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Cristalografía electrónica

La cristalografía electrónica es un método para determinar la disposición de los átomos en sólidos utilizando un microscopio electrónico de transmisión (TEM). Puede implicar el uso de imágenes de microscopía electrónica de transmisión de alta resolución , patrones de difracción de electrones , incluida la difracción de electrones de haz convergente , o combinaciones de estos. Ha tenido éxito en la determinación de algunas estructuras masivas y también de estructuras superficiales. [1] [2] Dos métodos relacionados son la difracción de electrones de baja energía , que ha resuelto la estructura de muchas superficies, y la difracción de electrones de reflexión de alta energía , que se utiliza para monitorear superficies a menudo durante el crecimiento.

Comparación con la cristalografía de rayos X.

Puede complementar la cristalografía de rayos X para estudios de cristales muy pequeños (<0,1 micrómetros), tanto inorgánicos como orgánicos y proteínas , como las proteínas de membrana , que no pueden formar fácilmente los grandes cristales tridimensionales necesarios para ese proceso. Las estructuras de las proteínas generalmente se determinan a partir de cristales bidimensionales (láminas o hélices ), poliedros como las cápsides virales o proteínas individuales dispersas. En estas situaciones se pueden utilizar electrones, mientras que los rayos X no, porque los electrones interactúan más fuertemente con los átomos que los rayos X. Por tanto, los rayos X viajarán a través de un fino cristal bidimensional sin difractarse significativamente, mientras que los electrones se pueden utilizar para formar una imagen. Por el contrario, la fuerte interacción entre electrones y protones hace que los cristales gruesos (por ejemplo, tridimensionales > 1 micrómetro) sean impermeables a los electrones, que sólo penetran distancias cortas.

Una de las principales dificultades de la cristalografía de rayos X es la determinación de fases en el patrón de difracción . Debido a la complejidad de las lentes de rayos X , es difícil formar una imagen del cristal que se difracta y, por tanto, se pierde la información de fase. Afortunadamente, los microscopios electrónicos pueden resolver la estructura atómica en el espacio real y la información de fase del factor de estructura cristalográfica se puede determinar experimentalmente a partir de la transformada de Fourier de una imagen. La transformada de Fourier de una imagen de resolución atómica es similar, pero diferente, a un patrón de difracción: con puntos recíprocos de la red que reflejan la simetría y el espaciado de un cristal. [3] Aaron Klug fue el primero en darse cuenta de que la información de fase podía leerse directamente a partir de la transformada de Fourier de una imagen de microscopía electrónica escaneada en una computadora, ya en 1968. Por esto y sus estudios sobre las estructuras de los virus y ARN de transferencia, Klug recibió el Premio Nobel de Química en 1982.

Daño por radiación

Un problema común de la cristalografía de rayos X y la cristalografía electrónica es el daño por radiación , por el cual se dañan especialmente las moléculas y proteínas orgánicas mientras se toman imágenes, lo que limita la resolución que se puede obtener. Esto es especialmente problemático en el contexto de la cristalografía electrónica, donde el daño de la radiación se centra en muchos menos átomos. Una técnica utilizada para limitar el daño por radiación es la criomicroscopía electrónica , en la que las muestras se someten a criofijación y las imágenes se obtienen a temperaturas de nitrógeno líquido o incluso de helio líquido . Debido a este problema, la cristalografía de rayos X ha tenido mucho más éxito a la hora de determinar la estructura de proteínas que son especialmente vulnerables al daño por radiación. El daño por radiación se investigó recientemente utilizando MicroED [4] [5] de cristales 3D delgados en un estado hidratado congelado.

Estructuras de proteínas determinadas por cristalografía electrónica.

La primera estructura proteica cristalográfica electrónica que logró resolución atómica fue la bacteriorrodopsina , determinada por Richard Henderson y sus compañeros de trabajo en el Laboratorio de Biología Molecular del Consejo de Investigación Médica en 1990. [6] Sin embargo, ya en 1975 Unwin y Henderson habían determinado la primera estructura proteica de membrana en resolución intermedia (7 Ångström), que muestra por primera vez la estructura interna de una proteína de membrana, con sus hélices alfa perpendiculares al plano de la membrana. Desde entonces, se han determinado varias otras estructuras de alta resolución mediante cristalografía electrónica, incluido el complejo captador de luz , [7] el receptor nicotínico de acetilcolina , [8] y el flagelo bacteriano . [9] La estructura proteica de mayor resolución resuelta mediante cristalografía electrónica de cristales 2D es la del canal de agua acuaporina -0. [10] En 2012, Jan Pieter Abrahams y sus compañeros de trabajo ampliaron la cristalografía electrónica a nanocristales de proteínas 3D [11] mediante difracción de electrones por rotación (RED). [12]

Imagen de microscopía electrónica de un óxido de tantalio inorgánico, con su transformada de Fourier, insertada. Observe cómo cambia la apariencia de la región superior delgada a la región inferior más gruesa. La celda unitaria de este compuesto mide aproximadamente 15 por 25 Ångström. Está delineado en el centro de la figura, dentro del resultado del procesamiento de imágenes, donde se ha tenido en cuenta la simetría. Los puntos negros muestran claramente todos los átomos de tantalio. La difracción se extiende a 6 órdenes a lo largo de la dirección de 15 Å y 10 órdenes en la dirección perpendicular. Por tanto, la resolución de la imagen EM es 2,5 Å (15/6 o 25/10). Esta transformada de Fourier calculada contiene amplitudes (como se ve) y fases (no mostradas).
Patrón de difracción de electrones del mismo cristal de óxido de tantalio inorgánico que se muestra arriba. Observe que hay muchos más puntos de difracción aquí que en el difractograma calculado a partir de la imagen EM de arriba. La difracción se extiende a 12 órdenes a lo largo de la dirección de 15 Å y 20 órdenes en la dirección perpendicular. Por tanto, la resolución del patrón ED es 1,25 Å (15/12 o 25/20). Los patrones de ED no contienen información de fase, pero las diferencias claras entre las intensidades de los puntos de difracción se pueden utilizar en la determinación de la estructura cristalina.

Aplicación a materiales inorgánicos.

Los estudios cristalográficos electrónicos en cristales inorgánicos utilizando imágenes de microscopía electrónica de alta resolución (HREM) fueron realizados por primera vez por Aaron Klug en 1978 [13] y por Sven Hovmöller y colaboradores en 1984. [14] Las imágenes HREM se utilizaron porque permiten seleccionar (por software de computadora) solo las regiones muy delgadas cercanas al borde del cristal para el análisis de la estructura (ver también procesamiento de imágenes cristalográficas ). Esto es de crucial importancia ya que en las partes más gruesas del cristal la función de onda de salida (que transporta la información sobre la intensidad y posición de las columnas de átomos proyectadas) ya no está relacionada linealmente con la estructura cristalina proyectada. Además, las imágenes HREM no solo cambian su apariencia al aumentar el espesor del cristal, sino que también son muy sensibles al ajuste elegido del desenfoque Δf de la lente del objetivo (consulte las imágenes HREM de GaN, por ejemplo). Para hacer frente a esta complejidad, se han desarrollado métodos basados ​​en el algoritmo multicorte de Cowley -Moodie [15] [16] y la teoría de imágenes no lineales [17] para simular imágenes; esto sólo fue posible [18] una vez que se desarrolló el método FFT. [19]

Hubo un serio desacuerdo en el campo de la microscopía electrónica de compuestos inorgánicos; mientras que algunos han afirmado que "la información de fase está presente en las imágenes EM", otros tienen la opinión opuesta de que "la información de fase se pierde en las imágenes EM". La razón de estos puntos de vista opuestos es que la palabra "fase" se ha utilizado con significados diferentes en las dos comunidades de físicos y cristalógrafos. Los físicos están más preocupados por la " fase de onda electrónica ", la fase de una onda que se mueve a través de la muestra durante la exposición a los electrones. Esta onda tiene una longitud de onda de aproximadamente 0,02-0,03 Ångström (dependiendo del voltaje de aceleración del microscopio electrónico). Su fase es relativa a la fase del haz de electrones directo no difractado. Los cristalógrafos, por otro lado, se refieren a la " fase del factor de estructura cristalográfica " cuando simplemente dicen "fase". Esta fase es la fase de ondas estacionarias de potencial en el cristal (muy similar a la densidad de electrones medida en cristalografía de rayos X). Cada una de estas ondas tiene su longitud de onda específica, llamada valor d para la distancia entre los llamados planos de Bragg de bajo/alto potencial. Estos valores d varían desde las dimensiones de la celda unitaria hasta el límite de resolución del microscopio electrónico, es decir, normalmente desde 10 o 20 Ångström hasta 1 o 2 Ångström. Sus fases están relacionadas con un punto fijo en el cristal, definido en relación con los elementos de simetría de ese cristal. Las fases cristalográficas son una propiedad del cristal, por lo que existen también fuera del microscopio electrónico. Las ondas de electrones desaparecen si se apaga el microscopio. Para determinar una estructura cristalina es necesario conocer los factores de la estructura cristalográfica, pero no las fases de las ondas electrónicas. Se puede encontrar una discusión más detallada sobre cómo las fases (factor de estructura cristalográfica) con las fases de la onda de electrones se pueden encontrar en [20] .

Al igual que con las proteínas, también se han podido determinar las estructuras atómicas de cristales inorgánicos mediante cristalografía electrónica. Para estructuras más simples es suficiente usar tres vistas perpendiculares, pero para estructuras más complicadas, también pueden ser necesarias proyecciones en diez o más diagonales diferentes.

Además de las imágenes de microscopía electrónica, también es posible utilizar patrones de difracción de electrones (ED) para la determinación de la estructura cristalina. [21] [22] Se debe tener sumo cuidado al registrar dichos patrones de ED desde las áreas más delgadas para mantener la mayor parte de las diferencias de intensidad relacionadas con la estructura entre las reflexiones (condiciones de difracción cuasi cinemática). Al igual que con los patrones de difracción de rayos X, las fases importantes del factor de estructura cristalográfica se pierden en los patrones de difracción de electrones y deben descubrirse mediante métodos cristalográficos especiales, como los métodos directos , la máxima verosimilitud o (más recientemente) el método de inversión de carga. Por otro lado, los patrones de DE de cristales inorgánicos suelen tener una alta resolución (= espaciamientos interplanares con altos índices de Miller ) muy por debajo de 1 Ångström. Esto es comparable a la resolución puntual de los mejores microscopios electrónicos. En condiciones favorables, es posible utilizar patrones de ED desde una única orientación para determinar la estructura cristalina completa. [23] Alternativamente, se puede utilizar un enfoque híbrido que utiliza imágenes HRTEM para resolver e intensidades de ED para refinar la estructura cristalina. [24] [25]

Se lograron avances recientes en el análisis de estructuras mediante ED mediante la introducción de la técnica de precesión de Vincent-Midgley [26] para registrar patrones de difracción de electrones. [27] Las intensidades así obtenidas suelen ser mucho más cercanas a las intensidades cinemáticas, [28] [29] de modo que incluso se pueden determinar estructuras que están fuera de rango cuando se procesan datos de difracción de electrones convencionales (área seleccionada). [30] [31]

La calidad de las estructuras cristalinas determinadas mediante cristalografía electrónica se puede comprobar mediante cálculos de primeros principios dentro de la teoría funcional de la densidad (DFT). Este enfoque se ha utilizado para ayudar a resolver estructuras de superficie [32] y para la validación de varias estructuras ricas en metales a las que solo se podía acceder mediante HRTEM y ED, respectivamente. [33] [34]

Recientemente, se han determinado dos estructuras de zeolita muy complicadas mediante cristalografía electrónica combinada con difracción de rayos X en polvo. [35] [36] Estas son más complejas que las estructuras de zeolita más complejas determinadas por cristalografía de rayos X.

Referencias

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Otras lecturas

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