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Dedo de zinc

Representación esquemática del motivo de dedo de zinc de Cys2His2, que consta de una hélice α y una lámina β antiparalela . El ion de zinc (verde) está coordinado por dos residuos de histidina y dos residuos de cisteína .
Representación gráfica de la proteína Zif268 (azul) que contiene tres dedos de zinc en un complejo con ADN (naranja). Se destacan los residuos de aminoácidos coordinantes y los iones de zinc (verde).

Un dedo de zinc es un pequeño motivo estructural proteico que se caracteriza por la coordinación de uno o más iones de zinc (Zn 2+ ) que estabilizan el pliegue. Originalmente se acuñó para describir la apariencia similar a un dedo de una estructura hipotética del factor de transcripción IIIA de la rana africana con garras ( Xenopus laevis ) . Sin embargo, se ha descubierto que abarca una amplia variedad de estructuras proteicas diferentes en células eucariotas . [1] Se demostró originalmente que el TFIIIA de Xenopus laevis contenía zinc y requería el metal para funcionar en 1983, el primer requerimiento de zinc informado para una proteína reguladora de genes [2] [3] seguido poco después por el factor Krüppel en Drosophila . [4] A menudo aparece como un dominio de unión a metales en proteínas multidominio. [3]

Las proteínas que contienen dedos de zinc ( proteínas con dedos de zinc ) se clasifican en varias familias estructurales diferentes. A diferencia de muchas otras estructuras supersecundarias claramente definidas, como las llaves griegas o las horquillas β , existen varios tipos de dedos de zinc, cada uno con una arquitectura tridimensional única. La clase de una proteína con dedos de zinc en particular está determinada por su estructura tridimensional, pero también se puede reconocer en función de la estructura primaria de la proteína o la identidad de los ligandos que coordinan el ion de zinc. Sin embargo, a pesar de la gran variedad de estas proteínas, la gran mayoría funciona típicamente como módulos de interacción que se unen al ADN , ARN , proteínas u otras moléculas pequeñas y útiles, y las variaciones en la estructura sirven principalmente para alterar la especificidad de unión de una proteína en particular.

Desde su descubrimiento original y la elucidación de su estructura, estos módulos de interacción han demostrado ser omnipresentes en el mundo biológico y pueden encontrarse en el 3% de los genes del genoma humano. [5] Además, los dedos de zinc se han vuelto extremadamente útiles en diversas capacidades terapéuticas y de investigación. La ingeniería de los dedos de zinc para que tengan afinidad por una secuencia específica es un área de investigación activa, y las nucleasas de dedos de zinc y los factores de transcripción de dedos de zinc son dos de las aplicaciones más importantes de esto que se han realizado hasta la fecha.

Historia

Los dedos de zinc se identificaron por primera vez en un estudio de transcripción en la rana africana con garras , Xenopus laevis en el laboratorio de Aaron Klug . Un estudio de la transcripción de una secuencia de ARN particular reveló que la fuerza de unión de un pequeño factor de transcripción (factor de transcripción IIIA; TFIIIA) se debía a la presencia de estructuras similares a dedos que coordinaban el zinc. [6] La secuenciación de aminoácidos de TFIIIA reveló nueve secuencias en tándem de 30 aminoácidos, incluidos dos pares invariantes de residuos de cisteína e histidina. La estructura fina de absorción de rayos X extendida confirmó la identidad de los ligandos de zinc: dos cisteínas y dos histidinas. [5] Se pensó que el bucle de unión al ADN formado por la coordinación de estos ligandos por el zinc se parecía a los dedos, de ahí el nombre. [1] Esto fue seguido poco después por el descubrimiento del factor Krüppel en Drosophila por el equipo de Schuh en 1986. [4] Trabajos más recientes en la caracterización de proteínas en varios organismos han revelado la importancia de los iones de zinc en la estabilización de polipéptidos. [7] [8]

Las estructuras cristalinas de los complejos de dedos de zinc-ADN resueltas en 1991 y 1993 revelaron el patrón canónico de interacciones de los dedos de zinc con el ADN. [9] [10] Se ha descubierto que la unión del dedo de zinc es distinta de muchas otras proteínas de unión al ADN que se unen al ADN a través de la simetría doble de la doble hélice, en cambio los dedos de zinc están unidos linealmente en tándem para unirse a secuencias de ácidos nucleicos de longitudes variables. [5] Los dedos de zinc a menudo se unen a una secuencia de ADN conocida como caja GC . [11] La naturaleza modular del motivo del dedo de zinc permite unir una gran cantidad de combinaciones de secuencias de ADN y ARN con un alto grado de afinidad y especificidad, y por lo tanto es ideal para la ingeniería de proteínas que pueden dirigirse a secuencias de ADN específicas y unirse a ellas. En 1994, se demostró que una proteína de tres dedos construida artificialmente puede bloquear la expresión de un oncogén en una línea celular de ratón. Desde entonces se han construido dedos de zinc fusionados a varios otros dominios efectores, algunos de ellos con importancia terapéutica. [5]

Tal fue su importancia que "el motivo del dedo de zinc" fue citado en los antecedentes científicos del Premio Nobel de Química de 2024 (otorgado a David Baker , Demis Hassabis y John M. Jumper por el diseño computacional de proteínas y la predicción de la estructura de proteínas). [12]

Dominio

Los dominios de dedos de zinc (Znf) son motivos proteicos relativamente pequeños que contienen múltiples protuberancias similares a dedos que hacen contactos en tándem con su molécula objetivo. Algunos de estos dominios se unen al zinc, pero muchos no lo hacen, sino que se unen a otros metales como el hierro, o a ningún metal en absoluto. Por ejemplo, algunos miembros de la familia forman puentes salinos para estabilizar los pliegues similares a dedos . Primero se identificaron como un motivo de unión al ADN en el factor de transcripción TFIIIA de Xenopus laevis (rana africana con garras), sin embargo, ahora se reconoce que se unen a sustratos de ADN, ARN, proteínas y/o lípidos . [13] [14] [15] [16] [17] Sus propiedades de unión dependen de la secuencia de aminoácidos de los dominios de dedos y del enlazador entre dedos, así como de las estructuras de orden superior y el número de dedos. Los dominios Znf a menudo se encuentran en grupos, donde los dedos pueden tener diferentes especificidades de unión. Los motivos Znf se presentan en varias superfamilias de proteínas no relacionadas , y varían tanto en secuencia como en estructura. Muestran una versatilidad considerable en los modos de unión, incluso entre miembros de la misma clase (p. ej., algunos se unen al ADN, otros a las proteínas), lo que sugiere que los motivos Znf son andamios estables que han desarrollado funciones especializadas. Por ejemplo, las proteínas que contienen Znf funcionan en la transcripción génica , la traducción, el tráfico de ARNm, la organización del citoesqueleto , el desarrollo epitelial , la adhesión celular , el plegamiento de proteínas, la remodelación de la cromatina y la detección de zinc, por nombrar solo algunos. [18] Los motivos de unión al zinc son estructuras estables y rara vez experimentan cambios conformacionales al unirse a su objetivo.

Clases

Inicialmente, el término dedo de zinc se utilizó únicamente para describir el motivo de unión al ADN encontrado en Xenopus laevis ; sin embargo, ahora se utiliza para referirse a cualquier número de estructuras relacionadas por su coordinación de un ion de zinc. En general, los dedos de zinc coordinan iones de zinc con una combinación de residuos de cisteína e histidina . Originalmente, el número y el orden de estos residuos se utilizaban para clasificar diferentes tipos de dedos de zinc (por ejemplo, Cys 2 His 2 , Cys 4 y Cys 6 ). Más recientemente, se ha utilizado un método más sistemático para clasificar las proteínas de dedo de zinc. Este método clasifica las proteínas de dedo de zinc en "grupos de pliegues" según la forma general de la estructura de la proteína en el dominio plegado. Los "grupos de pliegues" más comunes de dedos de zinc son los similares a Cys 2 His 2 (el "dedo de zinc clásico"), la clave de sol y la cinta de zinc. [19]

La siguiente tabla [19] muestra las diferentes estructuras y sus características clave:

Cis2Su2

El grupo de pliegues similar a Cys 2 His 2 (C2H2) es, con diferencia, la clase de dedos de zinc mejor caracterizada y es común en los factores de transcripción de mamíferos. Dichos dominios adoptan un pliegue ββα simple y tienen el motivo de secuencia de aminoácidos : [20]

X 2 -Cys-X 2,4 -Cys-X 12 -His-X 3,4,5 -His

Esta clase de dedos de cinc puede tener diversas funciones, como la unión del ARN y la mediación de interacciones proteína-proteína, pero es más conocida por su papel en las proteínas de unión al ADN específicas de la secuencia, como Zif268 (Egr1). En dichas proteínas, los dominios de dedos de cinc individuales suelen aparecer como repeticiones en tándem con dos, tres o más dedos que comprenden el dominio de unión al ADN de la proteína. Estas formaciones en tándem pueden unirse en el surco mayor del ADN y suelen estar espaciadas a intervalos de 3 pb. La hélice α de cada dominio (a menudo denominada "hélice de reconocimiento") puede hacer contactos específicos de la secuencia con bases de ADN; los residuos de una sola hélice de reconocimiento pueden entrar en contacto con cuatro o más bases para producir un patrón superpuesto de contactos con dedos de cinc adyacentes.

Nudillo de mordaza

Este grupo de pliegues está definido por dos cadenas β cortas conectadas por un giro (nudillo de zinc) seguido de una hélice o bucle corto y se asemeja al motivo clásico Cys 2 His 2 con una gran porción de la hélice y la horquilla β truncada.

La proteína de la nucleocápside retroviral (NC) del VIH y otros retrovirus relacionados son ejemplos de proteínas que poseen estos motivos. El dedo de zinc en forma de "gag-knuckle" en la proteína NC del VIH es el objetivo de una clase de medicamentos conocidos como inhibidores del dedo de zinc .

Clave de sol

El motivo de clave de sol consiste en una horquilla β en el extremo N-terminal y una hélice α en el extremo C-terminal, cada una de las cuales aporta dos ligandos para la unión del cinc, aunque puede haber un bucle y una segunda horquilla β de longitud y conformación variables entre la horquilla β del extremo N-terminal y la hélice α del extremo C-terminal. Estos dedos están presentes en un grupo diverso de proteínas que con frecuencia no comparten secuencia o similitud funcional entre sí. Las proteínas mejor caracterizadas que contienen dedos de cinc en clave de sol son los receptores nucleares de hormonas .

Cinta de zinc

El pliegue de cinta de zinc se caracteriza por dos horquillas beta que forman dos subsitios de unión de zinc estructuralmente similares.

Zinc2/Cys6

Los miembros canónicos de esta clase contienen un grupo de cinc binuclear en el que dos iones de cinc están unidos por seis residuos de cisteína . Estos dedos de cinc se pueden encontrar en varios factores de transcripción, incluida la proteína Gal4 de levadura .

Misceláneas

La proteína antiviral de dedo de zinc (ZAP ) se une al sitio CpG. Se utiliza en mamíferos para la defensa antiviral. [21] [22]

Aplicaciones

Se pueden utilizar varias técnicas de ingeniería de proteínas para alterar la especificidad de unión al ADN de los dedos de zinc [20] y se pueden utilizar repeticiones en tándem de dichos dedos de zinc diseñados para dirigirse a secuencias de ADN genómico deseadas. [23] La fusión de un segundo dominio proteico, como un activador o represor transcripcional, a una matriz de dedos de zinc diseñados que se unen cerca del promotor de un gen determinado se puede utilizar para alterar la transcripción de ese gen. [23] Las fusiones entre matrices de dedos de zinc diseñados y dominios proteicos que escinden o modifican de otro modo el ADN también se pueden utilizar para dirigir esas actividades a loci genómicos deseados. [23] Las aplicaciones más comunes para matrices de dedos de zinc diseñados incluyen factores de transcripción de dedos de zinc y nucleasas de dedos de zinc , pero también se han descrito otras aplicaciones. Las matrices de dedos de zinc diseñadas típicas tienen entre 3 y 6 motivos de dedos de zinc individuales y se unen a sitios diana que van desde 9 pares de bases a 18 pares de bases de longitud. Las matrices con 6 motivos de dedos de zinc son particularmente atractivas porque se unen a un sitio objetivo que es lo suficientemente largo como para tener una buena probabilidad de ser único en un genoma de mamífero. [24]

Nucleasas de dedos de zinc

Las matrices de dedos de zinc diseñadas a menudo se fusionan a un dominio de escisión de ADN (generalmente el dominio de escisión de FokI ) para generar nucleasas de dedos de zinc . Estas fusiones de dedos de zinc-FokI se han convertido en reactivos útiles para manipular genomas de muchos organismos superiores, incluidos Drosophila melanogaster , Caenorhabditis elegans , tabaco , maíz , [25] pez cebra , [26] varios tipos de células de mamíferos, [27] y ratas . [28] La orientación de una rotura de doble cadena a un locus genómico deseado se puede utilizar para introducir mutaciones de cambio de marco en la secuencia codificante de un gen debido a la naturaleza propensa a errores de la vía de reparación del ADN no homóloga. Si también se utiliza una "secuencia donante" de ADN homóloga, entonces el locus genómico se puede convertir en una secuencia definida a través de la vía de reparación dirigida por homología. Un ensayo clínico en curso está evaluando las nucleasas de dedo de zinc que alteran el gen CCR5 en las células T humanas CD4 + como un posible tratamiento para el VIH/SIDA . [29]

Métodos de ingeniería de matrices de dedos de zinc

La mayoría de las matrices de dedos de zinc diseñadas se basan en el dominio de dedo de zinc del factor de transcripción murino Zif268, aunque algunos grupos han utilizado matrices de dedos de zinc basadas en el factor de transcripción humano SP1. Zif268 tiene tres motivos de dedos de zinc individuales que se unen colectivamente a una secuencia de 9 pb con alta afinidad. [30] La estructura de esta proteína unida al ADN se resolvió en 1991 [9] y estimuló una gran cantidad de investigación en matrices de dedos de zinc diseñadas. En 1994 y 1995, varios grupos utilizaron la visualización de fagos para alterar la especificidad de un solo dedo de zinc de Zif268. [31] [32] [33] [34] Actualmente se utilizan dos métodos principales para generar matrices de dedos de zinc diseñadas, el ensamblaje modular y un sistema de selección bacteriana, y existe cierto debate sobre qué método es el más adecuado para la mayoría de las aplicaciones. [35] [36]

El método más sencillo para generar nuevas matrices de dedos de cinc es combinar "módulos" de dedos de cinc más pequeños de especificidad conocida. La estructura de la proteína de dedos de cinc Zif268 unida al ADN descrita por Pavletich y Pabo en su publicación de 1991 ha sido clave para gran parte de este trabajo y describe el concepto de obtener dedos para cada uno de los 64 tripletes de pares de bases posibles y luego mezclar y combinar estos dedos para diseñar proteínas con cualquier especificidad de secuencia deseada. [9] El proceso de ensamblaje modular más común implica la combinación de dedos de cinc separados que pueden reconocer cada uno una secuencia de ADN de 3 pares de bases para generar matrices de 3, 4, 5 o 6 dedos que reconocen sitios objetivo que van desde 9 pares de bases a 18 pares de bases de longitud. Otro método utiliza módulos de 2 dedos para generar matrices de dedos de cinc con hasta seis dedos de cinc individuales. [25] El Laboratorio Barbas del Instituto de Investigación Scripps utilizó la visualización de fagos para desarrollar y caracterizar dominios de dedos de zinc que reconocen la mayoría de las secuencias de tripletes de ADN [37] [38] [39] mientras que otro grupo aisló y caracterizó dedos individuales del genoma humano. [40] Un posible inconveniente del ensamblaje modular en general es que las especificidades de los dedos de zinc individuales pueden superponerse y pueden depender del contexto de los dedos de zinc y el ADN circundantes. Un estudio reciente demostró que una alta proporción de matrices de dedos de zinc de 3 dedos generadas por ensamblaje modular no se unen a su objetivo previsto con suficiente afinidad en un ensayo bacteriano de dos híbridos y no funcionan como nucleasas de dedos de zinc , pero la tasa de éxito fue algo mayor cuando se apuntaron a sitios de la forma GNNGNNGNN. [41]

Un estudio posterior utilizó un ensamblaje modular para generar nucleasas de dedos de zinc con matrices de 3 y 4 dedos y observó una tasa de éxito mucho mayor con matrices de 4 dedos. [42] También se informó una variante del ensamblaje modular que tiene en cuenta el contexto de los dedos vecinos y este método tiende a producir proteínas con un rendimiento mejorado en relación con el ensamblaje modular estándar. [43]

Se han utilizado numerosos métodos de selección para generar matrices de dedos de zinc capaces de dirigirse a las secuencias deseadas. Los esfuerzos iniciales de selección utilizaron la visualización de fagos para seleccionar proteínas que se unieran a un objetivo de ADN determinado de un gran grupo de matrices de dedos de zinc parcialmente aleatorizadas. Esta técnica es difícil de utilizar en más de un dedo de zinc a la vez, por lo que se desarrolló un proceso de varios pasos que generó una matriz de 3 dedos completamente optimizada añadiendo y optimizando un solo dedo de zinc a la vez. [44] Los esfuerzos más recientes han utilizado sistemas de un híbrido de levadura, sistemas de un híbrido y dos híbridos bacterianos y células de mamíferos. Un nuevo método prometedor para seleccionar nuevas matrices de dedos de zinc de 3 dedos utiliza un sistema de dos híbridos bacterianos y ha sido denominado "OPEN" por sus creadores. [45] Este sistema combina grupos preseleccionados de dedos de zinc individuales que fueron seleccionados para unirse a un triplete dado y luego utiliza una segunda ronda de selección para obtener matrices de 3 dedos capaces de unirse a una secuencia deseada de 9 pb. Este sistema fue desarrollado por el Consorcio Zinc Finger como una alternativa a las fuentes comerciales de matrices de dedos de zinc diseñadas. Es algo difícil comparar directamente las propiedades de unión de las proteínas generadas con este método con las proteínas generadas por ensamblaje modular, ya que nunca se han informado los perfiles de especificidad de las proteínas generadas por el método OPEN.

Ejemplos

Esta entrada representa el dominio de dedo de zinc de tipo CysCysHisCys (C2HC) que se encuentra en eucariotas . Las proteínas que contienen estos dominios incluyen:

Véase también

Referencias

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