El gen de frecuencia ( frq ) codifica la proteína frecuencia (FRQ) que funciona en el reloj circadiano de Neurospora crassa . La proteína FRQ desempeña un papel clave en el oscilador circadiano, ya que sirve para nuclear el complejo de elementos negativos en el circuito de retroalimentación negativa de transcripción-traducción autorregulador (TTFL) que es responsable de los ritmos circadianos en N. crassa . [1] Se encuentran ritmos similares en mamíferos, Drosophila y cianobacterias. Recientemente, se han identificado homólogos de FRQ en varias otras especies de hongos. [2] La expresión de frq está controlada por los dos factores de transcripción white collar-1 (WC-1) y white collar-2 (WC-2) que actúan juntos como el White Collar Complex (WCC) y sirven como elemento positivo en la TTFL. La expresión de frq también se puede inducir mediante exposición a la luz de manera dependiente de WCC. La genética directa ha generado muchos alelos de frq, lo que ha dado como resultado cepas cuyos relojes circadianos varían en la duración del período.
El locus frq fue descubierto por Jerry F. Feldman. Feldman había sido estudiante de posgrado con Colin Pittendrigh en Princeton y fue a Caltech en 1967 para comenzar a realizar pruebas genéticas para detectar mutantes del reloj circadiano. La selección contó con la ayuda de trabajos recientes que mejoraron la expresión del ritmo en Neurospora . Colin Pittendrigh y sus colegas habían confirmado en 1959 que el ciclo diario de desarrollo asexual, descrito anteriormente en Neurospora crassa por Brandt, [3] se debía en realidad a la regulación por un reloj circadiano . [4] En un trabajo publicado poco antes de que Feldman llegara a Caltech, Malcolm L. Sargent, Winslow R. Briggs y Dow O. Woodward de la Universidad de Stanford informaron que la expresión abierta del ritmo de desarrollo en la conidiación aumentaba en una cepa de Neurospora llamada Timex. . [5] (Esta cepa contenía una mutación en la banda del locus (bd) , que luego se demostró que codificaba un alelo ligeramente hiperactivo de ras-1, por lo que las cepas ahora se conocen como ras-1[bd] . [6] Debido a que los ritmos en las cepas que incluyen ras-1[bd] son más fáciles de detectar, ras-1[bd] a menudo se incorpora en cepas utilizadas para estudios de biología circadiana en Neurospora [6 ] . Las salidas del reloj circadiano de Neurospora incluyen la síntesis de carotenoides , así como la formación de esporas asexuales que se observa en los tubos de carreras, y la evidencia reciente sugiere que miles de genes están bajo control circadiano. [7] [2]
Feldman usó nitrosoguanidina como mutágeno y usó tubos de carreras para detectar cepas individuales que sobrevivieron a la mutagénesis durante su período circadiano. Los tubos Race son tubos de vidrio largos y huecos doblados en cada extremo para contener un medio de crecimiento de agar. Cuando se inocula Neurospora en un extremo de un tubo, crecerá hasta el otro extremo y, en constante oscuridad, se manifiesta el ciclo circadiano diario de crecimiento y desarrollo. [8] Aunque las pruebas de Feldman tuvieron éxito, tardó en publicarlas, por lo que la identidad de los genes mutantes frq [1], frq [2] y frq [3] no se informó hasta 1973. [9] En 1986, frq fue clonado por Jay Dunlap y sus colegas utilizaron una estrategia que implicó un largo recorrido cromosómico y la aplicación exitosa de la estrategia entonces no probada de rescatar un mutante de comportamiento arrítmico mediante la transformación del ADN exógeno que surge del recorrido cromosómico. El éxito de esta estrategia y de la clonación de un gen del reloj despertó el interés en seguir investigando y comprendiendo el reloj circadiano de N. crassa . [10] Más tarde se demostró que la expresión de frq tenía un ciclo rítmico; Además, cuando se diseñaron cepas de Neurospora en las que la expresión de frq podía ser impulsada desde una región distinta del gen residente de tipo salvaje , se descubrió que FRQ reprimió su propia expresión y que ningún nivel de expresión constante podía soportar un reloj circadiano. [11] Estos experimentos fueron los primeros en manipular la expresión de un gen del reloj a través de medios que no afectaban al reloj y establecieron que la retroalimentación negativa autorreguladora que daba lugar a la expresión del gen del reloj cíclico se encontraba en el núcleo del oscilador circadiano.
Como reflejo de su papel como proteína del reloj central, la eliminación del gen frq produce arritmicidad y, en Neurospora , la única función de FRQ es el reloj circadiano. El gen frq puede activarse a partir de dos secuencias distintas que actúan en cis en su promotor, un sitio distal, la caja del reloj, utilizado en el contexto de la regulación circadiana, y un sitio cercano al sitio principal de inicio de la transcripción que se utiliza para la regulación de la luz. expresión inducida (el elemento regulador de luz proximal o PLRE). Estas transcripciones frq tienen capacidad para codificar dos proteínas FRQ, una forma larga de 989 aminoácidos (lFRQ) y una forma corta de 890 aminoácidos (sFRQ); Tanto el lFRQ como el sFRQ son necesarios para una ritmicidad fuerte, aunque el reloj puede persistir a ciertas temperaturas, aunque con una ritmicidad más débil, con solo una de las proteínas presente. [13] La elección de qué proteína se realiza es el resultado del corte y empalme dependiente de la temperatura del transcrito primario, de modo que incluya o excluya el codón de inicio ATG para lFRQ. [14] Las dos formas de FRQ proporcionan al reloj de Neurospora un mayor rango de temperaturas sobre las cuales puede funcionar de manera óptima. Un aumento de temperatura conduce a una mayor expresión de lFRQ, mientras que sFRQ no se ve afectado. Las temperaturas más cálidas inducen un empalme más eficiente de un intrón en el sitio de inicio de la traducción. [7] Debido a que sFRQ favorece un período más largo que lFRQ, los ritmos de carrera libre en Neurospora de tipo salvaje disminuyen algo con el aumento de temperatura. [7]
También se ha demostrado que FRQ interactúa con varias otras proteínas. Interactúa en todo momento con FRH (ARN helicasa que interactúa con FRQ ; una ARN helicasa que contiene una caja DEAD esencial en Neurospora ) para formar un complejo FRQ/FRH (FFC). [15] [16] FRQ también interactúa de manera estable con la caseína quinasa 1 (CK1), aunque la fuerza de la interacción cambia con la hora del día. Se conocen interacciones adicionales con otras quinasas, incluidas PRD-4 (CHK2) [17] y caseína quinasa 2 (CKII).
Los programas de predicción estructural sugieren que es probable que sólo unas pocas regiones de FRQ se plieguen en estructuras estables y, de acuerdo con esto, una variedad de datos experimentales indican que FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada . [18] En ausencia de su socio FRH, FRQ es muy inestable. Se predice que la innumerables fosforilación específica de la hora del día que caracteriza a FRQ proporcionará estructura a esta proteína que de otro modo estaría desordenada. No se conoce ninguna estructura de dominio para FRQ debido a su estructura altamente desordenada.
Normalmente, las proteínas muestran un sesgo en el uso de codones, por lo que es más probable que elijan codones sinónimos que están más disponibles en su conjunto de ARNt . Neurospora crassa tiene un sesgo de uso de codones relativamente fuerte en comparación con S. cerevisiae , un organismo comúnmente utilizado para el análisis de optimización de codones. Sin embargo, debido a que FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada, no tiene un sesgo demostrado en el uso de codones. De hecho, cuando se optimizan sus codones, la proteína pierde su función y el reloj se altera. Este no es el caso de los genes del reloj de las cianobacterias , kaiB y kaiC , que condujeron a una función del reloj más robusta. [19]
Una descripción de la regulación de frq y FRQ requiere una descripción del ciclo de reloj. La base molecular del oscilador circadiano en Neurospora comienza con dos complejos proteicos. Uno es el FFC, el complejo de elementos negativos compuesto por dos copias de FRQ, FRH y caseína quinasa 1, así como, probablemente, otras proteínas menos fuertemente unidas. [16] El otro complejo que actúa como elemento positivo en el circuito de retroalimentación incluye WC-1 y WC-2; son factores de transcripción GATA que, juntos, forman el WCC heterodimérico a través de sus dominios PAS . [21] Cuando WCC se libera del complejo de elementos negativos FFC durante la noche subjetiva, se une a la caja de reloj dentro del promotor del gen de frecuencia ( frq ) y activa la transcripción frq . [22] [23] Recientemente se ha demostrado que la histona H3 lisina 36 metiltransferasa , SET-2, es responsable de la metilación del gen frq para establecer un estado de cromatina que permitirá la transcripción de frq por parte del WCC. [24]
La proteína de frecuencia (FRQ) se acumula y es fosforilada progresivamente por CKI, CKII y una quinasa dependiente de calcio/calmodulina (CAMK-1), y quinasas adicionales, alcanzando su pico alrededor de la mitad del día subjetivo. [25] [26] [27] Los inhibidores de la quinasa reducen la degradación de FRQ al prevenir la fosforilación. [28] FRQ se fosforila en más de 100 sitios según análisis in vitro que utilizan espectrometría de masas de péptidos lFRQ. Estos sitios aparecen dentro de la proteína de una manera altamente reproducible, lo que indica que el momento de las fosforilaciones es importante. Además, la mutación de los sitios muestra que funcionan en dominios, con algunas fosforilaciones que sirven para alargar el período y otras para acortarlo. [dieciséis]
FRQ recluta quinasas como la caseína quinasa 1a (CK-1a) que fosforilan el WCC, aunque la función de estas fosforilaciones no está clara ya que el WCC hiperfosforilado permanece activo. Con el tiempo, la represión se alivia cuando el FRQ se fosforila tanto que el FFC ya no interactúa con el WCC. Este proceso ocurre con una periodicidad de alrededor de 22 horas en condiciones constantes. [29] Posteriormente, y con una cinética que no influye en el ciclo circadiano, este FRQ hiperfosforilado se degrada a través de la vía ubiquitina/proteosoma. El FRQ fuertemente fosforilado sufre un cambio conformacional que es detectado por la proteína FWD-1, que forma parte de la ligasa SCF tipo E3. [30]
FRQ forma un homodímero a través de su dominio en espiral ubicado cerca del extremo N. Esta dimerización es necesaria para que FRQ interactúe con el WCC y reprima su propia expresión. [31] La eliminación del WCC conduce a una incapacidad para formar el homodímero, lo que hace que frq ya no esté regulado negativamente por la concentración de FRQ. [31] Esto conduce a arritmicidad. [31]
Se ha propuesto un circuito de retroalimentación positiva entre FRQ y WCC, pero aún no se conocen los detalles. Se cree que el WCC se degrada cuando está transcripcionalmente activo, y que la prevención de esto causada por la FFC permite una acumulación de WCC. [32] Se ha demostrado que este mecanismo propuesto es posiblemente más complejo en el sentido de que FRQ puede regular WC-1 y WC-2 de forma independiente. [33] Recientemente, el factor de transcripción ADV-1 fue identificado como un transductor necesario de las salidas del reloj, incluida la ritmicidad circadiana en genes críticos para la fusión de células somáticas . [34]
El gen frq está fuertemente inducido por una exposición breve a la luz. Debido a que el núcleo del reloj se basa en la expresión rítmica de frq , la inducción de luz aguda proporciona una forma sencilla de restablecer el reloj. [35] Los relojes de los mamíferos se reinician mediante la luz mediante un mecanismo casi idéntico, siendo las transcripciones de mPer1 inducidas por breves destellos de luz fuera del día subjetivo. El mecanismo mPer1 en el reloj de los mamíferos tiene mayores similitudes con el mecanismo de Neurospora que con el mecanismo de su homólogo en Drosophila , según . [36]
La genética directa se ha utilizado para crear mutantes del reloj de Neurospora con distintos períodos de conidiación . Aunque se ha descrito que nueve alelos provienen de genética directa, el análisis de secuencia posterior a la clonación de frq mostró que frq [2], frq [4] y frq [6] compartían el mismo cambio de base única, y también frq [7 ] y frq [8] tuvieron el mismo cambio de base única, por lo que se eliminaron los alelos redundantes. [37] Los períodos de varios mutantes frq que surgieron de las pantallas directas son los siguientes cuando se miden a 25 °C, aunque debido a que frq [3] y frq [7] dan como resultado relojes con compensación de temperatura alterada, los períodos serán diferentes a otras temperaturas. :
Se han descubierto varios osciladores identificablemente distintos fuera del sistema FRQ/WCC; sin embargo, ninguna de estas oscilaciones sin FRQ (FLO) satisface las características para ser clasificadas como osciladores circadianos . [38] Se ha demostrado que el oscilador circadiano FRQ-WCC (FWO), a través de informes de luciferasa , continúa funcionando incluso cuando un FLO (el CDO u oscilador de deficiencia de colina que controla la conidiación en condiciones de limitación de colina) controla la conidiación. [38] En el mutante frq[9] Neurospora crassa , todavía se observó un ritmo de desarrollo de conidiosporas sin compensación de temperatura en oscuridad constante (DD). [39] El período para los mutantes nulos frq varió de 12 a 35 horas, pero pudo estabilizarse mediante la adición de farnesol o geraniol . Sin embargo, este mecanismo no se comprende bien. [40] Aunque este ritmo sin FRQ perdió ciertas características del reloj, como la compensación de temperatura, los pulsos de temperatura fueron suficientes para restablecer el reloj. [41] Otro FLO es el NRO o oscilador de nitrato reductasa que aparece en condiciones de falta de nitrato y se cree que surge de bucles de retroalimentación dentro de la vía de asimilación de nitrato; tiene una duración de aproximadamente 24 horas pero no tiene compensación de temperatura. [42] En resumen, hay mucha evidencia que respalda los osciladores sin FRQ en Neurospora crassa. Una forma de racionalizar esto es asumir que muchos son "esclavos" del oscilador de frecuencia/cuello blanco; No poseen todas las características de un reloj circadiano por sí solos porque lo proporciona el FWO. [40] Sin embargo, los ritmos en el gen-16 controlado por reloj (ccg-16) están acoplados al FWO pero funcionan de forma autónoma, lo que demuestra que Neurospora crassa contiene al menos 2 marcapasos potenciales, pero solo uno que puede restablecerse mediante luz y temperatura mientras manteniendo la compensación de temperatura. [40] [43] Nunca se ha demostrado que el oscilador sin FRQ afecte el verdadero reloj circadiano. [43] El mecanismo y la importancia de los osciladores sin FRQ (FLO) aún están bajo investigación.
La proteína FRQ se conserva dentro de Sordariacea pero diverge fuera de este grupo. [2] [44] No obstante, se han encontrado gallos circadianos auténticos basados en FRQ en organismos distintos de Neurospora , tanto dentro de Sordariacea , por ejemplo, en el destacado patógeno fúngico Botrytis, [45] como también en lugares tan lejanos como Pyronema [46] dentro de los pezizomicetos, un linaje de ascomicetos filamentosos de divergencia temprana. Frq se encontró incluso en un grupo de hongos que no pertenecen a Dikarya. El hallazgo de frq y el mecanismo del reloj circadiano conservado dentro de hongos micorrízicos arbusculares no Dikarya amplió la historia evolutiva de este gen en el reino fúngico. [47] frq parece divergir muy rápidamente durante su evolución. Una parte de la razón por la que la secuencia de aminoácidos primaria FRQ diverge tan rápidamente puede deberse a que es una proteína intrínsecamente desordenada y, como resultado, carece de las restricciones estructurales que limitan los cambios de secuencia. [48] [18] Dado que la optimización de codones del gen frq da como resultado una función del circuito de retroalimentación circadiana deteriorada , frq muestra un sesgo de uso de codones no óptimo en su marco de lectura abierto en contraste con la mayoría de los otros genes. [49] FRQ es una proteína intrínsecamente desordenada que no está bien conservada, incluso entre hongos. [50] Sin embargo, a diferencia de FRQ, WC-1 está muy bien conservado. Es el miembro fundador de la familia de fotorreceptores de luz azul utilizados en todo el Reino de los hongos. Además, es similar en estructura y función a BMAL1 . La caseína quinasa 2 se conserva en los osciladores circadianos de plantas ( Arabidopsis ) y moscas ( Drosophila ). [30] Una forma similar de CKI es necesaria para la degradación de las proteínas del período (PER) en Drosophila y mamíferos. [30] El gen slimb de Drosophila es ortólogo del FWD1 en Neurospora , los cuales son cruciales para la degradación de la proteína del reloj. [30] En general, los TTFL que se encuentran en hongos y animales comparten una arquitectura regulatoria similar, con un circuito de retroalimentación negativa de un solo paso, activadores heterodiméricos PAS-PAS que están conservados y proteínas de elementos negativos que en gran medida carecen de estructura y están mucho menos conservadas. . Una paleta similar de quinasas modifica las proteínas del reloj en todos los casos.