La citogenética es esencialmente una rama de la genética , pero también es una parte de la biología celular/citología (una subdivisión de la anatomía humana), que se ocupa de cómo los cromosomas se relacionan con el comportamiento celular, particularmente con su comportamiento durante la mitosis y la meiosis . [1] Las técnicas utilizadas incluyen el cariotipo , el análisis de cromosomas en banda G , otras técnicas de bandas citogenéticas, así como la citogenética molecular como la hibridación in situ fluorescente (FISH) y la hibridación genómica comparativa (CGH).
Los cromosomas fueron observados por primera vez en células vegetales por Carl Nägeli en 1842. Su comportamiento en células animales ( salamandras ) fue descrito por Walther Flemming , el descubridor de la mitosis , en 1882. El nombre fue acuñado por otro anatomista alemán, von Waldeyer en 1888.
La siguiente etapa tuvo lugar tras el desarrollo de la genética a principios del siglo XX, cuando se apreció que el conjunto de cromosomas (el cariotipo ) era el portador de los genes. Levitsky parece haber sido el primero en definir el cariotipo como la apariencia fenotípica de los cromosomas somáticos , en contraste con su contenido génico . [2] [3] La investigación sobre el cariotipo humano tardó muchos años en resolver la pregunta más básica: ¿cuántos cromosomas contiene una célula humana diploide normal ? [4] En 1912, Hans von Winiwarter informó de 47 cromosomas en las espermatogonias y 48 en las ovogonias , concluyendo un mecanismo de determinación del sexo XX/XO . [5] En 1922, Painter no estaba seguro de si el número diploide de los humanos era 46 o 48, y en un principio se inclinó por 46. [6] Más tarde, modificó su opinión de 46 a 48, e insistió correctamente en que los humanos tenían un sistema XX/XY de determinación sexual. [7] Teniendo en cuenta sus técnicas, estos resultados fueron bastante notables. En los libros de ciencia, el número de cromosomas humanos se mantuvo en 48 durante más de treinta años. Se necesitaban nuevas técnicas para corregir este error. Joe Hin Tjio, que trabajaba en el laboratorio de Albert Levan [8] [9], fue responsable de encontrar el enfoque:
Hubo que esperar hasta 1956 para que se aceptara de forma generalizada que el cariotipo del hombre incluía sólo 46 cromosomas. [10] [11] [12] Los grandes simios tienen 48 cromosomas. El cromosoma humano 2 se formó por una fusión de cromosomas ancestrales, lo que redujo el número. [13]
Barbara McClintock comenzó su carrera como citogenética del maíz . En 1931, McClintock y Harriet Creighton demostraron que la recombinación citológica de cromosomas marcados se correlacionaba con la recombinación de rasgos genéticos ( genes ). McClintock, mientras estaba en la Carnegie Institution , continuó estudios previos sobre los mecanismos de rotura de cromosomas y brotes de fusión en el maíz. Identificó un evento particular de rotura de cromosomas que siempre ocurría en el mismo locus en el cromosoma 9 del maíz, al que llamó el locus " Ds" o de "disociación". [14] McClintock continuó su carrera en citogenética estudiando la mecánica y la herencia de los cromosomas rotos y en anillo (circulares) del maíz. Durante su trabajo citogenético, McClintock descubrió los transposones , un hallazgo que finalmente la llevó a recibir el Premio Nobel en 1983.
En la década de 1930, Dobzhansky y sus colaboradores recolectaron Drosophila pseudoobscura y D. persimilis de poblaciones silvestres en California y estados vecinos. Utilizando la técnica de Painter [15] estudiaron los cromosomas politénicos y descubrieron que las poblaciones silvestres eran polimórficas para las inversiones cromosómicas . Todas las moscas se parecen independientemente de las inversiones que presenten: este es un ejemplo de polimorfismo críptico. [ cita requerida ]
Rápidamente se acumularon pruebas que demostraban que la selección natural era la responsable. Utilizando un método inventado por L'Héritier y Teissier, Dobzhansky crió poblaciones en jaulas de población , lo que permitió la alimentación, la reproducción y el muestreo al tiempo que impedía el escape. Esto tuvo el beneficio de eliminar la migración como una posible explicación de los resultados. Las poblaciones que contienen inversiones con una frecuencia inicial conocida se pueden mantener en condiciones controladas. Se descubrió que los diversos tipos de cromosomas no fluctúan al azar, como lo harían si fueran selectivamente neutrales, sino que se ajustan a ciertas frecuencias en las que se estabilizan. Cuando Dobzhansky publicó la tercera edición de su libro en 1951 [16], estaba convencido de que las formas cromosómicas se mantenían en la población por la ventaja selectiva de los heterocigotos, como ocurre con la mayoría de los polimorfismos . [17] [18]
El lirio es un organismo privilegiado para el examen citológico de la meiosis, ya que los cromosomas son grandes y cada etapa morfológica de la meiosis se puede identificar fácilmente mediante el microscopio. Hotta, Chandley et al. [19] presentaron la evidencia de un patrón común de corte de ADN y síntesis de reparación en células meióticas masculinas de lirios y roedores durante las etapas de cigoteno-paquiteno de la meiosis, cuando se suponía que se producía el entrecruzamiento. La presencia de un patrón común entre organismos tan distantes filogenéticamente como el lirio y el ratón llevó a los autores a concluir que la organización para el entrecruzamiento meiótico en al menos eucariotas superiores es probablemente de distribución universal. [ cita requerida ]
Tras la aparición de procedimientos que permitieron enumerar fácilmente los cromosomas, rápidamente se hicieron descubrimientos relacionados con los cromosomas aberrantes o el número de cromosomas. [ cita requerida ]
Citogenética constitucional: En algunos trastornos congénitos, como el síndrome de Down , la citogenética reveló la naturaleza del defecto cromosómico: una trisomía "simple". Las anomalías que surgen de eventos de no disyunción pueden causar células con aneuploidía (adiciones o deleciones de cromosomas enteros) en uno de los progenitores o en el feto. En 1959, Lejeune [20] descubrió que los pacientes con síndrome de Down tenían una copia adicional del cromosoma 21. El síndrome de Down también se conoce como trisomía 21.
Otras anomalías numéricas descubiertas incluyen anomalías en los cromosomas sexuales. Una mujer con un solo cromosoma X tiene síndrome de Turner , mientras que un hombre con un cromosoma X adicional, lo que da como resultado un total de 47 cromosomas, tiene síndrome de Klinefelter . Muchas otras combinaciones de cromosomas sexuales son compatibles con el nacimiento vivo, incluidas XXX , XYY y XXXX. La capacidad de los mamíferos para tolerar aneuploidías en los cromosomas sexuales surge de la capacidad de inactivarlos , lo que se requiere en las mujeres normales para compensar la presencia de dos copias del cromosoma. No todos los genes del cromosoma X están inactivados, por lo que se observa un efecto fenotípico en individuos con cromosomas X adicionales. [ cita requerida ]
La trisomía 13 se asoció con el síndrome de Patau y la trisomía 18 con el síndrome de Edwards . [ cita requerida ]
Citogenética adquirida: En 1960, Peter Nowell y David Hungerford [21] descubrieron un pequeño cromosoma en los glóbulos blancos de pacientes con leucemia mieloide crónica (LMC). Este cromosoma anormal fue bautizado como cromosoma Filadelfia , ya que ambos científicos estaban realizando su investigación en Filadelfia, Pensilvania . Trece años más tarde, con el desarrollo de técnicas más avanzadas, Janet Rowley demostró que el cromosoma anormal era el resultado de una translocación de los cromosomas 9 y 22. La identificación del cromosoma Filadelfia mediante citogenética es diagnóstica para la LMC. Más de 780 leucemias y cientos de tumores sólidos (pulmón, próstata, riñón, etc.) se caracterizan actualmente por una anomalía cromosómica adquirida, cuyo valor pronóstico es crucial. La identificación de estas anomalías cromosómicas ha llevado al descubrimiento de un gran número de "genes del cáncer" (u oncogenes ). El creciente conocimiento de estos genes del cáncer permite ahora el desarrollo de terapias dirigidas , lo que transforma las perspectivas de supervivencia de los pacientes. Así, la citogenética ha tenido y sigue teniendo un papel esencial en el progreso del conocimiento del cáncer. Grandes bases de datos ( Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Haematology , COSMIC cancer database , Mitelman Database of Chromosome Aberrations and Gene Fusions in Cancer ) permiten a investigadores y clínicos disponer del corpus necesario para su trabajo en este campo.
A finales de los años 1960, Torbjörn Caspersson desarrolló una técnica de tinción fluorescente con quinacrina (bandas Q) que reveló patrones de bandas únicos para cada par de cromosomas. Esto permitió que pares de cromosomas que de otro modo serían de igual tamaño se diferenciaran por patrones de bandas horizontales distintos. Los patrones de bandas se utilizan ahora para dilucidar los puntos de ruptura y los cromosomas constituyentes involucrados en las translocaciones cromosómicas . Las deleciones e inversiones dentro de un cromosoma individual también se pueden identificar y describir con mayor precisión utilizando una nomenclatura de bandas estandarizada. Las bandas G (que utilizan tripsina y tinción de Giemsa/Wright) se desarrollaron simultáneamente a principios de los años 1970 y permiten la visualización de patrones de bandas utilizando un microscopio de campo claro. [ cita requerida ]
Los diagramas que identifican los cromosomas en función de los patrones de bandas se conocen como idiogramas . Estos mapas se convirtieron en la base de los campos prenatales y oncológicos para trasladar rápidamente la citogenética al laboratorio clínico, donde el cariotipo permitió a los científicos buscar alteraciones cromosómicas. Las técnicas se ampliaron para permitir el cultivo de amniocitos libres recuperados del líquido amniótico y técnicas de elongación para todos los tipos de cultivo que permiten bandas de mayor resolución. [ cita requerida ]
En la década de 1980, se produjeron avances en la citogenética molecular . Si bien las sondas marcadas con radioisótopos se habían hibridado con ADN desde 1969, ahora se produjo un avance en el uso de sondas marcadas con fluorescencia. La hibridación de las mismas con preparaciones cromosómicas utilizando técnicas existentes pasó a conocerse como hibridación in situ con fluorescencia (FISH). [22] Este cambio aumentó significativamente el uso de técnicas de sondeo, ya que las sondas marcadas con fluorescencia son más seguras. Los avances posteriores en la micromanipulación y el examen de los cromosomas condujeron a la técnica de microdisección cromosómica mediante la cual las aberraciones en la estructura cromosómica se podían aislar, clonar y estudiar con cada vez mayor detalle. [ cita requerida ]
El análisis cromosómico de rutina ( cariotipo ) se refiere al análisis de cromosomas en metafase que han sido marcados con bandas utilizando tripsina seguida de Giemsa , Leishmann o una mezcla de las dos. Esto crea patrones de bandas únicos en los cromosomas. Se desconoce el mecanismo molecular y la razón de estos patrones, aunque es probable que estén relacionados con el tiempo de replicación y el empaquetamiento de la cromatina. [ cita requerida ]
En los laboratorios de citogenética se utilizan varias técnicas de bandeo de cromosomas. El bandeo quinacrino (bandeo Q) fue el primer método de tinción utilizado para producir patrones de bandeo específicos. Este método requiere un microscopio de fluorescencia y ya no se utiliza tan ampliamente como el bandeo de Giemsa (bandeo G). El bandeo inverso, o bandeo R, requiere tratamiento térmico e invierte el patrón blanco y negro habitual que se ve en las bandas G y Q. Este método es particularmente útil para teñir los extremos distales de los cromosomas. Otras técnicas de tinción incluyen el bandeo C y las tinciones de la región organizadora del nucleolar (tinciones NOR). Estos últimos métodos tiñen específicamente ciertas porciones del cromosoma. El bandeo C tiñe la heterocromatina constitutiva , que generalmente se encuentra cerca del centrómero, y la tinción NOR resalta los satélites y los tallos de los cromosomas acrocéntricos . [ cita requerida ]
El bandeo de alta resolución implica la tinción de cromosomas durante la profase o metafase temprana (prometafase), antes de que alcancen la condensación máxima. Debido a que los cromosomas en profase y prometafase son más extensos que los cromosomas en metafase, la cantidad de bandas observables para todos los cromosomas ( bandas por conjunto haploide , bph; "nivel de banda") aumenta de aproximadamente 300 a 450 hasta 800. Esto permite la detección de anomalías menos obvias que generalmente no se ven con el bandeo convencional. [23]
Las células de la médula ósea , sangre, líquido amniótico, sangre del cordón umbilical , tumores y tejidos (incluyendo piel, cordón umbilical , vellosidades coriónicas, hígado y muchos otros órganos) pueden cultivarse utilizando técnicas estándar de cultivo celular para aumentar su número. Luego se agrega un inhibidor mitótico ( colchicina , colcemid ) al cultivo. Esto detiene la división celular en la mitosis , lo que permite un mayor rendimiento de células mitóticas para el análisis. Luego, las células se centrifugan y se eliminan el medio y el inhibidor mitótico y se reemplazan con una solución hipotónica. Esto hace que los glóbulos blancos o fibroblastos se hinchen de modo que los cromosomas se diseminen cuando se agreguen a un portaobjetos, además de lisar los glóbulos rojos. Después de que las células se hayan dejado reposar en una solución hipotónica, se agrega el fijador de Carnoy ( metanol a ácido acético glacial 3:1 ). Esto mata las células y endurece los núcleos de los glóbulos blancos restantes. Las células se fijan en general varias veces para eliminar cualquier resto o glóbulos rojos restantes. Luego, la suspensión celular se coloca en portaobjetos con muestras. Después de dejarlos envejecer en un horno o esperar unos días, están listos para marcarlos y analizarlos.
El análisis de los cromosomas bandeados lo realiza un especialista de laboratorio clínico en citogenética (CLSp(CG)) al microscopio . Generalmente se analizan 20 células, lo que es suficiente para descartar el mosaicismo a un nivel aceptable. Los resultados se resumen y se entregan a un citogenetista certificado para su revisión y para que redacte una interpretación teniendo en cuenta la historia previa del paciente y otros hallazgos clínicos. Los resultados se publican en un Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética Humana 2009 (ISCN2009).
La hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se refiere al uso de una sonda marcada con fluorescencia para hibridar con preparaciones de células citogenéticas.
Además de las preparaciones estándar, la FISH también se puede realizar en:
Esta sección se refiere a la preparación de preparaciones citogenéticas estándar.
El portaobjetos se envejece utilizando una solución de sal que generalmente consiste en 2X SSC (sal, citrato de sodio). Luego, los portaobjetos se deshidratan en etanol y se agrega la mezcla de sonda. Luego, el ADN de muestra y el ADN de sonda se desnaturalizan conjuntamente utilizando una placa calentada y se dejan reasociar durante al menos 4 horas. Luego, los portaobjetos se lavan para eliminar el exceso de sonda no unida y se contratiñen con 4',6-Diamidino-2-fenilindol ( DAPI ) o yoduro de propidio.
El análisis de las muestras de hibridación in situ con fluorescencia lo realiza un especialista en citogenética de laboratorio clínico mediante microscopía de fluorescencia . En oncología, generalmente se cuenta una gran cantidad de células en interfase para descartar una enfermedad residual de bajo nivel; generalmente se cuentan y cuentan entre 200 y 1000 células. En el caso de problemas congénitos, generalmente se cuentan 20 células en metafase. [ cita requerida ]
Los avances ahora se centran en la citogenética molecular, incluidos sistemas automatizados para contar los resultados de preparaciones FISH estándar y técnicas para cariotipado virtual , como matrices de hibridación genómica comparativa, CGH y matrices de polimorfismo de un solo nucleótido .