El circuito de retroalimentación de transcripción-traducción ( TTFL ) es un modelo celular para explicar los ritmos circadianos en el comportamiento y la fisiología . Ampliamente conservado en todas las especies, el TTFL es autorregulador, en el que la transcripción de los genes del reloj está regulada por sus propios productos proteicos.
Los ritmos circadianos están documentados desde hace siglos. Por ejemplo, el astrónomo francés Jean-Jacques d'Ortous de Mairan observó el movimiento periódico de 24 horas de las hojas de la planta Mimosa ya en 1729. Sin embargo, la ciencia sólo recientemente ha comenzado a descubrir los mecanismos celulares responsables de impulsar los ritmos circadianos observados. La base celular de los ritmos circadianos está respaldada por el hecho de que se han observado ritmos en organismos unicelulares [1]
A partir de la década de 1970, los experimentos realizados por Ron Konopka y sus colegas, en los que se utilizaron métodos genéticos directos para inducir mutaciones, revelaron que los especímenes de Drosophila melanogaster con genes de período ( Per ) alterados también demostraban una periodicidad alterada. A medida que mejoraron las herramientas experimentales de biología genética y molecular, los investigadores identificaron genes implicados en el mantenimiento del comportamiento rítmico normal, dando lugar al concepto de que los ritmos internos son modificados por un pequeño subconjunto de genes del reloj central. Hardin y colegas (1990) fueron los primeros en proponer que el mecanismo que impulsa estos ritmos era un circuito de retroalimentación negativa. Grandes descubrimientos posteriores confirmaron este modelo; en particular, experimentos dirigidos por Thomas K. Darlington y Nicholas Gekakis a finales de la década de 1990 que identificaron proteínas de reloj y caracterizaron sus métodos en Drosophila y ratones, respectivamente. Estos experimentos dieron lugar al modelo de circuito de retroalimentación de transcripción-traducción (TTFL) que ahora se ha convertido en el paradigma dominante para explicar el comportamiento circadiano en una amplia gama de especies. [2]
El TTFL es un circuito de retroalimentación negativa , en el que los genes reloj están regulados por sus productos proteicos. Generalmente, el TTFL involucra dos brazos principales: elementos reguladores positivos que promueven la transcripción y productos proteicos que suprimen la transcripción. Cuando un elemento regulador positivo se une a un promotor del gen reloj , la transcripción continúa, lo que da como resultado la creación de una transcripción de ARNm , y luego continúa la traducción , lo que da como resultado un producto proteico. Existen retrasos característicos entre la acumulación de transcritos de ARNm, la acumulación de proteínas y la supresión de genes debido a la dinámica de traducción, la modificación postraduccional de proteínas , la dimerización de proteínas y el viaje intracelular al núcleo . [3] En todas las especies, las proteínas involucradas en el TTFL contienen motivos estructurales comunes, como dominios PAS , involucrados en interacciones proteína-proteína, y dominios bHLH , involucrados en la unión al ADN. [4]
Una vez que se acumulan suficientes productos proteicos modificados en el citoplasma , se transportan al núcleo, donde inhiben el elemento positivo del promotor para detener la transcripción de los genes del reloj. Por lo tanto, el gen reloj se transcribe en niveles bajos hasta que sus productos proteicos se degradan, lo que permite que los elementos reguladores positivos se unan al promotor y reinicien la transcripción. El circuito de retroalimentación negativa del TTFL tiene múltiples propiedades importantes para el reloj circadiano celular. En primer lugar, produce ritmos diarios tanto en la transcripción genética como en la abundancia y el tamaño de las proteínas, causados por el retraso entre la traducción y la regulación negativa del gen. El período del ciclo, o el tiempo necesario para completar un ciclo, permanece constante en cada individuo y, salvo mutación, suele ser de cerca de 24 horas. Esto permite un arrastre estable al ciclo de luz y oscuridad de 24 horas que experimenta la Tierra. Además, los productos proteicos de los genes del reloj controlan genes posteriores que no forman parte del circuito de retroalimentación, lo que permite que los genes del reloj creen ritmos diarios en otros procesos, como el metabolismo, dentro del organismo. [3] Por último, el TTFL es un ciclo límite, lo que significa que es un circuito cerrado que volverá a su trayectoria fija incluso si es perturbado, manteniendo la trayectoria oscilatoria en su período fijo de 24 horas. [5]
La presencia del TTFL está altamente conservada en todas las especies animales; sin embargo, muchos de los actores involucrados en el proceso han cambiado a lo largo del tiempo evolutivo dentro de diferentes especies. Existen diferencias en los genes y proteínas implicados en el TTFL al comparar plantas, animales, hongos y otros eucariotas. Esto sugiere que un reloj que sigue el modelo TTFL ha evolucionado varias veces durante la existencia de la vida. [6]
El TTFL se descubrió por primera vez en Drosophila y el sistema comparte varios componentes con el TTFL de los mamíferos. La transcripción de los genes del reloj, Period (per) y Timeless (tim) , se inicia cuando los elementos positivos Cycle (dCYC) y Clock (dCLK) forman un heterodímero y se unen a los promotores de la caja E , iniciando la transcripción. Durante el día TIM se degrada; la exposición a la luz facilita el atracón de CRY con TIM, lo que conduce a la ubiquitinación y eventual degradación de TIM. [7] Durante la noche, TIM y PER pueden formar heterodímeros y acumularse lentamente en el citoplasma, donde la quinasa DOUBLETIME (DBT) fosforila PER. La modificación postranscripcional de múltiples grupos fosfato apunta al complejo para su degradación y facilita la localización nuclear. En el núcleo, el dímero PER-TIM se une al dímero CYC-CLK, lo que hace que el dímero CYC-CLK se libere de las cajas E e inhibe la transcripción. Una vez que PER y TIM se degradan, los dímeros CYC-CLK pueden unirse nuevamente a las cajas E para iniciar la transcripción, cerrando el ciclo de retroalimentación negativa. [8]
Los bucles de retroalimentación secundarios interactúan con este bucle de retroalimentación primario. CLOCKWORK ORANGE (CWO) se une a las cajas E para actuar como un competidor directo de CYC-CLK, inhibiendo así la transcripción. LA PROTEÍNA PAR-DOMAIN 1 ε (PDP1ε) es un activador de retroalimentación y VRILLE (VRI) es un inhibidor de retroalimentación del promotor Clk, y su expresión es activada por dCLK-dCYC. La proteína 75 (E75) inducida por ecdisona inhibe la expresión de clk y se activa dependiente del tiempo por transcripción. Todos estos bucles secundarios actúan para reforzar el TTFL primario. [8]
El criptocromo en Drosophila es un fotorreceptor de luz azul que desencadena la degradación de TIM, lo que indirectamente conduce al reinicio de la fase del reloj y a la promoción renovada de la expresión. [8]
El modelo TTFL de mamíferos contiene muchos componentes que son homólogos de los que se encuentran en Drosophila. La forma en que funciona el sistema de los mamíferos es que BMAL1 forma un heterodímero con CLOCK para iniciar la transcripción de mPer y criptocromo ( cry ). Hay tres parálogos, o genes históricamente similares que ahora aparecen como una duplicación, del gen del período en mamíferos enumerados como mPer1 , mPer2 y mPer3 . También hay dos parálogos de criptocromo en los mamíferos. Las proteínas PER y CRY forman un heterodímero, y la fosforilación de PER por CK1δ y CK1ε regula la localización del dímero en el núcleo. En el núcleo, PER-CRY regula negativamente la transcripción de sus genes afines al unirse a BMAL1-CLOCK y provocar su liberación del promotor E-box. [8]
Aunque los parálogos de mPer funcionan juntos como un ortólogo funcional de dPer , cada uno de ellos tiene una función distinguida. mPer1 y mPer2 son necesarios para el funcionamiento del reloj cerebral, mientras que mPer3 sólo desempeña un papel discernible en los ritmos circadianos de los tejidos periféricos. Noquear a mPer1 o mPer2 provoca un cambio en el período, con los nocauts mPer1 corriendo libremente con un período más corto y los nocauts mPer2 corriendo libremente con un período más largo en comparación con el tau original antes de volverse arrítmico. De manera similar, las eliminaciones de mCry1 dan como resultado un período más corto y las eliminaciones de mCry2 resultan en un período más largo, con una doble eliminación de mCry1 /m Cry2 que resulta en arritmicidad. [8]
También existen bucles secundarios en los mamíferos, aunque son más complejos que los observados en Drosophila . Al igual que CWO en Drosophila , los eliminados en el cáncer de esófago1,2 (Dec1 Dec2) reprimen la expresión de mPer uniendo cajas E que evitan que CLOCK-BMAL1 se una a sus objetivos. Los receptores REV-ERB y el receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico (ROR) desempeñan un papel similar al PDP1ε y VRI en Drosophila , excepto que regulan el socio de unión de CLOCK, BMAL1, en lugar de regular directamente CLOCK. La proteína de unión al sitio D (DBP) y la proteína de unión a E4 (E4BP4) se unen a la secuencia promotora de D-Box para regular la expresión de mPer . [8]
La forma en que estos genes se relacionan con Drosophila melanogaster se ve en la función de cada uno de los genes y cómo han cambiado evolutivamente. BMAL1 es un ortólogo de CYCLE . Esto significa que BMAL1 y CYCLE parecen tener una historia común, pero se encuentran en especies diferentes. Otro ejemplo de los paralelismos entre Drosophila melanogaster y los mamíferos también se ve en cry y mPer, ya que son ortólogos funcionales de per y tim . [8]
La frecuencia genética ( frq ) de Neurospora fue identificada como el segundo gen reloj conocido en 1979 por JF Feldman y sus colegas. Frq fue clonado por primera vez en 1989 por CR McClung y sus colegas. Este gen fue de particular interés porque su expresión es muy compleja en comparación con otros genes microbianos conocidos. Dos proteínas reguladoras positivas, White Collar-1 (WC-1) y White Collar-2 (WC-2), se unen al promotor frq, que se llama Clock Box, durante la noche subjetiva para activar la transcripción. La luz también es importante para inducir la expresión de FRQ; WC-1 es un fotopigmento y la luz permite que WC-1 y WC-2 se unan a otro promotor llamado elemento de respuesta a la luz proximal (PLRE). La proteína FRQ regula negativamente la actividad de WC-1 y WC-2. Varias quinasas (CK1, CK2 y PRD-4/punto de control quinasa 2) y fosfatasas (PP1 y PP2A) regulan la capacidad de FRQ para translocarse al núcleo y la estabilidad de FRQ, WC-1 y WC-2. [9]
El primer modelo TTFL se propuso para Arabidopsis thaliana en 2001 e incluía dos factores de transcripción MYB, HIPOCOTILO ELONGADO TARDÍO (LHY), ASOCIADO 1 AL RELOJ CIRCADIANO (CCA1) y TIEMPO DE EXPRESIÓN CAB 1 (TOC1). CCA1 y LHY se expresan por la mañana e interactúan entre sí para reprimir la expresión de TOC1. La expresión de CCA1 y LHY disminuye en la oscuridad, lo que permite que TOC1 se exprese y regule negativamente la expresión de CCA1 y LHY. CCA1 y LHY también pueden unirse a su propio promotor para reprimir su propia transcripción. [10]
Existe un segundo bucle que involucra a PRR9, PRR7 y PRR5, que son todos homólogos de TOC1 y reprimen la expresión de CCA1 y LHY. Estos genes PRR están directamente reprimidos por LHY y TOC1. Estos genes también están regulados por el “complejo vespertino” (EC), que está formado por LUX ARRHYTHMO (LUX), FLORACIÓN TEMPRANA 3 (ELF3) y FLORACIÓN TEMPRANA 4 (ELF4). LUX es un factor de transcripción con una función similar a MYB, mientras que ELF3 y ELF4 son proteínas nucleares cuyas funciones se desconocen. El "complejo vespertino" promueve indirectamente la expresión de LHY y CCA1, que reprimen la transcripción de sus propios componentes. Dado que este modelo consta de dos inhibiciones que conducen a una activación, también se le conoce como represilador. [10]
Un bucle descubierto recientemente incluye la familia de genes diana ( diana ), que se expresan por la mañana e inducen la transcripción de genes vespertinos como PRR5, TOC1, LUX y ELF4. Una vez que se traducen las proteínas resultantes, PRR9, PRR7 y PRR5 reprimen RVE8. RVE8 también interactúa con los componentes matutinos INDUCIBLES POR LUZ NOCTURNA Y REGULADOS POR RELOJ (LNK1, 2, 3 y 4), y los LNK antagonizan o coactivan RVE8. [10]
Aunque GIGANTEA (GI) no se conoce como una parte central del modelo TTFL de Arabdopsis , está reprimida por CCA1, LHY y TOC1. Además, GI activa la expresión de CCA1 y LHY. [10]
Los estudios del reloj de las cianobacterias llevaron al descubrimiento de tres genes de reloj esenciales: KaiA , KaiB y KaiC . Inicialmente, se pensaba que estas proteínas seguían el modelo TTFL similar al propuesto para eukarya , ya que había un patrón diario en la abundancia de ARNm y proteínas y el nivel de fosforilación, retroalimentación negativa de las proteínas en sus genes afines, reinicio de la fase del reloj en respuesta a Sobreexpresión de KaiC y actividad de Kai modificada a través de interacciones entre sí. [11] Cada uno de estos resultados fue consistente con la comprensión del TTFL en ese momento. Sin embargo, estudios posteriores han concluido que las modificaciones postraduccionales, como la fosforilación, son más importantes para el control del reloj. Cuando los promotores de las proteínas Kai fueron reemplazados por promotores no específicos, no hubo interrupción del circuito de retroalimentación central, como se esperaría si la inhibición se produjera a través de la retroalimentación de las proteínas sobre sus promotores específicos. Como consecuencia, se ha determinado en gran medida que el modelo TTFL es inexacto para las cianobacterias; La regulación transcripcional no es el proceso central que impulsa los ritmos de las cianobacterias. Aunque la regulación transcripcional y traduccional está presente, se consideró que eran efectos del reloj y no necesarios para su funcionamiento. [12]
También se han descubierto bucles de retroalimentación postraduccional (PTFL) implicados en la regulación del gen del reloj, que a menudo funcionan en conjunto con el modelo TTFL. Tanto en mamíferos como en plantas, las modificaciones postraduccionales, como la fosforilación y la acetilación, regulan la abundancia y/o actividad de los genes y proteínas del reloj. Por ejemplo, se ha demostrado que los niveles de fosforilación de los componentes de TTFL varían rítmicamente. Estas modificaciones postraduccionales pueden servir como señales de degradación, reguladores de unión y señales para el reclutamiento de factores adicionales. [13]
En particular, las cianobacterias demuestran cambios rítmicos de 24 horas en la fosforilación en un circuito de retroalimentación que es independiente de la transcripción y la traducción: los ritmos circadianos en la fosforilación se observan cuando el circuito de retroalimentación de las proteínas Kai se colocan en un tubo de ensayo con ATP, independientemente de cualquier otra maquinaria celular. . Se acepta ampliamente que este sistema postraduccional de tres proteínas es el oscilador central, necesario y suficiente para impulsar los ritmos diarios. [14] Además del sistema Kai en las cianobacterias, se ha demostrado que la oxidación de las proteínas peroxiredoxina ocurre independientemente de la transcripción y traducción tanto en los glóbulos rojos de los mamíferos como en las células de las algas Ostreococcus tauri ; Se ha visto que este sistema se conserva en muchos organismos. [15] No está claro si el sistema de peroxiredoxina interactúa con relojes basados en TTFL o es en sí mismo parte de un nuevo reloj basado en PTFL. Sin embargo, ambos hallazgos implican que en algunos organismos o tipos de células, los PTFL son suficientes para impulsar los ritmos circadianos.