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El ARN antisentido ( asRNA ), también conocido como transcrito antisentido, [1] transcrito antisentido natural (NAT) [2] [3] [4] u oligonucleótido antisentido , [5] es un ARN monocatenario que es complementario a una proteína codificante. ARN mensajero (ARNm) con el que se hibrida y, por tanto, bloquea su traducción en proteína . Los asRNA (que se producen de forma natural) se han encontrado tanto en procariotas como en eucariotas , [1] y se pueden clasificar en ARN no codificantes (ncRNA) cortos (<200 nucleótidos) y largos (>200 nucleótidos). [4] La función principal del ARNas es regular la expresión genética . Los ARNas también pueden producirse sintéticamente y se han utilizado ampliamente como herramientas de investigación para la eliminación de genes . También pueden tener aplicaciones terapéuticas. [6] [1] [4]
Algunos de los primeros asRNA se descubrieron mientras se investigaban proteínas funcionales. Un ejemplo fue micF asRNA . Al caracterizar la porina ompC de la membrana externa en E. coli , algunos de los clones del promotor ompC observados fueron capaces de reprimir la expresión de otras porinas de membrana como ompF. Se descubrió que la región responsable de esta función de represión era un locus de 300 pares de bases aguas arriba del promotor ompC. Esta región de 300 pares de bases tiene una secuencia del 70% homóloga con el extremo 5' del ARNm de ompF y, por tanto, la transcripción de este locus de 300 pares de bases era complementaria al ARNm de ompF. Más tarde, se descubrió que esta transcripción, denominada micF, era un ARNas de ompF y capaz de regular negativamente la expresión de ompF bajo estrés formando un dúplex con el ARNm de ompF. Esto induce la degradación del ARNm de ompF. [2]
A diferencia del descubrimiento accidental del ARN micF, la mayoría de los ARNas se descubrieron mediante búsquedas en todo el genoma de pequeños ARN reguladores y mediante análisis del transcriptoma . Convencionalmente, el primer paso implica predicciones computacionales basadas en algunas características conocidas de los asRNA. Durante las búsquedas computacionales, se excluyen las regiones de codificación. Durante el análisis se prefieren las regiones que se predice que tendrán estructuras de ARN conservadas y actuarán como promotores huérfanos y terminadores independientes de Rho . Debido a que las búsquedas computacionales se centran en la región intergénica , es probable que con este método se pasen por alto los ARNas que se transcriben de la cadena opuesta de un gen codificante. Para detectar ARN as transcrito a partir de la región codificante, se pueden utilizar micromatrices de oligonucleótidos . En este método, se pueden utilizar como sondas una o ambas cadenas de genes codificantes. Además de las búsquedas computacionales y los microarrays, se descubrieron algunos ARNas mediante la secuenciación de clones de ADNc y el mapeo de elementos promotores. [7] Aunque muchos hallazgos de los enfoques mencionados anteriormente dieron lugar a muchos posibles ARNas, se demostró que solo unos pocos eran ARNas reales mediante pruebas funcionales adicionales. Para minimizar el número de resultados falsos positivos, los nuevos enfoques de los últimos años se han centrado en la transcripción de cadena específica, la unión de cromatina a ARN no codificantes y estudios de células individuales. [1]
La idea de los ARNas como objetivos farmacológicos comenzó en 1978, cuando Zamecnik y Stephenson encontraron un oligonucleótido antisentido para el ARN viral del virus del escarcoma de Rous que era capaz de inhibir la replicación viral y la síntesis de proteínas. Desde entonces, se han dedicado muchos esfuerzos al desarrollo de ARNas como candidatos a fármacos. En 1998, la FDA aprobó el primer fármaco de ARNas, fomivirsen . Fomivirsen, un oligonucleótido de 21 pares de bases, fue desarrollado para tratar la retinitis por citomegalovirus en pacientes con SIDA. Actúa dirigiéndose al ARNm transcrito del virus y, en consecuencia, inhibiendo la replicación del citomegalovirus. A pesar de que fomivirsen se suspendió en 2004 debido a la pérdida de mercado, sirvió como un ejemplo exitoso e inspirador del uso de ARNas como objetivos farmacológicos o candidatos a fármacos. [5]
Otro ejemplo del uso de un ARNas como agente terapéutico es el mipomersen , que fue aprobado por la FDA en 2013. Mipomersen se desarrolló para controlar el nivel de colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (LDL) en pacientes con hipercolesterolemia familiar homocigótica (HoFH), que es un Rara condición genética autosómica dominante. Debido al alto nivel de colesterol total (650 a 1 000 mg/dL) y de receptor de LDL (por encima de 600 mg/dL) en HoFH, los pacientes con HoFH tienen un alto riesgo de enfermedad coronaria. Debido a que se ha descubierto que la proteína apo-B-100 es necesaria para producir lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y LDL, el mipomersen se complementa con el ARNm de apo-B-100 y lo dirige a la degradación dependiente de la ARNasa H. En última instancia, mipomersen puede reducir el nivel de LDL. [8]
Los primeros asRNA descubiertos se encontraban en procariotas, incluidos plásmidos , bacteriófagos y bacterias . Por ejemplo, en el plásmido ColE1, el asRNA denominado ARN I juega un papel importante en la determinación del número de copias del plásmido mediante el control de la replicación. La replicación de ColE1 se basa en la transcripción de un cebador de ARN denominado ARN II. Una vez que se transcribe el ARN II, se hibrida con su plantilla de ADN y luego se escinde mediante la RNasa H. En presencia del ARNas, el ARN I, el ARN I y el ARN II forman un dúplex que introduce un cambio conformacional del ARN II. En consecuencia, el ARN II no puede hibridarse con su molde de ADN, lo que da como resultado un número bajo de copias de ColE1. En el bacteriófago P22, el asRNA sar ayuda a regular entre el ciclo lítico y lisogénico al controlar la expresión de Ant. [9] Además de expresarse en procariotas, los ARNas también se descubrieron en plantas. El ejemplo mejor descrito de regulación de ARNas en plantas es el gen Flowering Locus C (FLC) . El gen FLC en Arabidopsis thaliana codifica un factor de transcripción que previene la expresión de una variedad de genes que inducen la transición floral. En ambientes fríos, el ARNas del gen FLC, denominado COOLAIR, se expresa e inhibe la expresión de FLC mediante la modificación de la cromatina, lo que en consecuencia permite la floración. [10] Otro ejemplo bien estudiado es el gen DOG1 (Retraso de la Germinación 1). Su nivel de expresión está regulado negativamente por la transcripción antisentido (asDOG1 o 1GOD) que actúa en cis. [11] En células de mamíferos, un ejemplo típico de regulación de ARNas es la inactivación del cromosoma X. Xist , un ARNas, puede reclutar el complejo represivo 2 de Polycomb (PRC2), lo que da como resultado la heterocromatinización del cromosoma X. [3]
Los ARN antisentido se pueden clasificar de diferentes formas. En cuanto a los mecanismos reguladores, algunos autores agrupan los asRNA en interacciones ARN-ADN, interacciones ARN-ARN ya sea en núcleo o citoplasma e interacciones ARN-proteína ( epigenéticas ). [3] Los ARN antisentido se pueden clasificar por el tipo de promotores que inician la expresión de los ARNas: promotores independientes, promotores bidireccionales compartidos o promotores crípticos. En términos de longitud, aunque los asRNA en general se clasifican como lncRNA , existen asRNA cortos con una longitud inferior a 200 pares de bases. Debido a que el mecanismo regulador de los ARNas es específico de cada especie, los ARNas también se pueden clasificar por especie. [1] Una de las formas comunes de clasificar los asRNA es según el lugar donde se transcriben en relación con sus genes diana: de acción cis y de acción trans . [ cita necesaria ]
Los asRNA que actúan en cis se transcriben desde la hebra opuesta del gen diana en el locus del gen diana. A menudo muestran un alto grado o una complementariedad completa con el gen diana. Si el asRNA que actúa en cis regula la expresión génica dirigiéndose al ARNm, solo puede apuntar al ARNm individual. Tras las interacciones con los ARNm dirigidos, los ARNas que actúan en cis pueden bloquear la unión del ribosoma o reclutar ARNasa para degradar los ARNm dirigidos. En consecuencia, la función de estos ARNas que actúan en cis es reprimir la traducción de los ARNm dirigidos. [2] Además de los ARNas que actúan en cis y que se dirigen a los ARNm, existen activadores y silenciadores epigenéticos que actúan en cis . Se ha demostrado que el ARN antisentido reprime la traducción del dominio LINE1-ORF2 de Entamoeba histolytica . Sin embargo, aún no se ha confirmado si se trata de una actuación cis o trans. [12]
En términos de modificación epigenética, la acción cis se refiere a la naturaleza de estos ARNas que regulan los cambios epigenéticos alrededor de los loci donde se transcriben. En lugar de apuntar a ARNm individuales, estos reguladores epigenéticos que actúan en cis pueden reclutar enzimas modificadoras de la cromatina que pueden ejercer efectos tanto en los loci de transcripción como en los genes vecinos. [3]
Los asRNA de acción trans se transcriben desde loci que están distales a los genes diana. A diferencia de los asRNA que actúan en cis, muestran un bajo grado de complementariedad con el gen diana, pero pueden ser más largos que los asRNA que actúan en cis. También pueden apuntar a múltiples loci. Debido a estas propiedades de los asRNA que actúan en trans, forman complejos menos estables con sus transcripciones de direccionamiento y, a veces, requieren ayuda de la proteína chaperona de ARN , como Hfq, para ejercer sus funciones. Debido a la complejidad de los ARNas que actúan en trans, actualmente se consideran objetivos menos farmacológicos. [2]
Muchos ejemplos de ARNas muestran el efecto inhibidor sobre el inicio de la transcripción mediante modificaciones epigenéticas.
La metilación del ADN puede provocar una regulación negativa a largo plazo de genes específicos. En varias enfermedades humanas se ha encontrado represión de proteínas funcionales mediante la metilación del ADN inducida por ARNas. En una clase de alfa-talasemia , un tipo de trastorno sanguíneo que tiene un nivel reducido de hemoglobina que conduce a una cantidad insuficiente de oxígeno en los tejidos, [13] el gen de la hemoglobina alfa1 (HBA1) está regulado negativamente por una transcripción anormal de la supuesta proteína de unión a ARN Luc7- como (LUC71) que sirve como ARNas para HBA1 e induce la metilación del promotor de HBA1. [1] Otro ejemplo es el silenciamiento de un gen supresor de tumores p15INK4b, también llamado CDKN2B, en la leucemia linfoblástica aguda y la leucemia mieloide aguda. El ARNas responsable de este efecto silenciador es un ARN no codificante antisentido en el locus INK ( ANRIL ), que se expresa en el mismo locus que codifica p15INK4b. [3]
En las células eucariotas, el ADN está estrechamente empaquetado por histonas . La modificación de las histonas puede cambiar las interacciones con el ADN, lo que puede inducir cambios adicionales en la expresión genética . Las consecuencias biológicas de la metilación de histonas dependen del contexto. En general, la metilación de histonas conduce a la represión genética, pero también se puede lograr la activación genética. [14] La evidencia ha demostrado que la metilación de histonas puede ser inducida por ARNas. Por ejemplo, ANRIL, además de la capacidad de inducir la metilación del ADN, también puede reprimir el gen vecino de CDKN2B , CDKN2A , mediante el reclutamiento del complejo represivo Polycomb 2 (PRC2), que conduce a la metilación de histonas (H3K27me). Otro ejemplo clásico es la inactivación del cromosoma X por XIST . [1]
La modificación epigenética inducida por ANRIL es un ejemplo de regulación epigenética que actúa en cis. [3] Además, la modificación de la cromatina inducida por ARN antisentido puede ser de acción trans. Por ejemplo, en los mamíferos, el asRNA HOTAIR se transcribe del locus homeobox C (HOXC), pero recluta PRC2 para HOXD, que deposita H3K27 y silencia HOXD. HOTAIR se expresa altamente en tumores primarios de mama. [1]
Las regulaciones epigenéticas, como la metilación del ADN y la metilación de histonas, pueden reprimir la expresión genética al inhibir el inicio de la transcripción. A veces, sin embargo, la represión genética se puede lograr interrumpiendo prematuramente o ralentizando el proceso de transcripción. Los ARNas pueden participar en este nivel de regulación genética. Por ejemplo, en células bacterianas o eucariotas donde están presentes ARN polimerasas complejas, la transcripción bidireccional en el mismo locus puede provocar una colisión de polimerasas y provocar la terminación de la transcripción. Incluso cuando la colisión de la polimerasa es poco probable durante la transcripción débil, también puede ocurrir una pausa de la polimerasa que bloquea el alargamiento y conduce a la represión genética. Uno de los ejemplos es la represión del gen IME4 por su ARN as RME2. Otra forma de afectar la transcripción de forma cotranscripcional es bloqueando el empalme. Un ejemplo clásico en humanos es el gen homeobox 2 de unión a la caja E con dedos de zinc ( ZEB2 ), que codifica la E-cadherina, un represor transcripcional. La traducción eficiente del ARNm de ZEB2 requiere la presencia de un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) en el intrón del ARNm en el extremo 5' . Al expresarse el ARNas de ZEB2, puede enmascarar el sitio de empalme y mantener el IRES en el ARNm, lo que da como resultado una síntesis eficiente de E-cadherina. Por último, dependiendo del nivel de expresión de asRNA, se pueden producir diferentes isoformas del transcrito sentido. Por lo tanto, la regulación dependiente de asRNA no se limita al mecanismo de activación/desactivación; más bien, presenta un fino sistema de control de tono. [1]
La modulación postranscripcional directa por los ARNas se refiere a los ARNm dirigidos directamente por los ARNas; por tanto, la traducción se ve afectada. Algunas características de este tipo de asRNA se describen en los asRNA que actúan en cis y trans. Este mecanismo es relativamente rápido porque tanto el ARNm objetivo como su ARNas deben estar presentes simultáneamente en la misma célula. Como se describe en los ARNas que actúan en cis, el emparejamiento ARNm-ARNas puede provocar el bloqueo de la entrada a los ribosomas y la degradación dependiente de la ARNasa H. En general, los ARNm dirigidos a ARNm pueden activar o inhibir la traducción de los ARNm sentidos, siendo el efecto inhibidor el más abundante. [1]
Como elemento regulador, los ARNas tienen muchas ventajas para ser considerados como diana farmacológica. En primer lugar, los ARNas regulan la expresión genética en múltiples niveles, incluida la transcripción, la postranscripción y la modificación epigenética. En segundo lugar, los asRNA que actúan en cis son específicos de secuencia y exhiben un alto grado de complementariedad con los genes diana. [1] En tercer lugar, el nivel de expresión de los ARNas es muy pequeño en comparación con el de los ARNm dirigidos; por lo tanto, sólo se requiere una pequeña cantidad de ARNas para producir un efecto. En términos de objetivos farmacológicos, esto representa una gran ventaja porque sólo se requiere una dosis baja para que sea eficaz. [4]
En los últimos años, la idea de apuntar a los ARNas para aumentar la expresión genética de una manera específica de un locus ha llamado mucho la atención. Debido a la naturaleza del desarrollo de fármacos , siempre es más fácil que los fármacos funcionen como reguladores negativos o inhibidores. Sin embargo, existe la necesidad de desarrollar fármacos que puedan activar o regular positivamente la expresión genética, como genes supresores de tumores, factores de crecimiento neuroprotectores y genes que se encuentran silenciados en ciertos trastornos mendelianos. Actualmente, el enfoque para restaurar la expresión génica o la función proteica deficiente incluye terapias de reemplazo enzimático, terapias con microARN y administración de ADNc funcional. Sin embargo, cada uno tiene algunos inconvenientes. Por ejemplo, la proteína sintetizada utilizada en las terapias de reemplazo enzimático a menudo no puede imitar la función completa de la proteína endógena. Además, las terapias de reemplazo enzimático son un compromiso de por vida y conllevan una gran carga financiera para el paciente. Debido a la naturaleza específica del locus de los ARNas y a las evidencias de cambios en la expresión de los ARNas en muchas enfermedades, ha habido intentos de diseñar oligonucleótidos monocatenarios, denominados antagoNAT, para inhibir los ARNas y, en última instancia, aumentar la expresión de genes específicos. [4]
A pesar de las promesas de los ARNas como objetivos farmacológicos o candidatos a fármacos, aún quedan algunos desafíos por abordar. [15] En primer lugar, los ARNas y los antagoNAT pueden degradarse fácilmente mediante la RNasa u otras enzimas degradantes. Para evitar la degradación de los oliogoneucleótidos terapéuticos, normalmente se requiere una modificación química. La modificación química más común de los oligonucleótidos es agregar un enlace fosforotioato a la columna vertebral. [5] Sin embargo, la modificación del fosfrotioato puede ser proinflamatoria. Se han observado efectos adversos, como fiebre, escalofríos o náuseas, después de la inyección local de oligonucleótidos modificados con fosfrotioato. En segundo lugar, la toxicidad fuera del objetivo también representa un gran problema. A pesar de la naturaleza específica del locus de los ARN as endógenos, solo entre el 10 y el 50% de los oligonucleótidos sintetizados mostraron el efecto de orientación esperado. Una posible razón de este problema es el alto requisito de que la estructura de los asRNA sea reconocida por la secuencia objetivo y la RNasa H. Una sola falta de coincidencia puede provocar una distorsión en la estructura secundaria y provocar efectos fuera del objetivo. [4] Por último, se ha demostrado que los ARNas artificiales tienen una absorción intracelular limitada. [5] Aunque se ha demostrado que las neuronas y la glía tienen la capacidad de captar libremente oligonucleótidos antisentido desnudos, portadores rastreables como virus y vesículas lipídicas seguirían siendo ideales para controlar y monitorear la concentración intracelular y el metabolismo. [4]