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Terapéutica de ARN

Las terapias con ARN son una nueva clase de medicamentos basados ​​en ácido ribonucleico (ARN) . Se han realizado investigaciones sobre su uso clínico desde la década de 1990, con un éxito significativo en la terapia del cáncer a principios de la década de 2010. [1] En 2020 y 2021, se desarrollaron vacunas de ARNm a nivel mundial para su uso en la lucha contra la enfermedad por coronavirus (pandemia de COVID-19). [2] La vacuna Pfizer-BioNTech COVID-19 fue la primera vacuna de ARNm aprobada por un regulador de medicamentos , seguida por la vacuna Moderna COVID-19 y otras.

Los principales tipos de terapias de ARN son aquellas basadas en ARN mensajero (ARNm), ARN antisentido (ARNas), ARN de interferencia (ARNi) y aptámeros de ARN . De los cuatro tipos, la terapia basada en ARNm es el único que se basa en desencadenar la síntesis de proteínas dentro de las células, lo que la hace particularmente útil en el desarrollo de vacunas. [3] El ARN antisentido es complementario al ARNm codificante y se utiliza para desencadenar la inactivación del ARNm para evitar que se utilice en la traducción de proteínas. [4] Los sistemas basados ​​en ARNi utilizan un mecanismo similar e implican el uso de pequeños ARN de interferencia (siARN) y microARN (miARN) para evitar la traducción del ARNm y/o degradar el ARNm. [5] [6] Sin embargo, los aptámeros de ARN son moléculas cortas de ARN monocatenario producidas por evolución dirigida para unirse a una variedad de objetivos biomoleculares con alta afinidad, lo que afecta su actividad normal in vivo . [7] [8] [9]

El ARN se sintetiza a partir del ADN molde mediante la ARN polimerasa y el ARN mensajero (ARNm) actúa como biomolécula intermediaria entre la expresión del ADN y la traducción de proteínas . Debido a sus propiedades únicas (como su naturaleza típicamente monocatenaria y su grupo 2' OH) y su capacidad para adoptar muchas estructuras secundarias/terciarias diferentes, tanto los ARN codificantes como los no codificantes han atraído la atención en medicina. La investigación ha comenzado a explorar el potencial del ARN para su uso con fines terapéuticos, y se han producido desafíos únicos durante el descubrimiento de fármacos y la implementación de terapias de ARN. [10]

ARNm

El ARN mensajero ( ARNm ) es una molécula de ARN monocatenario que es complementaria a una de las hebras de ADN de un gen . [11] Una molécula de ARNm transfiere una parte del código de ADN a otras partes de la célula para producir proteínas. [12] La terapéutica del ADN necesita acceso al núcleo para transcribirse en ARN, y su funcionalidad depende de la ruptura de la envoltura nuclear durante la división celular. Sin embargo, las terapias de ARNm no necesitan ingresar al núcleo para ser funcionales, ya que se traducirán inmediatamente una vez que hayan llegado al citoplasma . [13] Además, a diferencia de los plásmidos y los vectores virales , los ARNm no se integran en el genoma y, por lo tanto, no tienen riesgo de mutagénesis por inserción , [14] lo que los hace adecuados para su uso en vacunas contra el cáncer, inmunoterapia tumoral y prevención de enfermedades infecciosas. [15]

Descubrimiento y desarrollo

En 1953, Alfred Day Hershey informó que poco después de la infección con fagos , las bacterias producían una forma de ARN en un nivel alto y este ARN también se descomponía rápidamente. [16] Sin embargo, la primera indicación clara de ARNm fue el trabajo de Elliot Volkin y Lazarus Astrachan en 1956 al infectar E. coli con bacteriófagos T2 y colocarlos en el medio con 32 P. [17] [18] Descubrieron que la síntesis de proteínas de E. coli se detuvo y se sintetizaron proteínas de fagos. [19] Luego, en mayo de 1961, sus investigadores colaboradores Sydney Brenner, François Jacob y Jim Watson anunciaron el aislamiento del ARNm. [20] [21] Durante algunas décadas después del descubrimiento del ARNm, la gente se centró en comprender los aspectos estructurales, funcionales y metabólicos de los ARNm. Sin embargo, en 1990, Jon A. Wolff demostró la idea de fármacos codificados por ácidos nucleicos mediante la inyección directa de ARNm transcrito in vitro (IVT) o ADN plasmídico (ADNp) en el músculo esquelético de ratones que expresaban la proteína codificada en el músculo inyectado. [22] [23] [24]

Una vez que el ARNm de IVT ha llegado al citoplasma, el ARNm se traduce instantáneamente. Por tanto, no necesita entrar en el núcleo para ser funcional. [25] Además, no se integra en el genoma y, por lo tanto, no tiene riesgo de mutagénesis por inserción. [26] Además, el ARNm de IVT solo tiene actividad transitoria y se degrada completamente a través de vías metabólicas fisiológicas. [27] Debido a estas razones, el ARNm de IVT ha sido objeto de una extensa investigación preclínica.

Mecanismos

La transcripción in vitro (IVT) se realiza en una plantilla de plásmido de ADN linealizado que contiene la secuencia codificante objetivo. Luego, el ARNm desnudo o el ARNm complejado en una nanopartícula se administrará de forma sistémica o local. Posteriormente, una parte del ARNm desnudo exógeno o del ARNm complejado pasará por mecanismos específicos de la célula. Una vez en el citoplasma, el ARNm de IVT es traducido por la maquinaria de síntesis de proteínas. [28] [29]

Hay dos sensores de ARN identificados, los receptores tipo peaje (TLR) y la familia de receptores tipo RIG-I. Los TLR se localizan en el compartimento endosómico de las células, como las CD y los macrófagos. [30] La familia similar a RIG-I es un receptor de reconocimiento de patrones (PRR). [31] Sin embargo, los mecanismos de respuesta inmune y el proceso de reconocimiento de la vacuna de ARNm por parte de sensores celulares y el mecanismo de activación del sensor aún no están claros. [29]

Aplicaciones

Inmunoterapia contra el cáncer

En 1995, Robert Conry demostró que la inyección intramuscular de ARN desnudo que codifica el antígeno carcinoembrionario provocaba respuestas de anticuerpos específicas del antígeno. [32] Luego, se elaboró ​​demostrando que las células dendríticas (CD) expuestas a ARNm que codifica antígenos específicos o a ARNm total extraído de células tumorales e inyectadas en ratones portadores de tumores indujeron respuestas inmunes de células T e inhibieron el crecimiento de tumores. [33] Luego, los investigadores comenzaron a abordar las CD transfectadas con ARNm utilizando vacunas basadas en CD transfectadas con ARNm de IVT ex vivo . [34] Mientras tanto, Argos Therapeutics había iniciado un ensayo clínico de fase III utilizando CD con carcinoma de células renales avanzado en 2015 (NCT01582672), pero se terminó debido a la falta de eficacia. [35]

Para una aplicación adicional, el ARNm de IVT se optimizó para transfecciones in situ de CD in vivo . Mejoró la eficiencia de la traducción y la estabilidad del ARNm de IVT y mejoró la presentación del antígeno codificado por ARNm en las moléculas del MHC de clase I y II . [36] [37] Luego, descubrieron que la inyección directa de ARNm de IVT desnudo en los ganglios linfáticos era la forma más eficaz de inducir respuestas de células T. [38] Con base en este descubrimiento, BioNTech ha comenzado la primera prueba en humanos de la inyección de ARNm IVT desnudo que codifica antígenos cancerosos con pacientes con melanoma (NCT01684241). [39]

Recientemente, RXi Pharmaceuticals y el Instituto Karolinska inventaron la nueva inmunoterapia contra el cáncer, la combinación de terapia de autoadministración de ARN (sd-rxRNA) y transferencia celular adoptiva (ACT) . En esta terapia, el sd-rxRNA eliminó la expresión de proteínas y receptores inmunosupresores en las células inmunitarias terapéuticas, por lo que mejoró la capacidad de las células inmunitarias para destruir las células tumorales. Luego, el sd-rxRNA dirigido a PD-1 ayudó a aumentar la actividad antitumoral de los linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) contra las células de melanoma. [40] [41] Basado en esta idea, el ARNm-4157 ha sido probado y pasó el ensayo clínico de fase I. [42]

Las vías de detección de ácidos nucleicos citosólicos pueden mejorar la respuesta inmune al cáncer. Agonista de RIG-I , ARN de bucle madre (SLR) 14. El crecimiento del tumor se retrasó significativamente y se extendió la supervivencia en ratones. SLR14 mejoró la eficacia antitumoral del anticuerpo anti-PD1 en comparación con el tratamiento con un solo agente. "SLR14 fue absorbido por las células mieloides CD11b+ en el microambiente del tumor ". Los genes asociados con la defensa inmune estaban significativamente regulados positivamente, junto con un aumento de linfocitos T CD8+ , células NK y células CD11b+. SLR14 inhibió el crecimiento del tumor B16 no inmunogénico , dejando memoria inmune. [43]

Vacunas

En 1993, se informó del primer éxito de una vacuna de ARNm en ratones , mediante el uso de ARNm IVT encapsulado en liposomas que codifica la nucleoproteína de la influenza que induce células T específicas del virus. [44] Luego, el ARNm de IVT se formuló con nanopartículas lipídicas sintéticas e indujo respuestas protectoras de anticuerpos contra el virus respiratorio sincitial (VRS) y el virus de la influenza en ratones. [45]

Existen algunos tipos diferentes de desarrollo de vacunas basadas en ARNm de IVT para enfermedades infecciosas. Uno de los tipos exitosos es el uso de ARNm IVT autoamplificador que tiene secuencias de virus de ARN de cadena positiva. Fue desarrollado originalmente para un flavivirus y funcionaba con inyección intradérmica . Una de las otras formas es inyectar una vacuna de dos componentes que contiene un adyuvante de ARNm y ARNm de IVT desnudo que codifica el antígeno de hemaglutinina de la influenza solo o en combinación con neuraminidasa que codifica ARNm de IVT. [46]

Por ejemplo, para el tratamiento del VIH, las vacunas utilizan CD transfectadas con ARNm de IVT que codifica proteínas del VIH. Hay algunos ensayos clínicos de fase I y II que utilizan combinaciones de codificación de ARNm de IVT y muestran que se pueden inducir respuestas de células T CD8+ y CD4+ específicas de antígeno. Sin embargo, no se han observado efectos antivirales en el ensayo clínico. [47] [48]

Una de las otras vacunas de ARNm es para COVID-19 . El síndrome respiratorio agudo severo CoronaVirus 2 ( SARS-CoV-2 ) brotó en diciembre de 2019 y se extendió por todo el mundo, provocando una pandemia de enfermedad respiratoria denominada enfermedad por coronavirus 2019 (COVID-19). [49] La vacuna Moderna COVID-19 , fabricada por Moderna desde 2020, es una vacuna basada en ARNm encapsulada en nanopartículas lipídicas (LNP) que codifica un antígeno pico(S)-2P estabilizado por prefusión de longitud completa del SARS-CoV- 2 con anclaje transmembrana . [50] [51]

Antivírico

En 2021, se informó que SLR14 previene la infección en el tracto respiratorio inferior y enfermedades graves de manera dependiente del interferón tipo I (IFN-I) en ratones. Los ratones inmunodeficientes con infección crónica por SARS-CoV-2 experimentaron una inmunidad innata casi esterilizante sin la ayuda del sistema inmunológico adaptativo . [52]

Regeneración de tejidos

Un estudio de 2022 realizado por investigadores de la Clínica Mayo , la Universidad de Maastricht y Ethris GmBH, una empresa de biotecnología que se centra en terapias de ARN, encontró que el ARNm modificado químicamente que codifica BMP-2 promovía la curación dependiente de la dosis de las osteotomías femorales en ratas macho. Las moléculas de ARNm se formaron complejos con partículas de lípidos no virales , se cargaron en esponjas y se implantaron quirúrgicamente en los defectos óseos. Permanecieron localizados alrededor del sitio de aplicación. En comparación con la recepción directa de rhBMP-2, los tejidos óseos regenerados después del tratamiento con ARNm mostraron una resistencia superior y una menor formación de callos masivos. [53]

Limitaciones

Existen muchos desafíos para la traducción exitosa del ARNm en fármacos porque el ARNm es una molécula muy grande y pesada (10 ^ 5 ~ 10 ^ 6 Da). Además, el ARNm es inestable y fácilmente degradado por las nucleasas, y también activa el sistema inmunológico. [54] Además, el ARNm tiene una alta densidad de carga negativa y reduce la permeación del ARNm a través de las membranas celulares. [55] Debido a estas razones, sin el sistema de administración adecuado, el ARNm se degrada fácilmente y la vida media del ARNm sin un sistema de administración es solo de alrededor de 7 horas. [56] Aunque algunos grados de desafíos podrían superarse mediante modificaciones químicas , la entrega de ARNm sigue siendo un obstáculo. Los métodos que se han investigado para mejorar el sistema de entrega de ARNm son el uso de microinyección , parches de ARN (ARNm cargado en una microaguja que se disuelve), pistola genética , condensación de protamina , adyuvantes de ARN y encapsulación de ARNm en nanopartículas con lípidos. [54] [57] [58]

Aunque el ARNm traducido in vitro (IVT) con agentes de administración mostró una mayor resistencia contra la degradación, se necesitan más estudios sobre cómo mejorar la eficiencia de la administración de ARNm desnudo in vivo . [23]

Terapéuticas de ARN aprobadas

ARN antisentido

El ARN antisentido es el ARN monocatenario y no codificante que es complementario a una secuencia codificante de ARNm. Inhibe la capacidad del ARNm de traducirse en proteínas. [64] Las transcripciones cortas de ARN antisentido se producen dentro del núcleo mediante la acción de la enzima Dicer, que escinde los precursores de ARN bicatenario en especies de ARN de 21 a 26 nucleótidos de longitud. [4]

Existe una estrategia de descubrimiento basada en antisentido, una justificación y un diseño de ensayos de detección, y la aplicación de dichos ensayos para la detección de extractos de productos naturales y el descubrimiento de inhibidores de la enzima condensadora de ácidos grasos . [65] El ARN antisentido se utiliza para tratar el cáncer y la inhibición de metástasis y vectores para el secuestro antisentido. En particular, los MicroARN (miR) 15 y 16 para un paciente que necesita tratamiento para el diagnóstico y profilaxis del cáncer. [66] Los fármacos antisentido se basan en el hecho de que el ARN antisentido se hibrida con el ARNm e inactivalo. Estos medicamentos son secuencias cortas de ARN que se unen al ARNm e impiden que un gen en particular produzca la proteína que codifica. Se están desarrollando fármacos antisentido para tratar el cáncer de pulmón, la diabetes y enfermedades como la artritis y el asma con un importante componente inflamatorio. [67] Muestra que la expresión disminuida del ARN 1 antisentido de MLLT4 (MLLT4‑AS1) es un biomarcador potencial y un predictor de un mal pronóstico para el cáncer gástrico. Hasta ahora, se han explorado las aplicaciones de los ARN antisentido en tratamientos antivirus y anticancerígenos y en la regulación de la expresión de genes relacionados en plantas y microorganismos. [68]

Se han utilizado vectores no virales, vectores virales y liposomas para administrar el ARN antisentido a través de la membrana celular hasta el citoplasma y el núcleo. [ cita necesaria ] Se ha descubierto que la administración basada en vectores virales es la más ventajosa entre los diferentes sistemas de administración porque tiene una alta eficacia de transfección. [69] Sin embargo, es difícil administrar ARN antisentido solo a los sitios objetivo. Además, debido al tamaño y los problemas de estabilidad del ARN antisentido, existen algunas limitaciones para su uso. Para mejorar los problemas de administración, se han estudiado modificaciones químicas y nuevos diseños de oligonucleótidos para mejorar la distribución del fármaco, los efectos secundarios y la tolerabilidad. [70] [71]

ARNi

Los ARN de interferencia son una clase de ARN cortos no codificantes que actúan para reprimir traslacional o postraduccionalmente la expresión génica. [72] [5] Su descubrimiento y posterior identificación como efectores clave de la regulación genética postranscripcional han convertido a los pequeños ARN de interferencia ( ARNip ) y microARN ( miARN ) en posibles terapias para enfermedades sistémicas. [72] [5] [73] El sistema RNAi fue descubierto originalmente en 1990 por Jorgensen et al., quienes estaban realizando una investigación sobre la introducción de genes de coloración en petunias, [73] [74] y se cree que este sistema originalmente desarrollado como un medio de inmunidad innata contra virus de ARN bicatenario. [75]

ARNip

Un esquema del mecanismo de regulación de genes de ARNip y miARN in vivo.

Las interferencias pequeñas ( ARNip ) son piezas de ARN bicatenarias cortas, de 19 a 23 pares de bases (con un saliente 3' de dos nucleótidos), que participan en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC) para el silenciamiento de genes. [5] [73] Específicamente, el ARNip está unido por el complejo RISC donde se desenrolla mediante hidrólisis de ATP. [73] [76] [77] Luego, la enzima "Slicer" lo utiliza como guía para apuntar a los ARNm para su degradación basándose en el emparejamiento de bases complementarias con el ARNm objetivo. [73] [76] [77] Como agente terapéutico, el ARNip puede administrarse localmente, a través del ojo o la nariz, para tratar diversas enfermedades. [5] La administración local se beneficia de una formulación y administración del fármaco simples y de una alta biodisponibilidad del fármaco. [5] La administración sistémica es necesaria para combatir el cáncer y otras enfermedades. [5] Dirigirse al ARNip cuando se administra localmente es uno de los principales desafíos en la terapia con ARNip. [5] Si bien es posible utilizar la inyección intravenosa para administrar terapias de ARNip, se han planteado preocupaciones sobre los grandes volúmenes utilizados en la inyección, ya que a menudo deben ser ~20-30% del volumen sanguíneo total. [73] Otros métodos de administración incluyen empaquetado en liposomas, conjugación con péptidos permeables a la membrana y electroporación directa de tejido/órgano . [73] Además, se ha descubierto que los ARNip exógenos solo duran unos pocos días (unas pocas semanas como máximo en células que no se dividen) in vivo . [78] [79] Si el ARNip puede alcanzar con éxito su objetivo, tiene el potencial de regular terapéuticamente la expresión génica a través de su capacidad de emparejar bases con objetivos de ARNm y promover su degradación a través del sistema RISC [5] [73] Actualmente , la terapia basada en ARNip se encuentra en un ensayo clínico de fase I para el tratamiento de la degeneración macular relacionada con la edad , [73] aunque también se está explorando su uso en la terapia del cáncer. Por ejemplo, el ARNip se puede utilizar para apuntar a ARNm que codifican proteínas que promueven el crecimiento tumoral, como el receptor de VEGF y la enzima telomerasa . [73]

miARN

Los microARN ( miARN ) son oligonucleótidos de ARN cortos, de aproximadamente 19 a 23 pares de bases de largo, que participan en el complejo silenciador inducido por microARN. [73] [6] Específicamente, una vez cargados en la enzima ARGONAUTE , los miARN funcionan con los ARNm para reprimir la traducción y desestabilizar postraduccionalmente el ARNm . [6] Si bien son funcionalmente similares a los ARNip, los miARN no requieren un emparejamiento de bases extenso para el silenciamiento del ARNm (pueden requerir tan solo siete pares de bases con el objetivo), [80] [81] , lo que les permite afectar ampliamente a un espectro más amplio. gama de objetivos de ARNm. [82] En la célula, el miARN utiliza interacciones de cambio, sintonización y neutrales para regular con precisión la represión genética. [6] Como terapéutico, el miARN tiene el potencial de afectar las vías bioquímicas en todo el organismo. [72]

Con más de 400 miARN identificados en humanos, el primer desafío es discernir su gen objetivo para la represión. [6] Se han creado múltiples bases de datos, por ejemplo TargetScan , utilizando la coincidencia de semillas de miARN. [72] Los ensayos in vitro ayudan a determinar los efectos fenotípicos de los miARN, [72] pero debido a la naturaleza compleja de la regulación genética, no todos los miARN identificados tienen el efecto esperado. [6] Además, se ha descubierto que varios miARN actúan como supresores de tumores u oncogenes in vivo , como los oncogénicos miR-155 y miR-17-92. [82]

En los ensayos clínicos , los miARN se utilizan comúnmente como biomarcadores para una variedad de enfermedades, lo que potencialmente proporciona un diagnóstico más temprano, así como la progresión de la enfermedad, el estadio y los vínculos genéticos. [72] Los ensayos de fase 1 y 2 actualmente prueban imitadores de miARN (para expresar genes) y miARN (para reprimir genes) en pacientes con cáncer y otras enfermedades. [72] En particular, los miARN imitadores se utilizan para introducir miARN que actúan como supresores de tumores en tejidos cancerosos, mientras que los antagonistas de miARN se utilizan para atacar los miARN oncogénicos para prevenir su actividad promotora del cáncer. [82] El miARN terapéutico también se utiliza además de las terapias comunes (como las terapias contra el cáncer) que se sabe que sobreexpresan o desestabilizan los niveles de miARN del paciente. [72] Un ejemplo de una terapia de imitación de miARN que demostró eficacia para impedir el crecimiento de tumores de cáncer de pulmón en estudios con ratones es el miR-34a. [82] [83]

Un aspecto preocupante de las terapias basadas en miARN es la posibilidad de que el miARN exógeno afecte los mecanismos de silenciamiento de miARN dentro de las células corporales normales, afectando así las vías bioquímicas celulares normales. [82] Sin embargo, los estudios in vivo han indicado que los miARN muestran poco o ningún efecto en tejidos/órganos no diana. [83] [84]

aptámeros de ARN

Se creó un aptámero de ARN conocido como "espinaca" como herramienta de obtención de imágenes fluorescentes in vivo . [85] Su actividad fluorescente se basa en la unión a 3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolidinona (DFHBI). [85]

En términos generales, los aptámeros son moléculas pequeñas compuestas de ADN o ARN monocatenario y suelen tener entre 20 y 100 nucleótidos de longitud, [7] [8] [86] o ~3-60 kDa . [86] [87] Debido a su naturaleza monocatenaria, los aptámeros son capaces de formar muchas estructuras secundarias, incluidos pseudonudos , bucles de tallo y protuberancias, a través de interacciones de emparejamiento de bases dentro de la cadena. [86] Las combinaciones de estructuras secundarias presentes en un aptámero le confieren una estructura terciaria particular que a su vez dicta el objetivo específico al que se unirá selectivamente el aptámero. [86] [88] Debido a la capacidad de unión selectiva de los aptámeros, se está considerando una biomolécula prometedora para su uso en productos farmacéuticos. [7] [8] [86] Además, los aptámeros exhiben una unión estrecha a los objetivos, con constantes de disociación a menudo en el rango de pM a nM. [7] [9] Además de su fuerte capacidad de unión, los aptámeros también se valoran porque pueden usarse en objetivos que no son capaces de unirse mediante pequeños péptidos generados por presentación de fagos o por anticuerpos , y son capaces de diferenciar entre isómeros conformacionales. y sustituciones de aminoácidos . [86] [89] [90] Además, debido a que los aptámeros se basan en ácidos nucleicos, se pueden sintetizar directamente, eliminando la necesidad de expresión y extracción basadas en células, como es el caso en la producción de anticuerpos. [8] [91] Los aptámeros de ARN en particular son capaces de producir una gran variedad de estructuras diferentes, lo que lleva a especulaciones de que discriminan más en su afinidad objetivo en comparación con los aptámeros de ADN. [86] [92]

Descubrimiento y desarrollo

Los aptámeros se descubrieron originalmente en 1990 cuando Lary Gold y Craig Tuerk utilizaron un método de evolución dirigida conocido como SELEX para aislar una pequeña molécula de ARN monocatenario que era capaz de unirse a la ADN polimerasa del bacteriófago T4. [8] [93] Además, el término "aptámero" fue acuñado por Andrew Ellington, quien trabajó con Jack Szostak para seleccionar un aptámero de ARN que fuera capaz de unirse estrechamente a ciertas moléculas de tinte orgánico. [86] [94] El término en sí es un conglomerado del latín "aptus" o "encajar" y el griego "meros" o "parte". [86] [94]

Los aptámeros de ARN no se “crean” sino que se “seleccionan”. Para desarrollar un aptámero de ARN capaz de unirse selectivamente a un objetivo molecular, se utiliza un método conocido como Evolución sistemática de ligandos mediante enriquecimiento exponencial (SELEX) para aislar un aptámero de ARN único a partir de un conjunto de ~10^13 a 10^16 aptámeros diferentes. , también conocida como biblioteca. [7] [8] [86] [93] [94] La biblioteca de oligonucleótidos de aptámeros potenciales luego se incuba con una especie no objetivo para eliminar los aptámeros que exhiben unión no específica. [7] Después de la eliminación posterior de los aptámeros no específicos, los miembros restantes de la biblioteca se exponen al objetivo deseado, que puede ser una proteína, un péptido, un tipo de célula o incluso un órgano (en el caso de SELEX de animales vivos). ). [7] [86] [95] [96] [97] [98] [99] [100] A partir de ahí, los aptámeros de ARN que se unieron a la diana se transcriben a ADNc que luego se amplifica mediante PCR y la PCR Luego, los productos se vuelven a transcribir a ARN. [86] Estos nuevos transcritos de ARN se utilizan luego para repetir el ciclo de selección muchas veces, produciendo así eventualmente un conjunto homogéneo de aptámeros de ARN capaces de unirse a un objetivo altamente específico y de alta afinidad. [7]

Ejemplos

Los aptámeros de ARN pueden diseñarse para actuar como antagonistas , agonistas o los llamados "aptámeros señuelo de ARN". [86] [101] En el caso de los antagonistas, el aptámero de ARN se utiliza para evitar la unión de una determinada proteína a su célula receptor de membrana o para evitar que la proteína realice su actividad uniéndose al objetivo de la proteína. [86] Actualmente, las únicas terapias basadas en aptámeros de ARN que han avanzado a ensayos clínicos actúan como antagonistas. [86] Cuando los aptámeros de ARN están diseñados para actuar como agonistas, promueven la activación de las células inmunes como una molécula coestimuladora, ayudando así en la movilización del propio sistema de defensa del cuerpo. [86] [102] Para los aptámeros señuelo de ARN, el aptámero de ARN sintético se asemeja a una molécula de ARN nativa. ] [101] Como tal, las proteínas que se unen al objetivo de ARN nativo se unen al aptámero de ARN, posiblemente interfiriendo con la vía biomolecular de una enfermedad en particular. [86] [101] Además de su utilidad como tratamiento terapéutico directo Como agentes terapéuticos, también se están considerando los aptámeros de ARN para otras funciones terapéuticas. Por ejemplo, al conjugar el aptámero de ARN con un compuesto farmacológico, el aptámero de ARN puede actuar como un sistema de administración dirigido a ese fármaco. [7] Estos aptámeros de ARN se conocen como ApDC. [7] Además, mediante la conjugación con un radioisótopo o una molécula de tinte fluorescente , los aptámeros de ARN pueden ser útiles en el diagnóstico por imágenes. [7] [103] [104]

Debido al proceso SELEX utilizado para seleccionar aptámeros de ARN, se pueden generar aptámeros de ARN para muchos objetivos potenciales. Al introducir directamente los aptámeros de ARN en el objetivo durante SELEX, se puede producir un conjunto homogéneo, muy selectivo y de alta afinidad de aptámeros de ARN. Como tal, se pueden fabricar aptámeros de ARN para apuntar a pequeños péptidos y proteínas, así como a fragmentos celulares, células enteras e incluso tejidos específicos. [7] [86] [105] [106] [98] [107] Ejemplos de dianas moleculares de aptámeros de ARN y dianas potenciales incluyen el factor de crecimiento endotelial vascular , [108] osteoblastos , [109] y el ligando de quimiocina 12 CXC ( CXCL2 ). [7] [8] [110]

La estructura química del aptámero de ARN conocido como Pegaptanib , un tratamiento para la degeneración macular relacionada con la edad . [7]

Un ejemplo de terapia con aptámeros de ARN incluye pegaptanib (también conocido como Macugen ® ), el único tratamiento con aptámeros de ARN aprobado por la FDA. [7] [8] [86] Aprobado originalmente en 2004 para tratar la degeneración macular relacionada con la edad , pegaptanib es un aptámero de ARN de 28 nucleótidos que actúa como antagonista de VEGF . [7] [8] [86] Sin embargo, no es tan eficaz como los tratamientos basados ​​en anticuerpos como bevacizumab y ranibizumab . [86] [111] [112] Otro ejemplo de un aptámero de ARN terapéutico es NOX-A12, un aptámero de ARN de 45 nucleótidos que se encuentra en ensayos clínicos para la leucemia linfocítica crónica , el cáncer de páncreas y otros cánceres. [8] NOX-A12 actúa como antagonista de CXCL12/SDF-1, una quimiocina implicada en el crecimiento tumoral. [8]

Limitaciones

Si bien la alta selectividad y la estrecha unión de los aptámeros de ARN han generado interés en su uso como productos farmacéuticos, existen muchos problemas que les han impedido tener éxito in vivo . Por un lado, sin modificaciones, los aptámeros de ARN se degradan después de ser introducidos en el cuerpo por nucleasas en el lapso de unos pocos minutos. [8] [86] [113] [114] Además, debido a su pequeño tamaño, el sistema renal puede eliminar los aptámeros de ARN del torrente sanguíneo. [8] [86] [87] [113] [114] Debido a su carga negativa, se sabe además que los aptámeros de ARN se unen a proteínas en el torrente sanguíneo, lo que conduce a toxicidad y entrega a tejidos no objetivo. [86] [115] [116] También se debe tener cuidado al aislar los aptámeros de ARN, ya que los aptámeros que contienen secuencias repetidas de citosina-fosfato-guanina (CpG) provocarán la activación del sistema inmunológico a través de la vía del receptor tipo Toll . [8] [117] [118]

Para combatir algunas de las limitaciones in vivo de los aptámeros de ARN, se pueden agregar varias modificaciones a los nucleótidos para ayudar en la eficacia del aptámero. Por ejemplo, se puede unir un resto de polietilenglicol (PEG) para aumentar el tamaño del aptámero, evitando así su eliminación del torrente sanguíneo por el glomérulo renal . [119] [120] Sin embargo, el PEG ha sido implicado en reacciones alérgicas durante las pruebas in vivo . [86] [121] [122] Además, se pueden agregar modificaciones para evitar la degradación de la nucleasa, como un grupo 2' fluoro o amino, así como una timidina invertida 3'. [8] [86] [123] [124] Además, el aptámero se puede sintetizar de modo que el azúcar ribosa esté en la forma L en lugar de la forma D , lo que impide aún más el reconocimiento de la nucleasa. [7] [86] [125] [126] Estos aptámeros se conocen como Spiegelmers . [7] [126] Para prevenir la activación de la vía del receptor tipo Toll, las nucleobases de citosina dentro del aptámero se pueden metilar. [8] Sin embargo, a pesar de estas posibles soluciones para reducir la eficacia in vivo , es posible que la modificación química del aptámero pueda debilitar su afinidad de unión hacia su objetivo. [86] [127]

Ver también

Referencias

  1. ^ Sahin, U.; Karikó, K.; Türeci, Ö. (2014), "terapias basadas en ARNm: desarrollo de una nueva clase de fármacos", Nature Reviews. Descubrimiento de fármacos , 13 (10): 759–780, doi : 10.1038/nrd4278 , PMID  25233993, S2CID  27454546
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enlaces externos

Scholia tiene un perfil para terapias de ARN (Q103741648).