag002/SpyCatcher002 mediante la presentación de fagos que permite que el par péptido-proteína reaccione hasta 12 veces más rápido que el par original, a una velocidad constante de 2,0 ± 0,2 × 10 4 M −1 s. −1 . [6] La segunda generación de SpyCatcher002 también ha abolido la autorreactividad que está presente con SpyCatcher.
Ahora también se ha creado mediante un diseño racional una SpyTag/SpyCatcher de tercera generación llamada SpyTag003/SpyCatcher003. Este reacciona hasta 400 veces más rápido que el par original con una constante de velocidad de 5,5 ± 0,6 × 10 5 M −1 s −1 . [7] Esta versión vuelve a ser reactiva con las dos generaciones anteriores de reactivos SpyTag/SpyCatcher.
SpyTag/SpyCatcher reaccionan con alta especificidad incluso en presencia de entornos de células bacterianas y de mamíferos. [1] [6] [7]
Debido a su especificidad, enlace covalente irreversible y facilidad de uso, el sistema de conjugación SpyTag/SpyCatcher ha tenido muchas aplicaciones diferentes. [5] [8] [9]
Al fusionar SpyTag o SpyCatcher con moléculas que se autoensamblan, como partículas similares a virus , los antígenos fusionados al otro par se pueden decorar en la molécula a través del enlace isopéptido formado. [10] [11] [12] [13] Esto permite una producción rápida de vacunas, ya que la molécula central de autoensamblaje se puede almacenar de antemano, mientras que el antígeno se puede producir fácilmente en condiciones óptimas para lograr el plegamiento adecuado de las proteínas .
La ciclación de enzimas mediante la fusión de los extremos N y C de la proteína ayuda a elevar la estabilidad de la enzima frente al calor. Al tener SpyTag y SpyCatcher juntos en la enzima en los extremos, la enzima experimentará una ciclación espontánea formando el enlace isopéptido. La beta-lactamasa ciclada , la fitasa , la luciferasa de luciérnaga y la xilanasa (por nombrar algunas) han mostrado actividad enzimática retenida incluso después de haber sido sometidas a calor a 100 °C. [14] [15]
Los hidrogeles han tenido una amplia gama de aplicaciones en las ciencias biomédicas. Un tipo de material de partida de hidrogel comúnmente utilizado son los polipéptidos similares a elastina . La química de SpyTag/SpyCatcher se ha utilizado para producir redes moleculares personalizadas (“redes de espías”) dentro de estos hidrogeles que permiten la encapsulación de células vivas de mamíferos, como los fibroblastos. [16] Las modificaciones posteriores han permitido la formación de hidrogeles fotorresponsivos, [17] el control definido por el usuario sobre las interacciones célula-material, [18] la combinación de polipéptidos similares a hialuronano -elastina, [19] y la creación de estructuras proteicas para la biocatálisis del flujo enzimático . [20]
Antes del desarrollo de SpyTag/SpyCatcher, el par Isopeptag/Pilin-C se creó a partir de la proteína Spy0128 de Streptococcus pyogenes . [21] Después de SpyTag/SpyCatcher, el par totalmente ortogonal SnoopTag/SnoopCatcher se desarrolló a partir de la proteína RrgA de Streptococcus pneumoniae que no tiene reactividad cruzada con SpyTag/SpyCatcher. [22] Tenga en cuenta que SnoopTag/SnoopCatcher forma un enlace isopéptido entre un Lys-Asn en lugar del Lys-Asp que se encuentra en SpyTag/SpyCatcher. El mismo dominio de RrgA ahora se ha dividido de una manera diferente a la utilizada para crear SnoopTag/SnoopCatcher, con el nuevo par llamado DogTag/DogCatcher. A diferencia de SpyTag y SnoopTag, que tienen estructuras extendidas, la región de RrgA utilizada para crear DogTag forma una horquilla β y, por lo tanto, está predispuesta para una inserción exitosa en bucles de proteínas. Esta capacidad se ha aprovechado con éxito para marcar con fluorescencia un bucle interno de la proteína del canal de membrana TRPC5 de mamíferos que no se puede modificar en los extremos de la proteína, sin afectar las propiedades del canal de TRPC5. [23] DogTag se ha acoplado con éxito a DogCatcher cuando se inserta en proteínas solubles (supercarpeta GFP , HaloTag y Gre2p). [23]
El par SdyTag/SdyCatcher también se desarrolló en el mismo año a partir del dominio CnaB de la proteína de unión a fibronectina de Streptococcus disgalactiae , pero dado que la proteína tiene una secuencia similar a la proteína original de la que se deriva SpyTag/SpyCatcher, este par Tag/Catcher tiene reactividad cruzada. con este último par. [24]
En lugar de encontrar proteínas homólogas de diferentes especies, se desarrolló un nuevo par Tag/Catcher a partir de SpyTag/SpyCatcher con mutaciones mínimas . SpyTag I3W (A W ) reacciona con SpyCatcher F77V, F94A (B VA ), pero mínimamente con SpyCatcher, mientras que SpyCatcher F77V, F94A puede reaccionar tanto con SpyTag I3W como con SpyTag. [25] Sin embargo, la reactividad cruzada de SpyCatcher F77V, F94A con ambas versiones de SpyTag puede limitar su utilidad como un nuevo par Tag/Catcher.
Se puede aprovechar una química diferente para la ligadura de proteínas: el descubrimiento de la formación de un enlace éster intramolecular en la proteína adhesina de la superficie celular Cpe0147 de Clostridium perfringens condujo al desarrollo de otro par Tag/Catcher con Cpe0147 565–587 como Tag y Cpe0147 439–563. como el receptor. [26] El enlace éster formado entre Thr-Gln es irreversible; sin embargo, al mutar Thr a Ser, el enlace éster Ser-Gln es reversible con un cambio de pH.
La mutación del residuo catalítico de ácido glutámico (E77) en SpyCatcher a alanina detiene la formación de enlaces isopeptídicos pero no previene la asociación inicial no covalente SpyTag/SpyCatcher. Esta interacción no covalente SpyTag/SpyCatcher se ha utilizado en la purificación por afinidad de proteínas recombinantes fusionadas con SpyTag . [27] En esta estrategia de purificación, denominada Spy&Go, SpyCatcher inmovilizado con resina se utiliza para recolectar proteínas fusionadas con SpyTag de sobrenadantes de cultivos celulares o lisados celulares. Las proteínas unidas no específicamente se eliminan lavando la resina con un tampón neutro y la proteína objetivo se eluye a pH neutro usando una alta concentración de imidazol .
La resina de afinidad Spy&Go se basa en la variante SpyCatcher2.1 E77A S49C denominada SpyDock. [27] SpyDock puede expresarse en E. coli como proteína soluble, purificarse usando Ni-NTA y resinas de intercambio aniónico e inmovilizarse en agarosa activada por yodoacetilo a través de la cisteína desapareada introducida mediante la sustitución S49C. En tampones neutros con concentración de sal fisiológica, SpyDock se une a proteínas fusionadas con SpyTag y SpyTag002 con afinidad en el rango nanomolar alto (K d = 750 ± 50 nM para SpyTag, K d = 73 ± 13 nM para SpyTag002). [27] No se ha informado de afinidad con SpyTag003, pero requiere condiciones más duras para garantizar una disociación completa, lo que sugiere que se une más estrechamente. [7] Las proteínas unidas a SpyDock se eluyen incubando la resina con imidazol 2,5 M en tampón neutro. [27] La resina SpyDock se puede regenerar varias veces mediante lavados consecutivos con imidazol 4 M, clorhidrato de guanidinio 6 M y NaOH 0,1 M. [27]
Se ha informado de la purificación Spy&Go de proteínas con SpyTag N-terminal, interno o C-terminal. [7] [27] La resina SpyDock es compatible con todas las generaciones de SpyTag (SpyTag, [1] SpyTag002, [6] SpyTag003 [7] ) y no interfiere con la conjugación covalente posterior de las proteínas purificadas con SpyCatcher. [27]