La necesidad de rastrear el ARN mediante fluorescencia aumentó a medida que sus roles en funciones celulares complejas crecieron para incluir no solo ARNm , ARNr y ARNt , sino también ARNi , ARNi , ARNsno y ARNlnc , entre otros. [1] [2] Spinach es un aptámero de ARN derivado sintéticamente que nació de la necesidad de una forma de estudiar el papel de los ARN a nivel celular. [3] Este aptámero se creó utilizando Evolución Sistemática para Ligandos por enriquecimiento exponencial, o SELEX , que también se conoce como evolución in vitro. [4]
El aptámero fue diseñado para ser un imitador de ARN de la proteína fluorescente verde (GFP); de manera similar a la GFP para las proteínas, Spinach se puede utilizar para etiquetar ARN con fluorescencia y rastrearlo in vivo. Existe un método para insertar la secuencia de Spinach después de una secuencia de ARN de interés. [5] [6]
El fluoróforo de GFP está formado por tres aminoácidos ciclados dentro de la estructura de barril beta: Serina65-Tirosina66-Glicina67. Esta estructura, 4-hidroxibencilideno imidazolinona (HBI), fue la base del análogo sintético utilizado en los estudios SELEX. Se examinaron muchos derivados de esta estructura utilizando SELEX, pero el fluoróforo elegido, 3,5-difluoro-4-hidroxibencilideno imidazolinona (DFHBI), mostró la mejor fluorescencia selectiva con un alto rendimiento cuántico (0,72) cuando se unió a la secuencia de ARN 24-2, denominada Spinach.
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Se determinó que el DFHBI solo se une a la espinaca en forma de fenolato. A un pH < 6,0, se detectan tanto la forma fenólica como la de fenolato. A un pH = 6,0, solo se detecta el pico de fenolato. El DFHBI también es increíblemente robusto y resiste el fotoblanqueo durante un largo período de tiempo en comparación con el HBI y el EGFP. Se cree que el libre intercambio de ligando unido y no unido permite esta persistencia. Como el fluoróforo de GFP y sus derivados están unidos covalentemente a una parte de la proteína, el libre intercambio no puede ocurrir y, por lo tanto, se produce el fotoblanqueo.
La espinaca es una estructura de 84 nucleótidos de longitud con dos hebras helicoidales y un abultamiento interno con un motivo G-quadruplex . Es en este G-quadruplex donde se une el fluoróforo. Según los datos cristalográficos, se produce una reorganización masiva de las bases adyacentes una vez que el fluoróforo se une para acomodar la molécula. Sin embargo, esta unión es favorable, ya que promueve el apilamiento de bases en una región normalmente inestable, es decir, el abultamiento interno. Al igual que la GFP, el DFHBI también está deshidratado, lo que ayudaría a su alto rendimiento cuántico.
La espinaca también se ha adaptado para detectar proteínas o moléculas in vivo. Una estructura adaptada, que incluye dos sitios de unión, limita la fluorescencia del aptámero a (1) el fluoróforo y (2) la proteína o molécula pequeña.