En biología molecular , la extracción en gel o el aislamiento en gel es una técnica utilizada para aislar un fragmento deseado de ADN intacto de un gel de agarosa después de una electroforesis en gel de agarosa . Después de la extracción, los fragmentos de interés se pueden mezclar, precipitar y ligar enzimáticamente en varios pasos simples. Este proceso, normalmente realizado sobre plásmidos , es la base de la ingeniería genética rudimentaria .
Después de que las muestras de ADN se procesan en un gel de agarosa, la extracción implica cuatro pasos básicos: identificar los fragmentos de interés, aislar las bandas correspondientes, aislar el ADN de esas bandas y eliminar las sales y el tinte que las acompañan.
Para comenzar, se ilumina el gel con luz ultravioleta para iluminar todo el ADN teñido con bromuro de etidio . Se debe tener cuidado para evitar exponer el ADN a radiación mutagénica durante más tiempo del absolutamente necesario. La banda deseada se identifica y se retira físicamente con un cubreobjetos o una hoja de afeitar . La porción de gel extraída debe contener el ADN deseado en su interior. Un método alternativo, que utiliza tinción en gel SYBR Safe DNA e iluminación con luz azul, evita el daño al ADN asociado con el bromuro de etidio y la luz ultravioleta. [1]
Existen varias estrategias para aislar y limpiar el fragmento de ADN de interés.
Varios fabricantes importantes de biotecnología ofrecen kits de extracción en gel por un costo final de aproximadamente 1 a 2 dólares estadounidenses por muestra. Los protocolos incluidos en estos kits generalmente exigen la disolución del gel-slice en 3 volúmenes de agente caotrópico a 50 °C, seguido de la aplicación de la solución a una columna de centrifugación (el ADN permanece en la columna), una solución de etanol al 70 % lavado (el ADN permanece en la columna, la sal y las impurezas se eliminan) y elución del ADN en un pequeño volumen (30 μL) de agua o tampón. [2]
El fragmento de gel se coloca en un tubo de diálisis que es permeable a los fluidos pero impermeable a moléculas del tamaño del ADN, evitando así que el ADN atraviese la membrana cuando se sumerge en tampón TE . Se establece un campo eléctrico alrededor del tubo (de forma similar a la electroforesis en gel) de duración suficiente para que el ADN se retire del gel pero permanezca en el tubo. Luego se puede pipetear la solución del tubo y contendrá el ADN deseado con un fondo mínimo.
El método tradicional de extracción de gel consiste en crear una bolsa doblada de papel encerado Parafilm y colocar el fragmento de agarosa en su interior. La agarosa se comprime físicamente con un dedo en una esquina del bolsillo, licuando parcialmente el gel y su contenido. Luego, las gotas de líquido se pueden dirigir fuera del bolsillo hacia una pieza exterior de Parafilm, donde se pipetean en un tubo pequeño. Una extracción con butanol elimina la mancha de bromuro de etidio, seguida de una extracción con fenol/cloroformo del fragmento de ADN limpio.
La desventaja del aislamiento en gel es que el fondo sólo se puede eliminar si se puede identificar físicamente mediante luz ultravioleta. Si dos bandas están muy juntas, puede resultar difícil separarlas sin cierta contaminación. Para identificar claramente la banda de interés, pueden ser necesarios resúmenes de restricción adicionales. Los sitios de restricción exclusivos de bandas no deseadas de tamaño similar pueden ayudar a eliminar estos contaminantes potenciales.