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Proteína que se une a la maltosa

La proteína transportadora de maltosa ( MBP ) es parte del sistema maltosa / maltodextrina de Escherichia coli , que es responsable de la captación y el catabolismo eficiente de las maltodextrinas. Es un sistema regulador y de transporte complejo que involucra muchas proteínas y complejos proteicos. La MBP tiene una masa molecular aproximada de 42,5 kilodaltons .

Estructura y plegado

La MBP está codificada por el gen malE de Escherichia coli . El gen malE codifica un polipéptido precursor (396 residuos de aminoácidos ) que produce la MBP madura (370 residuos) tras la escisión de la extensión NH2 - terminal (26 residuos). Las formas precursora y madura de la MBP no contienen ningún residuo de cisteína . [2]

La MBP es una proteína monomérica. Las estructuras cristalinas han demostrado que la MBP se divide en dos dominios globulares distintos que están conectados por tres segmentos polipeptídicos cortos. Los dos dominios están separados por un surco profundo que contiene el sitio de unión de la maltosa/maltodextrina. La comparación de las estructuras de las formas ligadas y no ligadas de la MBP ha demostrado que la unión de la maltosa induce un cambio conformacional importante que cierra el surco mediante un movimiento rígido de los dos dominios alrededor de la bisagra polipeptídica de enlace. [3] [4]

Tanto las formas precursoras como las maduras de MBP son funcionales para la unión de la maltosa. [5] La extensión del extremo NH2 disminuye la tasa de plegamiento de la forma precursora de MBP en relación con su forma madura al menos 5 veces, pero no tiene efecto en la tasa de desdoblamiento. [6] [7] El desdoblamiento en equilibrio de MBP se puede modelar mediante un mecanismo de dos estados con una estabilidad ∆G(H 2 O) igual a 9,45 kcal mol −1 a 25 °C, pH 7,6. [8]

Localización y exportación

La MBP se exporta al espacio periplásmico de E. coli . [9] La extensión NH2-terminal de la MBP, también denominada péptido señal , tiene dos funciones: (i) ralentiza el plegamiento del polipéptido recién sintetizado y (ii) dirige este polipéptido a la membrana y al translocón SecYEG . Una vez plegado, el precursor ya no puede entrar en la vía de translocación. [10] La introducción de un residuo de aminoácido cargado o un residuo de prolina dentro del núcleo hidrofóbico del péptido señal es suficiente para bloquear la exportación. [11] Las exportaciones defectuosas de las MBP mutantes son consistentes con la conformación alfa-helicoidal y las interacciones hidrofóbicas del péptido señal en su interacción con la proteína motora del translocón SecA . [12] [13] [14]

Control de la expresión

El gen malE , que codifica para MBP, pertenece al regulón Mal de E. coli , que consta de diez genes cuyos productos están orientados a la captación y utilización eficiente de maltosa y maltodextrinas . Todos los genes involucrados en el transporte de maltosa/maltodextrina, incluido malE , están agrupados en la región malB de E. coli y organizados en dos operones divergentes : malE-malF-malG y malK-lamB . [15] Los sitios de inicio de la transcripción en los promotores malEp y malKp están distantes 271 pares de bases. [16]

Los promotores de malEp y malKp son activados sinérgicamente por la proteína MalT, el activador del regulón Mal y por la proteína receptora de AMPc CRP. Esta activación es un proceso acoplado que implica, desde malEp hacia malKp : dos sitios de unión de MalT; tres sitios de unión de CRP y dos conjuntos superpuestos de tres sitios de unión de MalT, escalonados por tres pares de bases. [16] [17] [18] La activación de la transcripción requiere la unión de trifosfato de adenosina (ATP) y maltotriosa a MalT y la unión de AMP cíclico al dímero de CRP. [19] La forma no ligada de MalT es monomérica mientras que su forma ligada, en presencia de ATP y maltotriosa, es oligomérica. [20]

Uso como vector de proteínas y péptidos.

La MBP se utiliza para aumentar la solubilidad de las proteínas recombinantes expresadas en E. coli . En estos sistemas, la proteína de interés se expresa a menudo como una proteína de fusión MBP , lo que evita la agregación de la proteína de interés. El mecanismo por el cual la MBP aumenta la solubilidad no se entiende bien. Además, la MBP se puede utilizar como una etiqueta de afinidad para la purificación de proteínas recombinantes. La proteína de fusión se une a las columnas de amilosa mientras que todas las demás proteínas fluyen a través de ellas. La fusión MBP-proteína se puede purificar eluyendo la columna con maltosa. Una vez que la proteína de fusión se obtiene en forma purificada, la proteína de interés a menudo se escinde de la MBP con una proteasa específica y luego se puede separar de la MBP mediante cromatografía de afinidad .

Un primer estudio de las relaciones entre la estructura y las funciones de la MBP se realizó mediante la inserción aleatoria de un fragmento corto de ADN, que codifica un sitio de restricción BamHI , en el gen malE . Algunas de las inserciones afectaron las funciones de la MBP, mientras que otras fueron permisivas. [21] [22] Los sitios permisivos que eran internos a la MBP se utilizaron para insertar péptidos antigénicos y desafiar la respuesta inmune en ratones. [23] Las inserciones terminales 3'-OH se utilizaron para crear proteínas de fusión y desarrollar el uso de la MBP como un controlador de afinidad para la purificación de proteínas y péptidos extraños mediante cromatografía de afinidad en amilosa reticulada y elución con maltosa en condiciones fisicoquímicas suaves. [24] [25] Se desarrollaron varios vectores plasmídicos para facilitar la expresión y purificación de dichas proteínas de fusión. [26]

Cuando la MBP recombinante incluye un péptido señal , la proteína de fusión puede ser exportada al espacio periplásmico , lo que facilita su purificación ya que el fluido periplásmico contiene solo un número limitado de proteínas y puede ser recuperado ya sea por un choque osmótico o por permeabilización de la membrana externa bacteriana con antibióticos como la Polimixina B. Tal exportación de la proteína de fusión al espacio periplásmico permite la formación de enlaces disulfuro en la proteína pasajera, por ejemplo fragmentos de anticuerpos . [27] [28] Las proteínas extrañas que son exportadas o secretadas en su organismo nativo, usualmente pueden ser exportadas al periplasma de E. coli por fusión con MBP. Ejemplos de proteínas citoplasmáticas que podrían ser exportadas por fusión con MBP, incluyen la polimerasa Klenow monomérica y la proteína Gene V dimérica del fago M13 . [24] [29] Cuando la MBP recombinante incluye un péptido señal defectuoso o nulo la proteína de fusión permanece dentro del citoplasma bacteriano desde donde puede ser recuperada abriendo las células .

La fusión de proteínas con MBP suele mejorar su solubilidad y facilitar su plegamiento adecuado, de modo que las proteínas de fusión suelen ser bifuncionales. [24] [30] Además, estas fusiones pueden facilitar la cristalización de proteínas difíciles, por ejemplo, proteínas de membrana. Las proteínas cristalizadas suelen tener sus estructuras resueltas mediante cristalografía de rayos X utilizando reemplazo molecular en una estructura de MBP conocida. [31]

Véase también

Referencias

  1. ^ Duan, Xiaoqun; Hall, Jason A; Nikaido, Hiroshi; Quiocho, Florante A (marzo de 2001). "Estructuras cristalinas de la proteína de unión a maltodextrina/maltosa complejada con oligosacáridos reducidos: flexibilidad de la estructura terciaria y unión del ligando". Journal of Molecular Biology . 306 (5): 1115–1126. doi :10.1006/jmbi.2001.4456. PMID  11237621.
  2. ^ Duplay P, Bedouelle H, Fowler A, Zabin I, Saurin W, Hofnung M (agosto de 1984). "Secuencias del gen malE y de su producto, la proteína de unión a maltosa de Escherichia coli K12". The Journal of Biological Chemistry . 259 (16): 10606–13. doi : 10.1016/S0021-9258(18)91005-7 . PMID  6088507.
  3. ^ Spurlino JC, Lu GY, Quiocho FA (marzo de 1991). "La estructura de resolución 2.3-A de la proteína de unión a maltosa o maltodextrina, un receptor primario del transporte activo bacteriano y la quimiotaxis". The Journal of Biological Chemistry . 266 (8): 5202–19. doi :10.2210/pdb1mbp/pdb. PMID  2002054.
  4. ^ Sharff AJ, Rodseth LE, Spurlino JC, Quiocho FA (noviembre de 1992). "Evidencia cristalográfica de un gran movimiento de giro de bisagra inducido por ligando entre los dos dominios de la proteína de unión a maltodextrina implicada en el transporte activo y la quimiotaxis". Bioquímica . 31 (44): 10657–63. doi :10.1021/bi00159a003. PMID  1420181.
  5. ^ Ferenci T, Randall LL (octubre de 1979). "La proteína precursora de unión a maltosa es activa en la unión al sustrato". The Journal of Biological Chemistry . 254 (20): 9979–81. doi : 10.1016/S0021-9258(19)86659-0 . PMID  385604.
  6. ^ Park S, Liu G, Topping TB, Cover WH, Randall LL (febrero de 1988). "Modulación de las vías de plegamiento de las proteínas exportadas por la secuencia líder". Science . 239 (4843): 1033–5. Bibcode :1988Sci...239.1033P. doi :10.1126/science.3278378. PMID  3278378.
  7. ^ Beena K, Udgaonkar JB, Varadarajan R (marzo de 2004). "Efecto del péptido señal en la estabilidad y la cinética de plegamiento de la proteína de unión a maltosa". Bioquímica . 43 (12): 3608–19. doi :10.1021/bi0360509. PMID  15035631.
  8. ^ Chun SY, Strobel S, Bassford P, Randall LL (octubre de 1993). "Plegamiento de la proteína de unión a maltosa. Evidencia de la identidad del paso determinante de la velocidad in vivo e in vitro". The Journal of Biological Chemistry . 268 (28): 20855–62. doi : 10.1016/S0021-9258(19)36864-4 . PMID  8407916.
  9. ^ Kellermann O, Szmelcman S (agosto de 1974). "Transporte activo de maltosa en Escherichia coli K12. Participación de una proteína de unión a maltosa "periplásmica"". Revista Europea de Bioquímica . 47 (1): 139–49. doi : 10.1111/j.1432-1033.1974.tb03677.x . PMID  4215651.
  10. ^ Randall LL, Hardy SJ (septiembre de 1986). "Correlación de la competencia para la exportación con la falta de estructura terciaria de las especies maduras: un estudio in vivo de la proteína de unión a maltosa en E. coli". Cell . 46 (6): 921–8. doi :10.1016/0092-8674(86)90074-7. PMID  3530497. S2CID  28503725.
  11. ^ Bedouelle H, Bassford PJ, Fowler AV, Zabin I, Beckwith J, Hofnung M (mayo de 1980). "Mutaciones que alteran la función de la secuencia señal de la proteína de unión a maltosa de Escherichia coli". Nature . 285 (5760): 78–81. Bibcode :1980Natur.285...78B. doi :10.1038/285078a0. PMID  6990274. S2CID  4253747.
  12. ^ Bedouelle H, Hofnung M (1981). "Implicaciones funcionales del análisis de la estructura secundaria de péptidos señal bacterianos de tipo salvaje y mutantes". Progreso en la investigación clínica y biológica . 63 : 399–403. PMID  7312870.
  13. ^ Chou YT, Gierasch LM (septiembre de 2005). "La conformación de un péptido señal unido por la preproteína translocasa SecA de Escherichia coli". The Journal of Biological Chemistry . 280 (38): 32753–60. doi : 10.1074/jbc.M507532200 . PMID  16046390.
  14. ^ Gelis I, Bonvin AM, Keramisanou D, Koukaki M, Gouridis G, Karamanou S, Economou A, Kalodimos CG (noviembre de 2007). "Base estructural para el reconocimiento de secuencia de señales por parte del motor translocasa SecA según lo determinado por RMN". Celúla . 131 (4): 756–69. doi : 10.1016/j.cell.2007.09.039. PMC 2170882 . PMID  18022369. 
  15. ^ Boos W, Shuman H (marzo de 1998). "Sistema maltosa/maltodextrina de Escherichia coli: transporte, metabolismo y regulación". Microbiology and Molecular Biology Reviews . 62 (1): 204–29. doi :10.1128/MMBR.62.1.204-229.1998. PMC 98911 . PMID  9529892. 
  16. ^ ab Bedouelle H, Schmeissner U, Hofnung M, Rosenberg M (noviembre de 1982). "Promotores de los operones malEFG y malK-lamB en Escherichia coli K12". Revista de biología molecular . 161 (4): 519–31. doi :10.1016/0022-2836(82)90405-3. PMID  6185687.
  17. ^ Bedouelle H (noviembre de 1983). "Mutaciones en las regiones promotoras de los operones malEFG y malK-lamB de Escherichia coli K12". Journal of Molecular Biology . 170 (4): 861–82. doi :10.1016/s0022-2836(83)80192-2. PMID  6417341.
  18. ^ Richet E (octubre de 2000). "Activación sinérgica de la transcripción: un papel dual para la PCR en la activación de un promotor de Escherichia coli en función de MalT y PCR". The EMBO Journal . 19 (19): 5222–32. doi :10.1093/emboj/19.19.5222. PMC 302108 . PMID  11013224. 
  19. ^ Richet E, Raibaud O (marzo de 1989). "MalT, la proteína reguladora del sistema de maltosa de Escherichia coli, es un activador transcripcional dependiente de ATP". The EMBO Journal . 8 (3): 981–7. doi :10.1002/j.1460-2075.1989.tb03461.x. PMC 400900 . PMID  2524384. 
  20. ^ Schreiber V, Richet E (noviembre de 1999). "Autoasociación del activador de transcripción MalT de Escherichia coli en presencia de maltotriosa y ATP". The Journal of Biological Chemistry . 274 (47): 33220–6. doi : 10.1074/jbc.274.47.33220 . PMID  10559195.
  21. ^ Duplay P, Bedouelle H, Szmelcman S, Hofnung M (1985). "Mutagénesis de enlaces en el gen que codifica la proteína periplásmica de unión a maltosa de E. coli". Biochimie . 67 (7–8): 849–51. doi :10.1016/s0300-9084(85)80178-4. PMID  3002495.
  22. ^ Duplay P, Szmelcman S, Bedouelle H, Hofnung M (abril de 1987). "Cambios silenciosos y funcionales en la proteína periplásmica de unión a maltosa de Escherichia coli K12. I. Transporte de maltosa". Journal of Molecular Biology . 194 (4): 663–73. doi :10.1016/0022-2836(87)90243-9. PMID  2821264.
  23. ^ Coëffier E, Clément JM, Cussac V, Khodaei-Boorane N, Jehanno M, Rojas M, Dridi A, Latour M, El Habib R, Barré-Sinoussi F, Hofnung M, Leclerc C (noviembre de 2000). "Antigenicidad e inmunogenicidad del epítopo ELDKWA de gp41 del VIH-1 insertado en sitios permisivos de la proteína MalE". Vacuna . 19 (7–8): 684–93. doi :10.1016/s0264-410x(00)00267-x. PMID  11115689.
  24. ^ abc Bedouelle H, Duplay P (febrero de 1988). "Producción en Escherichia coli y purificación en un solo paso de proteínas híbridas bifuncionales que se unen a la maltosa. Exportación de la polimerasa Klenow al espacio periplásmico". Revista Europea de Bioquímica . 171 (3): 541–9. doi : 10.1111/j.1432-1033.1988.tb13823.x . PMID  3278900.
  25. ^ Rondard P, Brégégère F, Lecroisey A, Delepierre M, Bedouelle H (julio de 1997). "Propiedades conformacionales y funcionales de un epítopo undecapéptido fusionado con el extremo C-terminal de la proteína de unión a maltosa". Bioquímica . 36 (29): 8954–61. CiteSeerX 10.1.1.599.2650 . doi :10.1021/bi962508d. PMID  9220983. 
  26. ^ di Guan C, Li P, Riggs PD, Inouye H (julio de 1988). "Vectores que facilitan la expresión y purificación de péptidos extraños en Escherichia coli mediante fusión con proteína de unión a maltosa". Gene . 67 (1): 21–30. doi :10.1016/0378-1119(88)90004-2. PMID  2843437.
  27. ^ Brégégère F, Schwartz J, Bedouelle H (febrero de 1994). "Híbridos bifuncionales entre los dominios variables de una inmunoglobulina y la proteína de unión a maltosa de Escherichia coli: producción, purificación y unión a antígeno". Ingeniería de proteínas . 7 (2): 271–80. PMID  8170930.
  28. ^ Malik A (junio de 2016). "Etiquetas de fusión de proteínas para la expresión y purificación eficiente de proteínas recombinantes en el espacio periplásmico de E. coli". 3 Biotech . 6 (1): 44. doi :10.1007/s13205-016-0397-7. PMC 4742420 . PMID  28330113. 
  29. ^ Blondel A, Bedouelle H (octubre de 1990). "Exportación y purificación de una proteína dimérica citoplasmática mediante fusión con la proteína de unión a maltosa de Escherichia coli". Revista Europea de Bioquímica . 193 (2): 325–30. doi : 10.1111/j.1432-1033.1990.tb19341.x . PMID  2226455.
  30. ^ Kapust RB, Waugh DS (agosto de 1999). "La proteína de unión a maltosa de Escherichia coli es excepcionalmente eficaz para promover la solubilidad de los polipéptidos a los que está fusionada". Protein Science . 8 (8): 1668–74. doi :10.1110/ps.8.8.1668. PMC 2144417 . PMID  10452611. 
  31. ^ Waugh DS (marzo de 2016). "Estructuras cristalinas de las proteínas de fusión MBP". Protein Science . 25 (3): 559–71. doi :10.1002/pro.2863. PMC 4815407 . PMID  26682969. 

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