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Proteína fijadora de maltosa

La proteína fijadora de maltosa ( MBP ) forma parte del sistema maltosa / maltodextrina de Escherichia coli , que es responsable de la absorción y el catabolismo eficaz de las maltodextrinas. Es un complejo sistema regulador y de transporte que involucra muchas proteínas y complejos proteicos. MBP tiene una masa molecular aproximada de 42,5 kilodaltons .

Estructura y plegado

MBP está codificada por el gen malE de Escherichia coli . El gen malE codifica un polipéptido precursor (396 residuos de aminoácidos ) que produce la MBP madura (370 residuos) tras la escisión de la extensión NH2 - terminal (26 residuos). Las formas precursoras y maduras de MBP no contienen residuos de cisteína . [2]

MBP es una proteína monomérica. Las estructuras cristalinas han demostrado que MBP se divide en dos dominios globulares distintos que están conectados por tres segmentos polipeptídicos cortos. Los dos dominios están separados por un surco profundo que contiene el sitio de unión maltosa/maltodextrina. La comparación de las estructuras de las formas ligadas y no ligadas de MBP ha demostrado que la unión de la maltosa induce un cambio conformacional importante que cierra el surco mediante un movimiento rígido de los dos dominios alrededor de la bisagra del polipéptido de enlace. [3] [4]

Tanto la forma precursora como la madura de MBP son funcionales para la unión de la maltosa. [5] La extensión NH 2 -terminal disminuye la tasa de plegamiento de la forma precursora de MBP en relación con su forma madura en al menos 5 veces, pero no tiene ningún efecto sobre la tasa de desarrollo. [6] [7] El desarrollo del equilibrio de MBP se puede modelar mediante un mecanismo de dos estados con una estabilidad ∆G(H 2 O) igual a 9,45 kcal mol −1 a 25 °C, pH 7,6. [8]

Localización y exportación

MBP se exporta al espacio periplásmico de E. coli . [9] La extensión NH2 - terminal de MBP, también denominada péptido señal , tiene dos funciones: (i) ralentiza el plegamiento del polipéptido recién sintetizado y (ii) dirige este polipéptido a la membrana y al translocón SecYEG . Una vez plegado, el precursor ya no puede entrar en la vía de translocación. [10] La introducción de un residuo de aminoácido cargado o un residuo de prolina dentro del núcleo hidrofóbico del péptido señal es suficiente para bloquear la exportación. [11] Las exportaciones defectuosas de las MBP mutantes son consistentes con la conformación alfa-helicoidal y las interacciones hidrofóbicas del péptido señal en su interacción con la proteína motora translocón SecA . [12] [13] [14]

Control de expresión

El gen malE , que codifica MBP, pertenece al regulón Mal de E. coli , que consta de diez genes cuyos productos están orientados a la captación y utilización eficiente de maltosa y maltodextrinas . Todos los genes implicados en el transporte de maltosa/maltodextrina, incluido malE , están agrupados en la región malB de E. coli y organizados en dos operones divergentes : malE-malF-malG y malK-lamB . [15] Los sitios de inicio de la transcripción en los promotores malEp y malKp están a una distancia de 271 pares de bases. [dieciséis]

Los promotores malEp y malKp son activados sinérgicamente por la proteína MalT, el activador del regulón Mal y por la proteína CRP del receptor de AMPc . Esta activación es un proceso acoplado que implica pasar de malEp hacia malKp : dos sitios de unión MalT; tres sitios de unión a CRP y dos conjuntos superpuestos de tres sitios de unión a MalT, escalonados por tres pares de bases. [16] [17] [18] La activación de la transcripción requiere la unión de trifosfato de adenosina (ATP) y maltotriosa a MalT y la unión de AMP cíclico al dímero de PCR. [19] La forma no ligada de MalT es monomérica, mientras que su forma ligada, en presencia de ATP y maltotriosa, es oligomérica. [20]

Utilizar como vector de proteínas y péptidos.

MBP se utiliza para aumentar la solubilidad de proteínas recombinantes expresadas en E. coli . En estos sistemas, la proteína de interés a menudo se expresa como una proteína de fusión MBP , evitando la agregación de la proteína de interés. El mecanismo por el cual la MBP aumenta la solubilidad no se comprende bien. Además, la propia MBP puede usarse como etiqueta de afinidad para la purificación de proteínas recombinantes. La proteína de fusión se une a las columnas de amilosa mientras todas las demás proteínas fluyen a través de ellas. La fusión MBP-proteína se puede purificar eluyendo la columna con maltosa. Una vez que la proteína de fusión se obtiene en forma purificada, la proteína de interés a menudo se escinde de MBP con una proteasa específica y luego se puede separar de MBP mediante cromatografía de afinidad .

Se realizó un primer estudio de las relaciones entre la estructura y las funciones de MBP mediante la inserción aleatoria de un fragmento corto de ADN, que codifica un sitio de restricción BamHI , en el gen malE . Algunas de las inserciones afectaron las funciones de MBP mientras que otras fueron permisivas. [21] [22] Los sitios permisivos que eran internos a MBP se usaron para insertar péptidos antigénicos y desafiar la respuesta inmune en ratones. [23] Las inserciones del terminal 3'-OH se utilizaron para crear proteínas de fusión y desarrollar el uso de MBP como un mango de afinidad para la purificación de proteínas y péptidos extraños mediante cromatografía de afinidad en amilosa reticulada y elución con maltosa en condiciones físicas suaves. condiciones químicas. [24] [25] Se desarrollaron varios vectores plasmídicos para facilitar la expresión y purificación de dichas proteínas de fusión. [26]

Cuando la MBP recombinante incluye un péptido señal , la proteína de fusión puede exportarse al espacio periplásmico , lo que facilita su purificación ya que el líquido periplásmico contiene sólo un número limitado de proteínas y puede recuperarse mediante un choque osmótico o mediante permeabilización de la bacteria. membrana externa con antibióticos como Polimixina B. Una exportación de este tipo de la proteína de fusión al espacio periplásmico permite la formación de enlaces disulfuro en la proteína pasajera, por ejemplo fragmentos de anticuerpos . [27] [28] Las proteínas extrañas que se exportan o secretan en su organismo nativo generalmente pueden exportarse al periplasma de E. coli mediante fusión con MBP. Ejemplos de proteínas citoplasmáticas que podrían exportarse mediante fusión con MBP incluyen la polimerasa monomérica Klenow y la proteína dimérica Gene V del fago M13 . [24] [29] Cuando la MBP recombinante incluye un péptido señal defectuoso o sin señal, la proteína de fusión permanece dentro del citoplasma bacteriano desde donde se puede recuperar rompiendo las células .

La fusión de proteínas con MBP suele mejorar su solubilidad y facilita su plegamiento adecuado, de modo que las proteínas de fusión suelen ser bifuncionales. [24] [30] Además, tales fusiones pueden facilitar la cristalización de proteínas difíciles, por ejemplo, proteínas de membrana. La proteína cristalizada a menudo puede resolver sus estructuras mediante cristalografía de rayos X utilizando reemplazo molecular en una estructura MBP conocida. [31]

Ver también

Referencias

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