La citogenética molecular combina dos disciplinas, la biología molecular y la citogenética , e implica el análisis de la estructura cromosómica para ayudar a distinguir las células normales de las que causan cáncer. La citogenética humana comenzó en 1956 cuando se descubrió que las células humanas normales contienen 46 cromosomas. Sin embargo, las primeras observaciones microscópicas de los cromosomas fueron realizadas por Arnold, Flemming y Hansemann a finales del siglo XIX. Su trabajo fue ignorado durante décadas hasta que se descubrió que el número real de cromosomas en humanos era 46. En 1879, Arnold examinó células de sarcoma y carcinoma que tenían núcleos muy grandes. Hoy en día, el estudio de la citogenética molecular puede ser útil en el diagnóstico y tratamiento de diversas neoplasias malignas, como las hematológicas, los tumores cerebrales y otros precursores del cáncer. En general, el campo se centra en estudiar la evolución de los cromosomas, más específicamente el número, la estructura, la función y el origen de las anomalías cromosómicas. [1] [2] Incluye una serie de técnicas denominadas hibridación fluorescente in situ , o FISH, en las que las sondas de ADN se marcan con etiquetas fluorescentes de diferentes colores para visualizar una o más regiones específicas del genoma. Introducido en la década de 1980, FISH utiliza sondas con secuencias de bases complementarias para localizar la presencia o ausencia de regiones de ADN específicas. FISH se puede realizar como un abordaje directo a los cromosomas en metafase o a los núcleos en interfase. Alternativamente, se puede adoptar un enfoque indirecto en el que se puede evaluar todo el genoma para detectar cambios en el número de copias mediante cariotipo virtual. Los cariotipos virtuales se generan a partir de conjuntos formados por miles o millones de sondas, y se utilizan herramientas computacionales para recrear el genoma in silico .
La hibridación in situ por fluorescencia traza una copia única o secuencias de ADN repetitivas mediante el etiquetado de localización de ácidos nucleicos específicos. La técnica utiliza diferentes sondas de ADN marcadas con etiquetas fluorescentes que se unen a una o más regiones específicas del genoma. [3] Etiqueta todos los cromosomas individuales en cada etapa de la división celular para mostrar anomalías estructurales y numéricas que pueden surgir a lo largo del ciclo. Esto se hace con una sonda que puede ser específica de locus, centromérica, telomérica y cromosómica completa. Esta técnica se realiza normalmente en células en interfase y tejidos en bloque de parafina. FISH mapea secuencias de ADN repetitivas o de copia única mediante el etiquetado de localización de ácidos nucleicos específicos. La técnica utiliza diferentes sondas de ADN marcadas con etiquetas fluorescentes que se unen a una o más regiones específicas del genoma. Las señales de las etiquetas fluorescentes se pueden ver con microscopía y las mutaciones se pueden ver comparando estas señales con las células sanas. Para que esto funcione, el ADN debe desnaturalizarse mediante calor o productos químicos para romper los enlaces de hidrógeno; esto permite que se produzca la hibridación una vez que se mezclan dos muestras. Las sondas fluorescentes crean nuevos enlaces de hidrógeno, reparando así el ADN con sus bases complementarias, que pueden detectarse mediante microscopía. FISH permite visualizar diferentes partes del cromosoma en diferentes etapas del ciclo celular. FISH se puede realizar como un abordaje directo a los cromosomas en metafase o a los núcleos en interfase. Alternativamente, se puede adoptar un enfoque indirecto en el que se puede evaluar todo el genoma para detectar cambios en el número de copias mediante cariotipo virtual. Los cariotipos virtuales se generan a partir de micromatrices formadas por miles o millones de sondas y se utilizan herramientas computacionales para recrear el genoma in silico . [4]
La hibridación genómica comparativa (CGH), derivada de FISH, se utiliza para comparar variaciones en el número de copias entre una muestra biológica y una referencia. CGH se desarrolló originalmente para observar aberraciones cromosómicas en células tumorales. Este método utiliza dos genomas, una muestra y un control, que están etiquetados de forma fluorescente para distinguirlos. [5] En CGH, el ADN se aísla de una muestra de tumor y se adjunta biotina. Otra proteína marcadora, la digoxigenina, se adjunta a la muestra de ADN de referencia. [6] Las muestras de ADN marcadas se cohibridan con sondas durante la división celular, que es el momento más informativo para observar la variación del número de copias. [7] Los usos de CGH crean un mapa que muestra la abundancia relativa de ADN y el número de cromosomas. Al comparar la fluorescencia de una muestra con una referencia, CGH puede señalar ganancias o pérdidas de regiones cromosómicas. [6] [8] CGH se diferencia de FISH porque no requiere un objetivo específico ni conocimiento previo de la región genética que se analiza. CGH también puede escanear un genoma completo con relativa rapidez en busca de diversos desequilibrios cromosómicos, y esto es útil en pacientes con problemas genéticos subyacentes y cuando no se conoce un diagnóstico oficial. Esto ocurre a menudo con los cánceres hematológicos.
La hibridación genómica comparativa de matrices (aCGH) permite realizar CGH sin cultivo ni aislamiento celular. En cambio, se realiza en portaobjetos de vidrio que contienen pequeños fragmentos de ADN. [9] La eliminación del paso de aislamiento y cultivo celular simplifica y acelera drásticamente el proceso. Utilizando principios similares a los de CGH, la muestra de ADN se aísla y se marca con fluorescencia y luego se cohibrida con sondas monocatenarias para generar señales. Se pueden detectar miles de estas señales a la vez, y este proceso se denomina detección paralela. [10] Se miden las relaciones de fluorescencia entre la muestra y las señales de referencia, lo que representa la diferencia promedio entre la cantidad de cada una. Esto mostrará si hay más o menos muestra de ADN de lo esperado por referencia.
La hibridación in situ del cromosoma FISH permite el estudio citogenético en muestras pre y posnatales y también se utiliza ampliamente en pruebas citogenéticas para el cáncer. Si bien la citogenética es el estudio de los cromosomas y su estructura, las pruebas citogenéticas implican el análisis de células en la sangre, el tejido, la médula ósea o el líquido para identificar cambios en los cromosomas de un individuo. Esto a menudo se hacía mediante cariotipo y ahora se hace con FISH. Este método se usa comúnmente para detectar deleciones o translocaciones cromosómicas a menudo asociadas con el cáncer. FISH también se utiliza para lesiones melanocíticas, distinguiendo melanocíticos atípicos o melanoma maligno. [11]
Las células cancerosas a menudo acumulan cambios estructurales cromosómicos complejos, como pérdida, duplicación, inversión o movimiento de un segmento. [12] Cuando se utiliza FISH, cualquier cambio en un cromosoma se hará visible a través de discrepancias entre los cromosomas cancerosos marcados con fluorescencia y los cromosomas sanos. [12] Los hallazgos de estos experimentos citogenéticos pueden arrojar luz sobre las causas genéticas del cáncer y localizar posibles objetivos terapéuticos. [13]
La citogenética molecular también se puede utilizar como herramienta de diagnóstico para síndromes congénitos en los que se desconocen las causas genéticas subyacentes de la enfermedad. [14] El análisis de la estructura cromosómica de un paciente puede revelar cambios causales. Los nuevos métodos de biología molecular desarrollados en las últimas dos décadas, como la secuenciación de próxima generación y RNA-seq , han reemplazado en gran medida a la citogenética molecular en el diagnóstico, pero recientemente el uso de derivados de FISH, como el FISH multicolor y las bandas multicolores (mBAND), ha ido creciendo en el ámbito médico. aplicaciones. [15]
Uno de los proyectos actuales relacionados con la citogenética molecular implica la investigación genómica de cánceres raros, denominada Iniciativa de Caracterización del Genoma del Cáncer (CGCI). [16] El CGCI es un grupo interesado en describir las anomalías genéticas de algunos cánceres raros, mediante el empleo de secuenciación avanzada de genomas, exomas y transcriptomas, que en última instancia pueden desempeñar un papel en la patogénesis del cáncer. [16] Actualmente, el CGCI ha dilucidado algunas alteraciones genéticas no determinadas previamente en el meduloblastoma y el linfoma no Hodgkin de células B. Los próximos pasos del CGCI son identificar alteraciones genómicas en tumores VIH+ y en linfoma de Burkitt .
Algunas técnicas de secuenciación de alto rendimiento que utiliza el CGCI incluyen: secuenciación del genoma completo , secuenciación del transcriptoma , secuenciación de ChIP y Illumina Infinum MmethylationEPIC BeadCHIP. [17]