Timeless ( tim ) es un gen en múltiples especies, pero es más notable por su papel en Drosophila para codificar TIM, una proteína esencial que regula el ritmo circadiano . El ARNm y la proteína atemporales oscilan rítmicamente con el tiempo como parte de un circuito de retroalimentación negativa de transcripción-traducción que involucra al gen period ( per ) y su proteína.
En 1994, se descubrió lo atemporal mediante un análisis genético realizado por Jeffery L. Price mientras trabajaba en el laboratorio de Michael W. Young . [1] Este gen se encontró cuando notaron un mutante arrítmico tim 01 a través de una pantalla del elemento P. [2] [3] La mutación tim 01 provocó un comportamiento arrítmico, definido por la falta de capacidad para establecer ritmos circadianos adecuados. [1] En 1995, el gen atemporal fue clonado por Amita Sehgal y sus socios en el laboratorio de Michael W. Young. [4] A diferencia del gen atemporal de Drosophila , se han descubierto homólogos en otras especies que no son esenciales para el ritmo circadiano. [5] El descubrimiento de lo atemporal siguió al descubrimiento de los mutantes de período en 1971 a través de un análisis genético avanzado, la clonación de per en 1984 y un experimento que determinó que per es circadiano en 1990. Esto ocurrió durante un período de rápida expansión en el campo. de la cronobiología en la década de 1990.
La longitud de la región codificante del gen intemporal de Drosophila es de 4029 pares de bases, a partir de las cuales se transcribe una proteína de 1398 aminoácidos . [6] El gen comienza en un sitio de tapa de consenso aguas arriba de un codón de metionina . Contiene 11 exones y 10 intrones . En varias especies de Drosophila , la proteína eterna TIM contiene dominios funcionales y secuencias de aminoácidos más conservados que su contraparte, PER (proteína codificada por per ). CLD fue la menos conservada de estas regiones entre D. virilis y D. melanogaster . [6] Estas partes conservadas incluyen: el dominio de interacción PER, la señal de localización nuclear (NLS), el dominio de localización citoplasmática (CLD), el extremo N-terminal (no funcional) y el extremo C-terminal . [6] También se sabe que TIM tiene una región básica, que interactúa con el dominio PAS de la proteína PER, y una región ácida central. También hay una región de función desconocida cerca del extremo N de la proteína TIM que contiene una secuencia de 32 aminoácidos que, cuando se elimina, provoca un comportamiento arrítmico en la mosca. En varias especies de Drosophila, como D. virilis y D. melanogaster , la metionina iniciadora para la traducción del gen intemporal a TIM se encuentra en diferentes lugares, con el sitio de inicio de D. virilis aguas abajo del sitio de inicio en D. melanogaster . [6]
El gen atemporal es un componente esencial del reloj circadiano molecular en Drosophila . [3] Actúa como parte de un circuito de retroalimentación autorreguladora junto con el producto del período (por) gen, como se observa en estudios colaborativos realizados por los laboratorios de Michael W. Young y Amita Sehgal. [7] Estudios adicionales realizados por los laboratorios de Young, Sehgal, Charles Weitz y Michael Rosbash indicaron que la proteína atemporal (TIM) y la proteína de período (PER) forman un heterodímero que exhibe ritmos circadianos en Drosophila de tipo salvaje . [8] [9] Los investigadores en el laboratorio de Rosbash también demostraron que los niveles de ARNm de tim y los niveles de proteína TIM tienen ritmos circadianos que son similares a los del ARNm del período ( per ) y su producto. [8] [10] [11] Los experimentos realizados conjuntamente por los laboratorios Weitz, Young y Sehgal utilizando levadura 2-híbrido demostraron que TIM se une directamente con PER. [12] Durante las primeras horas de la noche, PER y TIM se dimerizan y acumulan. A altas horas de la noche, el dímero viaja al núcleo para inhibir la transcripción per y tim . En 1996, los equipos de Sehgal, Edery y Young descubrieron que la exposición a la luz provoca la degradación de TIM y posteriormente de PER. [1] [11] [13]
El heterodímero PER/TIM regula negativamente la transcripción de los genes period ( per ) y timeless ( tim ). Dentro de este circuito de retroalimentación negativa, primero se forman los heterodímeros PER/TIM en el citoplasma, se acumulan y luego se translocan al núcleo. [14] El complejo luego bloquea los factores de transcripción positivos reloj (CLK) y ciclo (CYC), reprimiendo así la transcripción de per .
Como parte del reloj circadiano, la atemporalidad es esencial para adaptarse a los ciclos de luz y oscuridad (LD). La duración típica del período de Drosophila en libertad es de 23,9 horas, lo que requiere adaptaciones al ciclo ambiental de 24 horas. [15] La adaptación comienza primero con la exposición a la luz. Este proceso conduce a la rápida degradación de la proteína TIM, lo que permite a los organismos incorporarse al amanecer a los ciclos ambientales. [dieciséis]
En los ciclos de luz y oscuridad, el nivel de proteína TIM disminuye rápidamente a altas horas de la noche o temprano en la mañana, seguido de cambios similares pero más graduales en el nivel de proteína PER. La degradación de TIM es independiente de per y su proteína, y libera PER del complejo PER/TIM. [8] En algunos tipos de células, la proteína fotorreceptora criptocromo (CRY) se asocia físicamente con TIM y ayuda a regular la degradación dependiente de la luz. CRY se activa mediante luz azul, que se une a TIM y lo marca para su degradación. [17] Esto pone fin a la represión PER/TIM de la transcripción mediada por CLK/CYC de los genes per y tim , permitiendo que se produzca ARNm de per y tim para reiniciar el ciclo. [8]
Este mecanismo permite el arrastre de moscas hacia señales de luz ambientales. Cuando Drosophila recibe entradas de luz en las primeras horas de la noche subjetiva, la degradación de TIM inducida por la luz provoca un retraso en la acumulación de TIM, lo que crea un retraso de fase. [17] Cuando se reciben entradas de luz a altas horas de la noche subjetiva, un pulso de luz provoca que la degradación del TIM se produzca antes que en condiciones normales, lo que lleva a un avance de fase. [17]
En Drosophila , el regulador negativo PER, del complejo PER/TIM, finalmente se degrada mediante un ciclo de fosforilación mediado por caseína quinasa , lo que permite fluctuaciones en la expresión genética según señales ambientales. Estas proteínas median la expresión oscilante del factor de transcripción VRILLE (VRI), que es necesario para la ritmicidad del comportamiento, la expresión per y tim y la acumulación de PDF (factor de dispersión de pigmentos). [dieciséis]
Timeless no parece ser esencial para la oscilación del reloj circadiano de todos los insectos. En Gryllus bimaculatus de tipo salvaje , el ARNm de tim muestra una expresión rítmica tanto en LD como en DD (ciclos oscuro-oscuro) similar a la de per , alcanzando su punto máximo durante la noche subjetiva. Cuando se inyectó ARN bicatenario de tim ( dstim ), los niveles de ARNm de tim se redujeron significativamente y se eliminó su ritmo de expresión circadiano. Sin embargo, después del tratamiento con dstim , los grillos adultos mostraron un ritmo locomotor claro en constante oscuridad, con un período de funcionamiento libre significativamente más corto que el de los grillos de control inyectados con Discosoma sp. ARNbc de Red2 (DsRed2). Estos resultados sugieren que en el grillo, tim desempeña algún papel en el ajuste del período de funcionamiento libre, pero puede no ser esencial para la oscilación del reloj circadiano. [5]
En 1998, los investigadores identificaron un homólogo de ratón y un homólogo humano del gen atemporal de Drosophila . [18] El papel exacto de TIM en los mamíferos aún no está claro. Un trabajo reciente sobre el atemporal de los mamíferos ( mTim ) en ratones ha sugerido que el gen puede no desempeñar el mismo papel esencial en los mamíferos que en Drosophila como función necesaria del reloj circadiano. [19] Si bien Tim se expresa en el núcleo supraquiasmático (SCN), que se cree que es el oscilador principal en los humanos, su transcripción no oscila rítmicamente en condiciones constantes y la proteína TIM permanece en el núcleo. [19] [20]
Sin embargo, se ha demostrado que mTim es necesario para el desarrollo embrionario en ratones, lo que indica una función genética diferente a la de Drosophila . Esto sugiere una divergencia entre los relojes de los mamíferos y el reloj de Drosophila . [19] Además, el tim de los mamíferos es más ortólogo del parálogo Tim-2 ( Timeout ) del gen Timeless de Drosophila que el gen mismo. [21] Al igual que tim-2 , los ortólogos de mamíferos tienen un dominio de unión a PARP1 (PAB) C-terminal. El complejo del que forman promueve la reparación del ADN por recombinación homóloga . [22]
Se cree que esta proteína eterna conecta directamente el ciclo celular con el ritmo circadiano en los mamíferos. En este modelo. Conocido como “acoplamiento directo”, [23] los dos ciclos comparten una proteína clave cuya expresión exhibe un patrón circadiano. El papel esencial de Tim en Drosophila en la creación del ritmo circadiano lo cumple Cry en los mamíferos. En los mamíferos, la transcripción Cry y Per es activada por el complejo CLOCK / BMAL1 y reprimida por el complejo PER/CRY. [24]
Se ha demostrado que la proteína intemporal humana (hTIM) es necesaria para la producción de oscilaciones eléctricas producidas por el núcleo supraquiasmático (SCN), el reloj principal que gobierna todos los ritmos circadianos específicos de los tejidos del cuerpo. [25] Esta proteína también interactúa con los productos de los principales genes de reloj CLOCK , BMAL , PER1 , PER2 y PER3 .
Sancar y sus colegas investigaron si hTIM desempeñaba un papel similar a los ortólogos en C. elegans y tipos de levadura, que se sabe que desempeñan funciones importantes en el ciclo celular . [23] Sus experimentos sugirieron que hTIM desempeña un papel integral en los puntos de control del ciclo celular G2/M e intra-S. [23] Con respecto al punto de control G2/M, hTIM se une a la subunidad ATRIP en ATR , una proteína quinasa sensible al daño del ADN. Esta unión entre hTIM y ATR conduce a la fosforilación de Chk1 , lo que resulta en la detención del ciclo celular o apoptosis. [23] Este proceso sirve como un control importante para detener la proliferación de células con daño en el ADN antes de la división mitótica . El papel de hTIM en el punto de control intra-S es menos claro a nivel molecular; sin embargo, la regulación negativa de hTIM conduce a un aumento en la tasa de generación de horquillas de replicación, incluso en presencia de daño en el ADN y otras respuestas regulatorias. [23]
También se ha descubierto que el gen Timeless influye en el desarrollo de enfermedades en humanos. La regulación negativa del gen atemporal en células de carcinoma humano conduce a telómeros acortados , lo que indica su papel en el mantenimiento de la longitud de los telómeros. El daño al ADN asociado a los telómeros también aumenta en las células agotadas crónicamente , junto con el retraso en la replicación de los telómeros. Swi1 es una proteína relacionada con el tiempo que se requiere para la replicación del ADN en la región de los telómeros. [26] Esta asociación entre el tiempo y los telómeros es indicativa de la posible asociación del gen con el cáncer. [27]
Una sustitución de polimorfismo de un solo nucleótido que da como resultado la transformación de glutamina en arginina en la secuencia de aminoácidos del gen atemporal humano no muestra asociación ni con las tendencias matutinas ni vespertinas en los humanos. [28] Esto es consistente con otras investigaciones, que sugieren que htim no es importante en el ritmo circadiano de los humanos.
Ahora se encuentra con frecuencia que Timeless está sobreexpresado en muchos tipos de tumores diferentes. En un estudio que utilizó oligos de ARNip dirigidos a Timeless , seguidos de un microarray de expresión del genoma completo y un análisis de red. Pruebas adicionales de la regulación negativa de Timeless en las tasas de proliferación celular de una línea celular de cáncer de cuello uterino y de mama. Se descubrió que la expresión elevada de Timeless se asociaba significativamente con un estadio tumoral más avanzado y un peor pronóstico del cáncer de mama. [29] La similitud en las firmas de expresión genética ha permitido que TIMELESS sea identificado como un supresor de quinasa similar a Ras -1 (KSR1) y un objetivo potencial necesario para la supervivencia de las células cancerosas. La sobreexpresión de TIMELESS representa una vulnerabilidad en los tumores impulsados por Ras que ofrece información potencial sobre objetivos novedosos y selectivos que se encuentran en los cánceres impulsados por Ras, que pueden aprovecharse para desarrollar terapias selectivas y más efectivas. [30]