La electroforesis en gel de agarosa es un método de electroforesis en gel utilizado en bioquímica , biología molecular , genética y química clínica para separar una población mixta de macromoléculas como ADN o proteínas en una matriz de agarosa , uno de los dos componentes principales del agar . Las proteínas pueden separarse por carga y/o tamaño ( la electroforesis en agarosa con enfoque isoeléctrico es esencialmente independiente del tamaño) y los fragmentos de ADN y ARN por longitud. [1] Las biomoléculas se separan aplicando un campo eléctrico para mover las moléculas cargadas a través de una matriz de agarosa, y las biomoléculas se separan por tamaño en la matriz de gel de agarosa. [2]
El gel de agarosa es fácil de moldear, tiene relativamente menos grupos cargados y es particularmente adecuado para separar ADN de un rango de tamaño que se encuentra con mayor frecuencia en los laboratorios, lo que explica la popularidad de su uso. El ADN separado se puede observar con tinción, generalmente bajo luz ultravioleta, y los fragmentos de ADN se pueden extraer del gel con relativa facilidad. La mayoría de los geles de agarosa utilizados se disuelven entre un 0,7% y un 2% en un tampón de electroforesis adecuado.
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El gel de agarosa es una matriz tridimensional formada por moléculas de agarosa helicoidales en haces superenrollados que se agregan en estructuras tridimensionales con canales y poros a través de los cuales pueden pasar las biomoléculas. [3] La estructura tridimensional se mantiene unida mediante enlaces de hidrógeno y, por lo tanto, puede romperse calentándola nuevamente a un estado líquido. La temperatura de fusión es diferente de la temperatura de gelificación; según las fuentes, el gel de agarosa tiene una temperatura de gelificación de 35 a 42 °C y una temperatura de fusión de 85 a 95 °C. También se encuentran disponibles agarosas de bajo punto de fusión y baja gelificación obtenidas mediante modificaciones químicas.
El gel de agarosa tiene un tamaño de poro grande y una buena resistencia del gel, lo que lo hace adecuado como medio anticonvección para la electroforesis de ADN y moléculas de proteínas grandes. El tamaño de poro de un gel al 1% se ha estimado entre 100 nm y 200–500 nm, [4] [5] y su resistencia del gel permite que geles tan diluidos como al 0,15% formen una placa para electroforesis en gel. [6] Sin embargo, los geles de baja concentración (0,1–0,2%) son frágiles y, por tanto, difíciles de manipular. El gel de agarosa tiene un poder de resolución menor que el gel de poliacrilamida para el ADN, pero tiene un mayor rango de separación y, por lo tanto, se utiliza para fragmentos de ADN de tamaño habitual de 50 a 20 000 pb. El límite de resolución para la electroforesis en gel de agarosa estándar es de alrededor de 750 kb, pero es posible una resolución de más de 6 Mb con la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE). [7] También se puede utilizar para separar proteínas grandes y es la matriz preferida para la electroforesis en gel de partículas con radios efectivos superiores a 5-10 nm. Un gel de agarosa al 0,9% tiene poros lo suficientemente grandes para la entrada del bacteriófago T4 . [6]
El polímero de agarosa contiene grupos cargados, en particular piruvato y sulfato . [8] Estos grupos cargados negativamente crean un flujo de agua en la dirección opuesta al movimiento del ADN en un proceso llamado electroendosmosis (EEO) y, por lo tanto, pueden retardar el movimiento del ADN y causar que las bandas se desdibujen. Los geles de mayor concentración tendrían un mayor flujo electroendosmótico. Por lo tanto, generalmente se prefiere la agarosa con bajo EEO para su uso en electroforesis de ácidos nucleicos en gel de agarosa , pero la agarosa con alto EEO se puede usar para otros fines. El menor contenido de sulfato de la agarosa con bajo EEO, particularmente la agarosa de bajo punto de fusión (LMP), también es beneficiosa en los casos en los que el ADN extraído del gel se va a utilizar para una manipulación adicional, ya que la presencia de sulfatos contaminantes puede afectar algunos procedimientos posteriores, como como ligadura y PCR . Sin embargo, las agarosas con EEO cero no son deseables para algunas aplicaciones, ya que pueden prepararse añadiendo grupos cargados positivamente y dichos grupos pueden afectar reacciones enzimáticas posteriores. [9] La electroendosmosis es una de las razones por las que se usa agarosa con preferencia al agar, ya que el componente de agaropectina en el agar contiene una cantidad significativa de grupos sulfato y carboxilo cargados negativamente. La eliminación de agaropectina en agarosa reduce sustancialmente el EEO, además de reducir la adsorción no específica de biomoléculas a la matriz del gel. Sin embargo, para algunas aplicaciones, como la electroforesis de proteínas séricas, puede ser deseable un EEO elevado y se puede añadir agaropectina al gel utilizado. [10]
Varios factores pueden afectar la migración de ácidos nucleicos: la dimensión de los poros del gel (concentración del gel), el tamaño del ADN que se somete a electroforesis, el voltaje utilizado, la fuerza iónica del tampón y la concentración del colorante intercalante como el bromuro de etidio. si se utiliza durante la electroforesis. [11]
Las moléculas más pequeñas viajan más rápido que las moléculas más grandes en gel, y el ADN bicatenario se mueve a una velocidad inversamente proporcional al logaritmo del número de pares de bases. Sin embargo, esta relación se rompe con fragmentos de ADN muy grandes, y la separación de fragmentos de ADN muy grandes requiere el uso de electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), que aplica corriente alterna desde diferentes direcciones y los fragmentos de ADN grandes se separan a medida que se reorientan con la campo cambiante. [12]
Para la electroforesis en gel de agarosa estándar, las moléculas más grandes se resuelven mejor usando un gel de baja concentración, mientras que las moléculas más pequeñas se separan mejor con un gel de alta concentración. Sin embargo, los geles de mayor concentración requieren tiempos de ejecución más prolongados (a veces días).
El movimiento del ADN puede verse afectado por la conformación de la molécula de ADN; por ejemplo, el ADN superenrollado generalmente se mueve más rápido que el ADN relajado porque está fuertemente enrollado y, por lo tanto, es más compacto. En una preparación de ADN plasmídico normal, pueden estar presentes múltiples formas de ADN. [13] La electroforesis en gel de los plásmidos normalmente mostraría la forma superenrollada negativamente como la banda principal, mientras que el ADN mellado (forma circular abierta) y la forma circular cerrada relajada aparecen como bandas menores. Sin embargo, la velocidad a la que se mueven las diversas formas puede cambiar usando diferentes condiciones de electroforesis, [14] y la movilidad del ADN circular más grande puede verse más afectada que la del ADN lineal por el tamaño de los poros del gel. [15]
El bromuro de etidio que se intercala en el ADN circular puede cambiar la carga, la longitud y la superhelicidad de la molécula de ADN, por lo que su presencia en gel durante la electroforesis puede afectar su movimiento. Por ejemplo, la carga positiva del bromuro de etidio puede reducir el movimiento del ADN en un 15%. [12] La electroforesis en gel de agarosa se puede utilizar para resolver ADN circular con diferente topología de superenrollamiento. [dieciséis]
El daño al ADN debido al aumento de los entrecruzamientos también reducirá la migración electroforética del ADN de una manera dependiente de la dosis. [17] [18]
La tasa de migración del ADN es proporcional al voltaje aplicado, es decir, cuanto mayor es el voltaje, más rápido se mueve el ADN. Sin embargo, la resolución de grandes fragmentos de ADN es menor a alto voltaje. La movilidad del ADN también puede cambiar en un campo inestable: en un campo que se invierte periódicamente, la movilidad del ADN de un tamaño particular puede disminuir significativamente en una frecuencia de ciclo particular. [4] Este fenómeno puede provocar una inversión de bandas en la electroforesis en gel con inversión de campo (FIGE), en la que los fragmentos de ADN más grandes se mueven más rápido que los más pequeños.
La carga negativa de su columna vertebral de fosfato mueve el ADN hacia el ánodo cargado positivamente durante la electroforesis. Sin embargo, la migración de moléculas de ADN en solución, en ausencia de una matriz de gel, es independiente del peso molecular durante la electroforesis. [4] [20] Por lo tanto, la matriz de gel es responsable de la separación del ADN por tamaño durante la electroforesis, y existen varios modelos para explicar el mecanismo de separación de biomoléculas en la matriz de gel. Uno ampliamente aceptado es el modelo de Ogston que trata la matriz polimérica como un tamiz. Una proteína globular o un ADN en espiral aleatorio se mueve a través de los poros interconectados, y el movimiento de moléculas más grandes es más probable que se vea impedido y frenado por colisiones con la matriz del gel, por lo que las moléculas de diferentes tamaños pueden separarse en este proceso de tamizado. . [4]
Sin embargo, el modelo de Ogston se descompone en moléculas grandes, por lo que los poros son significativamente más pequeños que el tamaño de la molécula. Para moléculas de ADN de tamaño superior a 1 kb, lo más habitual es utilizar un modelo de reptación (o sus variantes). Este modelo supone que el ADN puede arrastrarse como una "serpiente" (de ahí "reptación") a través de los poros como una molécula alargada. Un modelo de reptación sesgada se aplica a una intensidad de campo eléctrico más alta, por lo que el extremo delantero de la molécula se polariza fuertemente hacia adelante y arrastra el resto de la molécula. [21] Sin embargo, la microscopía de fluorescencia en tiempo real de moléculas teñidas mostró una dinámica más sutil durante la electroforesis, con el ADN mostrando una elasticidad considerable mientras se estiraba alternativamente en la dirección del campo aplicado y luego se contraía formando una bola, o se enganchaba formando un gancho. Forma de U cuando queda atrapado en las fibras de polímero. [22] [23]
Los detalles de un experimento de electroforesis en gel de agarosa pueden variar según los métodos, pero la mayoría sigue un procedimiento general.
El gel se prepara disolviendo el polvo de agarosa en un tampón apropiado, como TAE o TBE , para usar en electroforesis. [12] La agarosa se dispersa en el tampón antes de calentarla hasta casi el punto de ebullición, pero se evita hervir. Se deja que la agarosa derretida se enfríe lo suficiente antes de verter la solución en un molde, ya que el molde puede deformarse o agrietarse si la solución de agarosa está demasiado caliente. Se coloca un peine en el modelo para crear pocillos para cargar la muestra y el gel debe estar completamente fraguado antes de su uso.
La concentración del gel afecta la resolución de la separación del ADN. El gel de agarosa está compuesto de poros microscópicos a través de los cuales viajan las moléculas, y existe una relación inversa entre el tamaño de los poros del gel de agarosa y la concentración: el tamaño de los poros disminuye a medida que aumenta la densidad de las fibras de agarosa. Una alta concentración de gel mejora la separación de moléculas de ADN más pequeñas, mientras que una reducción de la concentración de gel permite separar moléculas de ADN más grandes. El proceso permite separar fragmentos que van desde 50 pares de bases hasta varias megabases dependiendo de la concentración de gel utilizada. [24] La concentración se mide en peso de agarosa sobre el volumen de tampón utilizado (g/ml). Para una electroforesis en gel de agarosa estándar, un gel al 0,8 % proporciona una buena separación o resolución de fragmentos grandes de ADN de 5 a 10 kb, mientras que un gel al 2 % proporciona una buena resolución para fragmentos pequeños de 0,2 a 1 kb. Para la electroforesis estándar se suelen utilizar geles al 1%. [25] Los geles con un alto porcentaje suelen ser quebradizos y es posible que no se fijen uniformemente, mientras que los geles con un porcentaje bajo (0,1-0,2%) son frágiles y no son fáciles de manipular. Los geles de agarosa de bajo punto de fusión (LMP) también son más frágiles que los geles de agarosa normales. La agarosa de bajo punto de fusión se puede utilizar sola o simultáneamente con agarosa estándar para la separación y aislamiento de ADN. [26] PFGE y FIGE a menudo se realizan con geles de agarosa de alto porcentaje.
Una vez que el gel se ha endurecido, se retira el peine, dejando pocillos donde se pueden cargar las muestras de ADN. El tampón de carga se mezcla con la muestra de ADN antes de cargar la mezcla en los pocillos. El tampón de carga contiene un compuesto denso, que puede ser glicerol, sacarosa o Ficoll , que aumenta la densidad de la muestra para que la muestra de ADN pueda hundirse hasta el fondo del pocillo. [12] Si la muestra de ADN contiene etanol residual después de su preparación, puede salir flotando del pozo. El tampón de carga también incluye tintes coloreados como xileno cianol y azul de bromofenol utilizados para controlar el progreso de la electroforesis. Las muestras de ADN se cargan utilizando una pipeta .
La electroforesis en gel de agarosa se realiza más comúnmente de forma horizontal en un modo subacuático mediante el cual la placa de gel se sumerge completamente en un tampón durante la electroforesis. También es posible, aunque menos común, realizar la electroforesis tanto vertical como horizontalmente con el gel elevado sobre patas de agarosa utilizando un aparato adecuado. [27] El tampón utilizado en el gel es el mismo que el tampón utilizado en el tanque de electroforesis, razón por la cual la electroforesis en modo subacuático es posible con gel de agarosa.
Para una resolución óptima de ADN de tamaño superior a 2 kb en electroforesis en gel estándar, se recomienda de 5 a 8 V/cm (la distancia en cm se refiere a la distancia entre electrodos, por lo tanto este voltaje recomendado sería de 5 a 8 multiplicado por la distancia entre electrodos). los electrodos en cm). [14] El voltaje también puede estar limitado por el hecho de que calienta el gel y puede hacer que el gel se derrita si se utiliza a alto voltaje durante un período prolongado, especialmente si el gel utilizado es gel de agarosa LMP. Un voltaje demasiado alto también puede reducir la resolución, además de provocar rayas en las bandas de las moléculas de ADN grandes. Un voltaje demasiado bajo puede provocar un ensanchamiento de la banda para pequeños fragmentos de ADN debido a la dispersión y difusión. [28]
Dado que el ADN no es visible con luz natural, el progreso de la electroforesis se controla mediante colorantes de colores. El xileno cianol (color azul claro) comigra grandes fragmentos de ADN, mientras que el azul de bromofenol (azul oscuro) comigra con los fragmentos más pequeños. Los tintes menos utilizados incluyen Cresol Red y Orange G , que migran antes que el azul de bromofenol. También se combina un marcador de ADN para estimar el peso molecular de los fragmentos de ADN. Sin embargo, tenga en cuenta que el tamaño de un ADN circular como los plásmidos no se puede medir con precisión utilizando marcadores estándar a menos que se haya linealizado mediante digestión de restricción ; alternativamente, se puede usar un marcador de ADN superenrollado.
El ADN y el ARN normalmente se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio , que se intercala en los surcos principales del ADN y emite fluorescencia bajo luz ultravioleta. La intercalación depende de la concentración de ADN y, por tanto, una banda con alta intensidad indicará una mayor cantidad de ADN en comparación con una banda de menor intensidad. [12] El bromuro de etidio se puede agregar a la solución de agarosa antes de que gelifique, o el gel de ADN se puede teñir más tarde después de la electroforesis. No es necesario decolorar el gel, pero puede producir mejores imágenes. Hay otros métodos de tinción disponibles; ejemplos son MIDORI Green, SYBR Green , GelRed , azul de metileno , azul de cresilo brillante , sulfato azul del Nilo y violeta cristal . [29] SYBR Green, GelRed y otros productos comerciales similares se venden como alternativas más seguras al bromuro de etidio, ya que se ha demostrado que es mutagénico en la prueba de Ames , aunque en realidad no se ha establecido la carcinogenicidad del bromuro de etidio. SYBR Green requiere el uso de un transiluminador de luz azul. El ADN teñido con cristal violeta se puede ver bajo luz natural sin el uso de un transiluminador UV, lo cual es una ventaja, aunque es posible que no produzca una banda fuerte.
Cuando se tiñe con bromuro de etidio, el gel se observa con un transiluminador ultravioleta (UV). La luz ultravioleta excita los electrones dentro del anillo aromático del bromuro de etidio y, una vez que regresan al estado fundamental, se libera luz, lo que hace que el complejo de ADN y bromuro de etidio emita fluorescencia. [12] Los transiluminadores estándar utilizan longitudes de onda de 302/312 nm (UV-B), sin embargo, la exposición del ADN a la radiación UV durante tan solo 45 segundos puede producir daños en el ADN y afectar los procedimientos posteriores, por ejemplo, reduciendo la eficiencia de la transformación . transcripción in vitro y PCR . [30] Por lo tanto, debe limitarse la exposición del ADN a la radiación ultravioleta. El uso de una longitud de onda más alta de 365 nm (rango UV-A) causa menos daño al ADN pero también produce una fluorescencia mucho más débil con bromuro de etidio. Cuando se pueden seleccionar múltiples longitudes de onda en el transiluminador, se puede usar una longitud de onda más corta para capturar imágenes, mientras que se debe usar una longitud de onda más larga si es necesario trabajar en el gel durante un período de tiempo prolongado.
El aparato transiluminador también puede contener dispositivos de captura de imágenes, tales como una cámara digital o polaroid, que permiten tomar o imprimir una imagen del gel.
Para la electroforesis en gel de proteínas, las bandas se pueden visualizar con tinciones de Coomassie o plata .
Las bandas de ADN separadas se utilizan a menudo para procedimientos posteriores, y una banda de ADN puede cortarse del gel en forma de rebanada, disolverse y purificarse. Sin embargo, los contaminantes pueden afectar algunos procedimientos posteriores, como la PCR, y en algunos casos puede preferirse la agarosa de bajo punto de fusión, ya que contiene menos sulfatos que pueden afectar algunas reacciones enzimáticas. Los geles también pueden usarse para técnicas de transferencia.
En general, el amortiguador ideal debería tener buena conductividad, producir menos calor y tener una larga vida útil. [31] Hay varios tampones que se utilizan para la electroforesis en agarosa; Los más comunes para ácidos nucleicos incluyen Tris/Acetato/EDTA (TAE) y Tris/Borato/EDTA (TBE). Los tampones utilizados contienen EDTA para inactivar muchas nucleasas que requieren cationes divalentes para su función. El borato en el tampón TBE puede ser problemático ya que el borato puede polimerizarse y/o interactuar con dioles cis como los que se encuentran en el ARN. TAE tiene la capacidad de almacenamiento en búfer más baja, pero proporciona la mejor resolución para ADN más grande. Esto significa un voltaje más bajo y más tiempo, pero un mejor producto.
Se han propuesto muchos otros tampones, por ejemplo, borato de litio (LB), histidina isoeléctrica, tampones de productos combinados pK, etc.; en la mayoría de los casos, el supuesto fundamento es una corriente más baja (menos calor) o movilidades de iones coincidentes, lo que conduce a una vida útil más larga del buffer. El tampón tris-fosfato tiene una alta capacidad tampón, pero no se puede utilizar si el ADN extraído se va a utilizar en una reacción sensible al fosfato. LB es relativamente nuevo y es ineficaz para resolver fragmentos de más de 5 kpb; Sin embargo, debido a su baja conductividad, se podría utilizar un voltaje mucho más alto (hasta 35 V/cm), lo que significa un tiempo de análisis más corto para la electroforesis de rutina. Una diferencia de tamaño tan pequeña como un par de bases podría resolverse en gel de agarosa al 3% con un medio de conductividad extremadamente baja (borato de litio 1 mM). [32]
Se pueden usar otros sistemas tampón en aplicaciones específicas, por ejemplo, se pueden usar tampones ácido barbitúrico-barbitúrico de sodio o tris- barbitúricos para la electroforesis de proteínas en gel de agarosa, por ejemplo en la detección de distribución anormal de proteínas. [33]
Los geles de agarosa se moldean y manipulan fácilmente en comparación con otras matrices y los ácidos nucleicos no se alteran químicamente durante la electroforesis. Las muestras también se recuperan fácilmente. Una vez finalizado el experimento, el gel resultante se puede guardar en una bolsa de plástico en el frigorífico.
La electroforesis se realiza en soluciones tampón para reducir los cambios de pH debido al campo eléctrico, lo cual es importante porque la carga del ADN y el ARN depende del pH, pero funcionar durante demasiado tiempo puede agotar la capacidad tampón de la solución. Además, es posible que diferentes preparaciones de material genético no migren de manera consistente entre sí, por razones morfológicas o de otro tipo.