La electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio ( SDS-PAGE , por sus siglas en inglés) es un sistema electroforético discontinuo desarrollado por Ulrich K. Laemmli que se utiliza comúnmente como método para separar proteínas con masas moleculares entre 5 y 250 kDa . [1] [2] El uso combinado de dodecil sulfato de sodio (SDS, también conocido como lauril sulfato de sodio) y gel de poliacrilamida elimina la influencia de la estructura y la carga, y las proteínas se separan por diferencias en su tamaño. Al menos hasta 2012, la publicación que lo describía era el artículo más citado por un solo autor y el segundo más citado en general. [3]
La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS-PAGE es un método de electroforesis que permite la separación de proteínas por masa. El medio (también denominado "matriz") es un gel discontinuo a base de poliacrilamida. El gel de poliacrilamida normalmente se coloca entre dos placas de vidrio en un gel en placa. Aunque históricamente se utilizaban geles en tubos (en cilindros de vidrio), rápidamente se volvieron obsoletos con la invención de los geles en placa más convenientes. [4] Además, se utiliza SDS ( dodecil sulfato de sodio ). Aproximadamente 1,4 gramos de SDS se unen a un gramo de proteína, [5] [6] [7] correspondientes a una carga de molécula de SDS por dos aminoácidos . [8] El SDS actúa como un surfactante , enmascarando la carga intrínseca de la proteína y confiriendo a estas relaciones carga-masa muy similares. Las cargas intrínsecas de las proteínas son insignificantes en comparación con la carga de SDS, y las cargas positivas también se reducen considerablemente en el rango de pH básico de un gel separador. Al aplicar un campo eléctrico constante, las proteínas migran hacia el ánodo, cada una con una velocidad diferente, dependiendo de su masa. Este procedimiento simple permite una separación precisa de las proteínas por masa.
El SDS tiende a formar micelas esféricas en soluciones acuosas por encima de una cierta concentración llamada concentración micelar crítica (CMC). Por encima de la concentración micelar crítica de 7 a 10 milimolar en soluciones, el SDS se presenta simultáneamente como moléculas individuales ( monómero ) y como micelas, por debajo de la CMC, el SDS se presenta solo como monómeros en soluciones acuosas. En la concentración micelar crítica, una micela consta de aproximadamente 62 moléculas de SDS. [9] Sin embargo, solo los monómeros de SDS se unen a las proteínas a través de interacciones hidrófobas, mientras que las micelas de SDS son aniónicas en el exterior y no adsorben ninguna proteína. [5] El SDS es anfipático por naturaleza, lo que le permite desplegar secciones polares y no polares de la estructura de la proteína. [10] En concentraciones de SDS superiores a 0,1 milimolar, comienza el despliegue de las proteínas, [5] y por encima de 1 mM, la mayoría de las proteínas se desnaturalizan. [5] Debido al fuerte efecto desnaturalizante del SDS y la posterior disociación de los complejos proteicos, las estructuras cuaternarias generalmente no se pueden determinar con SDS. Las excepciones son las proteínas que se estabilizan mediante enlaces cruzados covalentes (por ejemplo, enlaces -SS-) y los complejos proteicos resistentes al SDS, que son estables incluso en presencia de SDS (estos últimos, sin embargo, solo a temperatura ambiente). Para desnaturalizar los complejos resistentes al SDS se requiere una alta energía de activación, que se logra mediante calentamiento. La resistencia al SDS se basa en una metaestabilidad del pliegue proteico. Aunque la proteína nativa, completamente plegada y resistente al SDS no tiene suficiente estabilidad en presencia de SDS, el equilibrio químico de la desnaturalización a temperatura ambiente ocurre lentamente. Los complejos proteicos estables se caracterizan no solo por la resistencia al SDS sino también por la estabilidad frente a las proteasas y una vida media biológica aumentada . [11]
Como alternativa, también se puede realizar una electroforesis en gel de poliacrilamida con los surfactantes catiónicos CTAB en una CTAB-PAGE, [12] [13] [14] o 16-BAC en una BAC-PAGE. [15]
El método SDS-PAGE se compone de preparación del gel, preparación de la muestra, electroforesis, tinción de proteínas o Western blotting y análisis del patrón de bandas generado.
En caso de utilizar diferentes tampones en el gel (electroforesis en gel discontinua), los geles se preparan hasta un día antes de la electroforesis, de modo que la difusión no provoque una mezcla de los tampones. El gel se produce mediante polimerización por radicales libres en un molde que consta de dos placas de vidrio selladas con espaciadores entre las placas de vidrio. En una configuración típica de minigel, los espaciadores tienen un grosor de 0,75 mm o 1,5 mm, lo que determina la capacidad de carga del gel. Para verter la solución de gel, las placas se sujetan normalmente en un soporte que sella temporalmente la parte inferior de las placas de vidrio, que de otro modo estaría abierta, con los dos espaciadores. Para la solución de gel, se mezcla acrilamida como formador de gel (normalmente 4 % V/V en el gel de apilamiento y 10-12 % en el gel de separación), metilenbisacrilamida como reticulante, tampón de gel de apilamiento o separación, agua y SDS. Mediante la adición del catalizador TEMED y el iniciador de radicales persulfato de amonio (APS) se inicia la polimerización. [16] A continuación, la solución se vierte entre las placas de vidrio sin crear burbujas. Dependiendo de la cantidad de catalizador y de iniciador de radicales y de la temperatura, la polimerización dura entre un cuarto de hora y varias horas. El gel inferior (gel separador) se vierte primero y se cubre con unas gotas de un alcohol apenas soluble en agua (normalmente butanol o isopropanol saturado de tampón), que elimina las burbujas del menisco y protege la solución de gel del eliminador de radicales oxígeno. Después de la polimerización del gel separador, se descarta el alcohol y el alcohol residual se elimina con papel de filtro . Después de la adición de APS y TEMED a la solución de gel de apilamiento, se vierte sobre el gel de separación sólido. Después, se inserta un peine de muestra adecuado entre las placas de vidrio sin crear burbujas. El peine de muestra se extrae con cuidado después de la polimerización, dejando bolsillos para la aplicación de la muestra. Para el uso posterior de proteínas para la secuenciación de proteínas , los geles a menudo se preparan el día antes de la electroforesis para reducir las reacciones de la acrilamida no polimerizada con las cisteínas en las proteínas.
Mediante el uso de un mezclador de gradiente, se pueden moldear geles de gradiente con un gradiente de acrilamida (generalmente del 4 al 12 %), que tienen un rango de separación más amplio de las masas moleculares. [17] Los sistemas de gel comerciales (los llamados geles prefabricados ) generalmente utilizan la sustancia tampón Bis-tris metano con un valor de pH entre 6,4 y 7,2 tanto en el gel de apilamiento como en el gel de separación. [18] [19] Estos geles se entregan moldeados y listos para usar. Dado que utilizan solo un tampón (electroforesis en gel continua) y tienen un pH casi neutro, se pueden almacenar durante varias semanas. El pH más neutro ralentiza la hidrólisis y, por lo tanto, la descomposición de la poliacrilamida. Además, hay menos cisteínas modificadas con acrilamida en las proteínas. [18] Debido al pH constante en el gel de recolección y separación, no hay efecto de apilamiento. Las proteínas en geles Bis-Tris no se pueden teñir con complejos de rutenio. [20] Este sistema de gel tiene un rango de separación comparativamente grande, que se puede variar utilizando MES o MOPS en el tampón de ejecución. [18]
Durante la preparación de la muestra, se añade en exceso el tampón de muestra, y por tanto el SDS, a las proteínas, y después la muestra se calienta a 95 °C durante cinco minutos, o alternativamente a 70 °C durante diez minutos. El calentamiento altera las estructuras secundarias y terciarias de la proteína al romper los enlaces de hidrógeno y estirar las moléculas. Opcionalmente, los puentes disulfuro se pueden escindir por reducción. Para este fin, se añaden al tampón de muestra tioles reductores como β-mercaptoetanol (β-ME, 5 % en volumen), ditiotreitol (DTT, 10-100 milimolar), [21] ditioeritritol (DTE, 10 milimolar), tris(2-carboxietil)fosfina [22] o tributilfosfina [21] . Después de enfriar a temperatura ambiente, cada muestra se pipetea en su propio pocillo en el gel, que se sumergió previamente en el tampón de electroforesis en el aparato de electroforesis.
Además de las muestras, normalmente se carga en el gel un marcador de tamaño de peso molecular . Este consiste en proteínas de tamaños conocidos y, por lo tanto, permite la estimación (con un error de ± 10 %) de los tamaños de las proteínas en las muestras reales, que migran en paralelo en diferentes pistas del gel. [23] El marcador de tamaño a menudo se pipetea en el primer o último bolsillo de un gel.
Para la separación, las muestras desnaturalizadas se cargan en un gel de poliacrilamida, que se coloca en un tampón de electroforesis con electrolitos adecuados. A continuación, se aplica un voltaje (normalmente alrededor de 100 V, 10-20 V por cm de longitud de gel), que provoca una migración de moléculas cargadas negativamente a través del gel en dirección al ánodo cargado positivamente . El gel actúa como un tamiz. Las proteínas pequeñas migran con relativa facilidad a través de la malla del gel, mientras que las proteínas más grandes tienen más probabilidades de quedar retenidas y, por lo tanto, migran más lentamente a través del gel, lo que permite separar las proteínas por tamaño molecular. La electroforesis dura entre media hora y varias horas, dependiendo del voltaje y la longitud del gel utilizado.
Las proteínas que migran más rápido (con un peso molecular inferior a 5 kDa) forman el frente del tampón junto con los componentes aniónicos del tampón de electroforesis, que también migran a través del gel. La zona del frente del tampón se hace visible añadiendo el colorante aniónico comparativamente pequeño azul de bromofenol al tampón de muestra. Debido al tamaño molecular relativamente pequeño del azul de bromofenol, migra más rápido que las proteínas. Mediante el control óptico de la banda de color migratoria, la electroforesis se puede detener antes de que el colorante y también las muestras hayan migrado completamente a través del gel y lo abandonen.
El método más comúnmente utilizado es la SDS-PAGE discontinua. [24] [25] En este método, las proteínas migran primero a un gel colector con pH neutro, en el que se concentran y luego migran a un gel separador con pH básico, en el que tiene lugar la separación real. Los geles de apilamiento y separación se diferencian por el tamaño de poro diferente (4-6 % T y 10-20 % T), la fuerza iónica y los valores de pH (pH 6,8 o pH 8,8). El electrolito utilizado con más frecuencia es un sistema tampón Tris - glicina - cloruro que contiene SDS . A pH neutro, la glicina forma predominantemente la forma zwitteriónica , a pH alto las glicinas pierden cargas positivas y se vuelven predominantemente aniónicas. En el gel de recolección, los iones de cloruro más pequeños, cargados negativamente, migran por delante de las proteínas (como iones líderes) y los iones de glicinato, ligeramente más grandes, cargados negativamente y parcialmente positivamente, migran por detrás de las proteínas (como iones finales iniciales), mientras que en el gel de separación, comparativamente básico, ambos iones migran por delante de las proteínas. El gradiente de pH entre los tampones del gel de apilamiento y de separación produce un efecto de apilamiento en el límite del gel de apilamiento con el gel de separación, ya que el glicinato pierde parcialmente sus cargas positivas de desaceleración a medida que aumenta el pH y luego, a medida que el antiguo ion final se apodera de las proteínas y se convierte en un ion líder, lo que hace que las bandas de las diferentes proteínas (visibles después de una tinción) se vuelvan más estrechas y nítidas: el efecto de apilamiento. Para la separación de proteínas y péptidos más pequeños, se utiliza el sistema de tampón TRIS- Tricine de Schägger y von Jagow debido a la mayor dispersión de las proteínas en el rango de 0,5 a 50 kDa. [26]
Al final de la separación electroforética, todas las proteínas se clasifican por tamaño y luego se pueden analizar por otros métodos, por ejemplo, tinción de proteínas como la tinción de Coomassie (la más común y fácil de usar), [27] [28] tinción de plata (la más alta sensibilidad), [29] [30] [31] [32] [33 ] [34] tinciones de todos los colores, tinción Amido black 10B , [28] tinción Fast Green FCF , [28] tinciones fluorescentes como la tinción de epicocconona [35] y la tinción SYPRO orange, [36] y detección inmunológica como el Western Blot . [37] [38] Los colorantes fluorescentes tienen una linealidad comparativamente mayor entre la cantidad de proteína y la intensidad del color de aproximadamente tres órdenes de magnitud por encima del límite de detección (la cantidad de proteína que se puede estimar por la intensidad del color). Cuando se utiliza el colorante proteico fluorescente tricloroetanol , se omite la tinción posterior de la proteína si se agregó a la solución de gel y el gel se irradió con luz UV después de la electroforesis. [39] [40]
En la tinción de Coomassie , el gel se fija en una solución de 50% de etanol y 10% de ácido acético glacial durante 1 hora. Luego, la solución se cambia por una nueva y, después de 1 a 12 horas, el gel se cambia por una solución de tinción (50% de metanol, 10% de ácido acético glacial, 0,1% de azul brillante de Coomassie) seguida de una decoloración cambiando varias veces una solución decolorante de 40% de metanol y 10% de ácido acético glacial.
La tinción de proteínas en el gel crea un patrón de bandas documentable de las distintas proteínas.
La documentación del patrón de bandas se realiza habitualmente mediante fotografía o escaneo. Para una posterior recuperación de las moléculas en bandas individuales, se puede realizar una extracción en gel .
Después de la tinción de proteínas y la documentación del patrón de bandas, el gel de poliacrilamida se puede secar para su almacenamiento en archivo. [43] Las proteínas se pueden extraer de él en una fecha posterior. El gel se coloca en un marco de secado (con o sin el uso de calor) o en un secador de vacío. El marco de secado consta de dos partes, una de las cuales sirve como base para una película de celofán húmeda a la que se agregan el gel y una solución de glicerol al uno por ciento . Luego se aplica una segunda película de celofán húmeda sin burbujas, la segunda parte del marco se coloca encima y el marco se sella con clips. La eliminación de las burbujas de aire evita una fragmentación del gel durante el secado. El agua se evapora a través de la película de celofán. A diferencia del marco de secado, un secador de vacío genera un vacío y calienta el gel a aproximadamente 50 °C.
Para una determinación más precisa del peso molecular, se miden las distancias de migración relativas de las bandas de proteína individuales en el gel de separación. [44] [45] Las mediciones se realizan normalmente por triplicado para una mayor precisión. La movilidad relativa (denominada valor Rf o valor Rm) se define como la distancia migrada por la banda de proteína dividida por la distancia migrada por el frente del tampón. Las distancias se miden cada una desde el comienzo del gel de separación. La migración del frente del tampón corresponde aproximadamente a la migración del colorante contenido en el tampón de muestra. Los Rf del marcador de tamaño se representan de forma semilogarítmica frente a sus pesos moleculares conocidos. Mediante la comparación con la parte lineal del gráfico generado o mediante un análisis de regresión, se puede determinar el peso molecular de una proteína desconocida por su movilidad relativa. [44] [46]
Las bandas de proteínas con glicosilaciones pueden verse borrosas, [41] ya que la glicosilación suele ser heterogénea. [47] Las proteínas con muchos aminoácidos básicos (p. ej. , histonas ) [48] pueden provocar una sobreestimación del peso molecular o incluso no migrar al gel en absoluto, porque se mueven más lentamente en la electroforesis debido a las cargas positivas o incluso en la dirección opuesta. Por otro lado, muchos aminoácidos ácidos pueden provocar una migración acelerada de una proteína y una subestimación de su masa molecular. [49]
La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS en combinación con un colorante de proteínas se utiliza ampliamente en bioquímica para la separación rápida y exacta y el posterior análisis de proteínas. Tiene costos comparativamente bajos de instrumentos y reactivos y es un método fácil de usar. Debido a su baja escalabilidad , se utiliza principalmente para fines analíticos y menos para fines preparativos, especialmente cuando se deben aislar grandes cantidades de una proteína.
Además, la SDS-PAGE se utiliza en combinación con el western blot para la determinación de la presencia de una proteína específica en una mezcla de proteínas, o para el análisis de modificaciones postraduccionales . [50] [51] Las modificaciones postraduccionales de las proteínas pueden conducir a una movilidad relativa diferente (es decir, un cambio de banda ) o a un cambio en la unión de un anticuerpo de detección utilizado en el western blot (es decir, una banda desaparece o aparece).
En la espectrometría de masas de proteínas, la electroforesis en gel SDS-PAGE es un método ampliamente utilizado para la preparación de muestras antes de la espectrometría, en su mayoría mediante digestión en gel . En lo que respecta a la determinación de la masa molecular de una proteína, la electroforesis en gel SDS-PAGE es un poco más exacta que una ultracentrifugación analítica , pero menos exacta que una espectrometría de masas o, ignorando las modificaciones postraduccionales, un cálculo de la masa molecular de la proteína a partir de la secuencia de ADN .
En el diagnóstico médico, la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS se utiliza como parte de la prueba del VIH y para evaluar la proteinuria . En la prueba del VIH, las proteínas del VIH se separan mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS y, posteriormente, se detectan mediante Western Blot con anticuerpos específicos del VIH del paciente, si están presentes en su suero sanguíneo . La electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS para la proteinuria evalúa los niveles de varias proteínas séricas en la orina, por ejemplo , albúmina , alfa-2-macroglobulina e IgG .
La electroforesis en gel SDS-PAGE es el método más utilizado para la separación electroforética de proteínas en gel. La electroforesis en gel bidimensional combina secuencialmente el enfoque isoeléctrico o BAC-PAGE con una electroforesis en gel SDS-PAGE. [52] [53] La electroforesis en gel nativa se utiliza si se desea mantener el plegamiento de proteínas nativas. Para la separación de proteínas de membrana, se puede utilizar BAC-PAGE o CTAB-PAGE como alternativa a la electroforesis en gel SDS-PAGE. Para la separación electroforética de complejos proteicos más grandes, se puede utilizar la electroforesis en gel de agarosa , por ejemplo, la electroforesis en gel SDD-AGE . Algunas enzimas se pueden detectar a través de su actividad enzimática mediante zimografía . [54]
Aunque es uno de los métodos de separación y análisis de proteínas más precisos y de bajo coste, la SDS-PAGE desnaturaliza las proteínas. Cuando son necesarias condiciones no desnaturalizantes, las proteínas se separan mediante una PAGE nativa o diferentes métodos cromatográficos con cuantificación fotométrica posterior , por ejemplo, cromatografía de afinidad (o incluso purificación por afinidad en tándem ), cromatografía de exclusión por tamaño , cromatografía de intercambio iónico . [55] Las proteínas también se pueden separar por tamaño en una filtración de flujo tangencial [56] o una ultrafiltración . [57] Las proteínas individuales se pueden aislar de una mezcla mediante cromatografía de afinidad o mediante un ensayo pull-down . Algunos métodos de separación históricamente tempranos y rentables pero rudimentarios generalmente se basan en una serie de extracciones y precipitaciones utilizando moléculas cosmotrópicas , por ejemplo, la precipitación con sulfato de amonio y la precipitación con polietilenglicol .
En 1948, Arne Tiselius recibió el Premio Nobel de Química por el descubrimiento del principio de la electroforesis como la migración de átomos o moléculas cargados y disueltos en un campo eléctrico. [58] El uso de una matriz sólida (inicialmente discos de papel) en una electroforesis de zona mejoró la separación. La electroforesis discontinua de 1964 de L. Ornstein y BJ Davis hizo posible mejorar la separación por el efecto de apilamiento. [59] El uso de hidrogeles de poliacrilamida reticulados, en contraste con los discos de papel o geles de almidón utilizados anteriormente, proporcionó una mayor estabilidad del gel y ninguna descomposición microbiana. El efecto desnaturalizante del SDS en geles de poliacrilamida continuos y la consiguiente mejora en la resolución fue descrito por primera vez en 1965 por David F. Summers en el grupo de trabajo de James E. Darnell para separar proteínas de poliovirus. [60] La variante actual de la SDS-PAGE fue descrita en 1970 por Ulrich K. Laemmli y utilizada inicialmente para caracterizar las proteínas de la cabeza del bacteriófago T4 . [1]
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