La precipitación con sulfato de amonio es uno de los métodos más comúnmente utilizados para la purificación y fraccionamiento de proteínas a gran escala y en laboratorio, y puede utilizarse para separar proteínas alterando su solubilidad en presencia de una alta concentración de sal.
El sulfato de amonio es una sal inorgánica con una alta solubilidad que se disocia en amonio ( NH+
4) y sulfato ( SO2−
4) en soluciones acuosas. [1] El sulfato de amonio es especialmente útil como precipitante porque es altamente soluble, estabiliza la estructura de las proteínas, tiene una densidad relativamente baja, está fácilmente disponible y es relativamente económico.
El sulfato de amonio, así como otras sales neutras, estabilizan las proteínas mediante solvatación preferencial . Las proteínas suelen almacenarse en sulfato de amonio porque inhibe el crecimiento bacteriano. Con la adición de sulfato de amonio, las proteínas desdobladas por desnaturalizantes pueden ser empujadas a sus conformaciones nativas. Esto se puede ver con el plegamiento de proteínas recombinantes. [2]
La solubilidad de las proteínas varía según la fuerza iónica de la solución, es decir, según la concentración de sal. A bajas concentraciones de iones (menos de 0,5 mol/L), la solubilidad de las proteínas aumenta con el aumento de la concentración de sal, un efecto denominado " salación ". A medida que aumenta aún más la concentración de sal, la solubilidad de la proteína comienza a disminuir. A una fuerza iónica suficientemente alta, la proteína precipitará fuera de la solución, un efecto denominado " salación ". [3] Cuando el amonio ( NH+
4) y sulfato ( SO2−
4) Los iones que se encuentran en la solución acuosa son atraídos por las cargas opuestas evidentes en el compuesto que se está purificando. Esta atracción de cargas opuestas impide que las moléculas de agua interactúen con el compuesto que se está purificando, lo que conduce a la precipitación o "salinización". [2]
Las proteínas difieren notablemente en sus solubilidades a alta fuerza iónica, por lo tanto, la "salificación" es un procedimiento muy útil para ayudar en la purificación de la proteína deseada. El sulfato de amonio se usa comúnmente para la precipitación debido a su alta solubilidad, además, forma dos iones altos en la serie de Hofmeister . Debido a que estos dos iones están al final de la serie de Hofmeister, el sulfato de amonio también puede estabilizar la estructura de una proteína. [3] El comportamiento de solubilidad del sulfato de amonio para una proteína generalmente se expresa como una función del porcentaje de saturación. Una curva de solubilidad se puede determinar trazando el logaritmo de la solubilidad determinada experimentalmente, expresada como mg/mL, versus el porcentaje de saturación del sulfato de amonio. [4]
En el mecanismo de la salinización, se produce una omisión de la sal de la capa de agua, que está estrechamente asociada con la superficie de la proteína, conocida como capa de hidratación. La capa de hidratación desempeña un papel vital en el mantenimiento de la solubilidad y la conformación natural adecuada. Hay tres interacciones principales entre la proteína y el agua: hidratación iónica entre cadenas laterales cargadas, enlaces de hidrógeno entre grupos polares y agua, e hidratación hidrófoba. Una vez que se añade sal a la mezcla, se produce un aumento de la tensión superficial del agua, lo que aumenta las interacciones hidrófobas entre el agua y la proteína de interés. La proteína de interés reduce entonces su área superficial, lo que disminuye su contacto con el disolvente. Esto se demuestra por el plegamiento y la autoasociación, que en última instancia conduce a la precipitación. El plegamiento y la autoasociación de la proteína expulsan el agua libre, lo que conduce a un aumento de la entropía y hace que este proceso sea energéticamente favorable. [2]
Por lo general, la concentración de sulfato de amonio se aumenta gradualmente y la proteína precipitada se recupera en cada etapa. Esto se hace generalmente agregando sulfato de amonio sólido; sin embargo, calcular la cantidad de sulfato de amonio que se debe agregar a una solución para lograr la concentración deseada puede ser difícil porque la adición de sulfato de amonio aumenta significativamente el volumen de la solución. La cantidad de sulfato de amonio que se debe agregar a la solución se puede determinar a partir de nomogramas publicados o utilizando una calculadora en línea. [5] La adición directa de sulfato de amonio sólido cambia el pH de la solución, lo que puede provocar la pérdida de actividad enzimática. [6] En esos casos, la adición de sulfato de amonio saturado en un tampón adecuado se utiliza como una alternativa a la adición de sulfato de amonio sólido. En cualquiera de los enfoques, el precipitado de proteína resultante se puede disolver individualmente en un tampón estándar y analizar para determinar el contenido total de proteína.
La concentración de sulfato de amonio añadida debe aumentarse hasta un valor que precipite la mayor parte de la proteína de interés y deje la máxima cantidad de contaminantes proteicos en la solución. La proteína de interés precipitada puede recuperarse posteriormente mediante centrifugación y disolverse en un tampón estándar para preparar la muestra para la siguiente etapa de purificación.
En la siguiente etapa de purificación, es necesario eliminar toda esta sal añadida de la proteína. Una forma de hacerlo es mediante diálisis, pero la diálisis diluye aún más la proteína concentrada. La mejor forma de eliminar el sulfato de amonio de la proteína es mezclar la proteína precipitada en un tampón que contenga una mezcla de SDS, Tris-HCl y fenol y centrifugar la mezcla. El precipitado que sale de esta centrifugación contendrá proteína concentrada sin sal. [7]
La precipitación con sulfato de amonio es una técnica útil como paso inicial en la purificación de proteínas porque permite una precipitación rápida y masiva de proteínas celulares. [4] También se emplea a menudo durante las últimas etapas de la purificación para concentrar proteínas a partir de una solución diluida siguiendo procedimientos como la filtración en gel . El inconveniente de este método es que a menudo pueden precipitar diferentes sustancias junto con la proteína, y se deben realizar otras técnicas de purificación, como la cromatografía iónica o la cromatografía de exclusión por tamaño . [3]