El azul alcián ( / ˈ æ l ʃ ə n / ) es cualquier miembro de una familia de colorantes básicos polivalentes, de los cuales el azul alcián 8G (también llamado azul Ingrain 1 , y el CI 74240 , anteriormente llamado azul alcián 8GX por el nombre de un lote de un producto ICI ) ha sido históricamente el miembro más común y confiable. [1] Se utiliza para teñir polisacáridos ácidos como glicosaminoglicanos en cartílagos y otras estructuras corporales, algunos tipos de mucopolisacáridos , glicocálix sialilado de células, etc. Para muchos de estos objetivos es uno de los tintes catiónicos más utilizados tanto para luz como para luz. microscopio de electrones . El uso de azul alcián ha sido históricamente un método de tinción popular en histología, especialmente para microscopía óptica en secciones incluidas en parafina y en secciones semifinas de resina. Las partes del tejido que se tiñen específicamente con este tinte se vuelven de color azul a verde azulado después de la tinción y se denominan "alcianofílicas" (comparables a " eosinófilas " o " sudanófilas "). La tinción con azul alcián se puede combinar con los métodos de tinción H&E , tinción PAS y tinción de Van Gieson . El azul alcián se puede utilizar para cuantificar glicanos ácidos tanto en cuantificación microespectrofotométrica en solución como para teñir glicoproteínas en geles de poliacrilamida o en transferencias Western . Los bioquímicos lo habían utilizado para analizar los polisacáridos ácidos en la orina desde los años 1960 para el diagnóstico de enfermedades como la mucopolisacaridosis , pero a partir de los años 1970, en parte debido a la falta de disponibilidad de Alcian y en parte debido a la duración y tedio del procedimiento, se tuvieron que desarrollar métodos alternativos, por ejemplo, dimetilo. Método del azul de metileno (DMB o DMMB). [2]
John E. Scott, la primera persona ajena a la industria de los tintes que descifró el secreto químico de este tinte, comenta:
Además de su amplio uso como tinte, el azul alcián también se ha utilizado en otras aplicaciones diversas, por ejemplo, agente gelificante para fluidos lubricantes, modificadores de electrodos, agentes de recubrimiento cargados, etc.
El azul Monstral que recubre el interior de los recipientes de cobre utilizados para procesar los derivados del ácido ftálico condujo al descubrimiento de la ftalocianina en 1907. Atraídos por el brillo, la estabilidad y la insolubilidad de este cromóforo , se intentó modificarlo de forma reversible para que ser transportado a la tela en una solución y luego precipitado fácilmente (integrado) en un depósito no lixiviable pero finamente bien disperso (de ahí el nombre " teñido incrustado "). A partir de este intento, el azul alcián (azul Ingrain 1) fue sintetizado por primera vez por el departamento de colorantes de ICI bajo la dirección de NH Haddock y C. Wood [4] a principios de la década de 1940 y patentado en 1947, originalmente como tinte textil. [5] [6] En 1950, Steedman lo utilizó como colorante selectivo para mucinas. [7] Si bien la popularidad del azul alcián se expandió exponencialmente, la dificultad involucrada en su producción debido a pasos intermedios ambientalmente peligrosos hizo que su disponibilidad fuera difícil e ICI dejó de producirlo en 1973. Muchas de las fuentes alternativas vendían productos de colores de apariencia similar con tinciones poco confiables.
El profesor JE Scott trabajó para descifrar la química del azul alcián, que sólo era conocida por la industria pero que se mantenía como un secreto comercial estricto. Después de dedicar 3 años-hombre de esfuerzo en 1972, publicó la estructura del azul alcián y logró que ICI la confirmara en 1973, por cierto, al mismo tiempo que ICI también acababa de dejar de producirlo. [8]
Después de la crisis interina desde la década de 1970, cuando ICI tuvo que parar, ahora ha habido una fabricación industrial alternativa ambientalmente segura de este tinte que se supone que funciona tan bien como 8GX pero se llama 8G porque está hecho de manera diferente. [9] En un intento de responder cuál era la importancia de descubrir un método alternativo de fabricar este compuesto, una empresa (Anatech Ltd, EE. UU.) que remanufacturó el azul alcián dice:
La etimología del nombre no es segura y si se escribe con mayúscula es una elección de estilo editorial. Dos importantes diccionarios científicos y médicos utilizan el estilo en minúsculas, [10] [11] pero también existe un apoyo digno para el estilo en mayúsculas (que se analiza a continuación). Según el diccionario de quimioetimología de Elsevier, el alcián en azul alcián podría haber sido acuñado por contracción (y ligera alteración) de ftalocianina .". [12] El diccionario en línea de Oxford menciona que era una marca registrada y también especifica [13]
Esta hipótesis concuerda con el nombre de verde alcián, que es una tetrafenilftalocianina con cobre. [14]
Sin embargo, el profesor JE Scott, que había descifrado él mismo la química del azul Alcian y luego recibió la confirmación del fabricante (ICI), escribió que Alcian era una marca registrada que ICI prefería escribir comenzando con "A" mayúscula, y supone que proviene de la antigua palabra inglesa " halcyon ", que tiene "asociaciones románticas y poéticas con el martín pescador y los mares en calma". [3] El Prof. Scott también afirma que el verde Alcian era simplemente una mezcla de azul Alcian y amarillo Alcian y no un solo compuesto, lo que también está respaldado por datos de cromatografía de capa fina de varias fuentes, por ejemplo, trabajos de otro experto en tintes, el Prof. RW Horobin. uno de los dos editores en jefe de la décima edición del Manual de tinciones biológicas de Conn, de 75 años, publicado en nombre de la Comisión de tinciones biológicas . [15]
El amarillo alcián es un tinte azoico que no tiene anillo de ftalocianina ni ninguno de los colores del martín pescador, pero, al igual que el azul alcián, tiene cadenas laterales de tiouronio cargadas hidrolizables y una estabilidad similar del producto teñido final. Por otro lado, existen otros colorantes de ftalocianina como el azul rápido Luxol y el azul Durazol, que no han adquirido "Alcian" como parte de sus nombres. [dieciséis]
El azul alcián sólido se obtiene en forma de cristales de color negro verdoso (o, a veces, violeta azulado oscuro [17] ) con brillo metálico. La solución acuosa es de color azul verdoso brillante. Aunque el compuesto azul alcián en sí es inestable (consulte la estabilidad a continuación), la tinción que produce es estable y resistente a la luz.
A diferencia de las tiazinas tricíclicas (por ejemplo, azul de toluidina , azul de metileno y azul A , etc.), que son metacromáticas debido al cambio de agregados monoméricos a agregados apilados , el azul alcián es aparentemente ortocromático . Al igual que el azul Astra y otros tintes similares, esta propiedad de que no cambia de color ni por cambio de concentración ni por combinación con sustratos lo hace muy adecuado para microespectrofotometría. La aparente falta de metacromasia no se debe a que sea verdaderamente ortocromática sino a que "ya es completamente metacromática" en solución acuosa. [3]
En solución acuosa, un gran número de moléculas de azul alcián se apilan formando micelas de tamaño muy grande, demasiado grandes para siquiera ser dializadas. Por lo tanto, incluso a una dilución bastante alta, tiene un máximo de absorción entre ~600 y 615 nm, que en realidad no es el máximo de absorción de un monómero colorante sino el del multímero. Dado que la luz absorbida es de espectro amarillo anaranjado, nuestro ojo percibe la luz transmitida/reflejada como el color complementario de un azul ligeramente verdoso o cian . En solución acuosa, el azul alcián sigue siendo metacromático en concentraciones molares centésimas de aquellas en las que el azul de toluidina es principalmente ortocromático. Sólo un hombro muy pequeño de la curva de absorción a 670-680 nm representa el colorante monomérico, que suele ser minoritario y se vuelve aún menos minoritario (<108 M ) en presencia de sales. Sin embargo, cuando el disolvente es DMSO , un disolvente aprótico de constante dieléctrica moderadamente alta, el azul alcián no se agrega y se puede visualizar bien un gran pico de absorción monomérica. También se observa un cambio espectral similar al pico monomérico más largo cuando se usan disolventes como el etanol (o una mezcla de etanol y agua) como vehículo o cuando se usan detergentes no iónicos como Triton X-100 , que producen micelas exógenas.
El azul de Alcian lleva ftalocianina, uno de los cromóforos más coloreados conocidos hasta el momento, con una extinción molar de 120.000, es decir, el azul de Alcian es detectable a la mitad de la concentración molar de tintes populares como el azul de toluidina , los triarilmetanos (por ejemplo, pararosanilina y las bases de Schiff análogas utilizadas en la tinción PAS) . Violeta cristal en tinción de Gram ), etc.
Es soluble en agua. Cuando cada uno de los pares de sustituyentes de los nitrógenos del grupo colgante es toluilo, la solubilidad en agua a 20 °C es aproximadamente 9,5 % p/p; y algunas otras solubilidades son: 6,0% en etanol absoluto , 6,0% en Cellosolve y 3,25% de etilenglicol, mientras que es prácticamente insoluble en xileno. En términos relativos/de partición, el azul alcián 8G tiene un coeficiente de partición log octanol-agua (Log P) de −9,7, lo que sugiere que es bastante soluble en agua (soluble en lípidos si Log P > 0, y las buenas tinciones de lípidos generalmente tienen un Log P > 7). [18] El metanol es un sustituto aceptable del etanol como vehículo potencial para el azul alcián, pero el isopropanol no lo es, porque, en unas pocas horas, todo el azul alcián suspendido precipita si se prueba el isopropanol como vehículo. [19]
El compuesto de muestra con número de índice Merck 218 tiene un punto de fusión de 148 °C.
Es un colorante básico tetravalente (catiónico) con un núcleo de ftalocianina ( CuPc ) de cobre (Cu 2+ , coordinación 4 de 6, configuración orbital d 9 con distorsión de Jahn-Teller ) con tres o cuatro cadenas laterales de isotiouronio colgantes que le confieren volumen y positividad. cargos. Para calificar como miembro de la familia del azul alcian, tiene que haber al menos 2 cadenas laterales y las mezclas suelen tener 3 cadenas en promedio para calificar como 8G. En la imagen se muestran cuatro grupos de tetrametilisotiouronio por molécula. ICI había afirmado un promedio de aproximadamente tres cadenas laterales por molécula, pero los análisis realizados por el laboratorio del profesor Scott sugirieron entre tres y cuatro. La mayoría de ellos están en las posiciones 2 (3), como en la fórmula y, a veces, una representación de dibujos animados utiliza el puente de metileno que cruza el enlace entre estas dos posiciones para indicar que podría unir cualquiera de estas dos posiciones. Son posibles una gran cantidad de isómeros que difieren en las posiciones de los grupos catiónicos. El azul alcián 7GX lleva menos grupos de isotiouronio que el 8GX. De manera similar, 5GX y 2GX pueden tener incluso menos grupos laterales, pero no se demostró rigurosamente.
El núcleo aromático de ftalocianina tiene un gran sistema conjugado con un CBN (número de enlace conjugado) de 48. [18] Sin embargo, son las cargas en los grupos laterales de isotiouronio las que aún lo mantienen soluble en agua. Estos grupos laterales pueden llevar sustituyentes alquilo o arilo más voluminosos en lugar de los grupos metilo 8x2 como en la imagen proporcionada. Estos grupos se separaron del anillo macrocíclico durante el lavado al final de la tinción o en condiciones bastante suaves (por ejemplo, pH superior a 5,6) o durante la degradación espontánea.
Los metales en el núcleo de ftalocianina y los grupos sustituidos directamente unidos al núcleo aromático determinan los colores de los miembros de la familia de las ftalocianinas metálicas, por ejemplo, el azul alcián y la ftalocianina de cobre en sí son azules, pero la ftalocianina de cobre bromada o clorada y la ftalocianina de cobre sulfonada son verdes.
El azul alcián tiene una solubilidad relativamente alta en soluciones salinas y se tiñe más lentamente que otros tintes. Cambiando el pH o las concentraciones de sal ambiental se pueden obtener patrones de tinción característicos.
A pH 1,0 tiñe sólo polisacáridos sulfatados y a pH 2,5 también tiñe grupos carboxilo que contienen azúcares como los ácidos siálicos y los ácidos urónicos intensifican la tinción de los ácidos hialurónicos , que también teñirían, aunque relativamente débilmente, por sus ésteres de semisulfato a pH 1,0. [20]
Un método de tinción en el que, a un pH fijo de aproximadamente 5,5, se puede utilizar una concentración de sal crítica diferente (clásicamente MgCl 2 , pero NaCl, KCl y LiBr son alternativas potenciales) donde el catión de sal más pequeño (de difusión más rápida) compite con el azul alcián para unirse a los sitios aniónicos. Se supone que la concentración crítica de electrolitos (CEC) específica del material objetivo identifica selectivamente estructuras sulfatadas, carboxiladas y fosfatadas, por ejemplo, como objetivos.
Según John A. Kiernan, uno de los editores de la décima edición de Conn's Biological Stains, décima edición de 2002, publicada en nombre de la Biological Stain Commission : [21] El azul alcián 8G se diferencia de la mayoría de los otros tintes en que puede deteriorarse incluso en El estado sólido, cambiando a un pigmento insoluble, las soluciones ácidas de azul alcián 8G suelen ser estables durante algunos años. El manual de laboratorio de Churukian [1] recomienda una vida útil de 6 meses. Una solución de azul alcián con un precipitado debe desecharse y reemplazarse. , no filtrado y utilizado. Algunos tintes vendidos como azul alcián 8G son inestables en soluciones a pH 5,6 y superiores; precipitan en menos de 24 horas. Los lotes de azul alcián que no forman soluciones estables no se pueden utilizar en la "concentración crítica de electrolitos" de Scott. "métodos para la caracterización histoquímica de diferentes glicosaminoglicanos, que requieren soluciones a pH 5,7-5,8 con concentraciones variables de MgCl 2 .
La variante de piridina del azul alcián (cloruro de azul alcián-tetrakis (metilpiridinio), CAS , CB6503730, PubChem 24860335) es más estable que los tintes azules alcián originales y puede ser tan bueno como un tinte. [22]
Los ácidos nucleicos son generalmente basófilos porque tienen una densidad muy alta de carga negativa debido a la estructura principal de fosfato de azúcar. Sin embargo, a diferencia de otros tintes básicos, es decir, catiónicos, el azul alcián normalmente (si se tienen el pH y las concentraciones de sal correctos, y la temperatura normal y la duración en minutos, no en horas) tiñe preferentemente los glicosaminoglicanos ácidos , pero no la cromatina ni la sustancia nissel, cuyo mecanismo Había sido un misterio durante mucho tiempo y se propusieron varias teorías. Aunque la presunta base de la tinción es su carga positiva atraída por estructuras negativas (por ejemplo, azúcares ácidos), el volumen (ancho 2,5–3 nm, en comparación con el azul de toluidina ~0,7 x 1,1 nm [23] ) hace que su difusión sea muy lenta en menos partes permeables del tejido y así evitar que manche estructuras altamente negativas pero compactas como la cromatina y la sustancia de Nissl. [24] Sin embargo, la tinción prolongada (unos días a 25 °C) o las condiciones desnaturalizantes del ADN pueden permitir que el azul alcián también tiña el núcleo. El aislamiento de la carga positiva de la nube de electrones aromáticos mediante los puentes de metileno intermedios hace que las regiones localizadas con carga positiva sean iones "duros" en contraste con los iones blandos donde la carga está deslocalizada sobre toda la nube aromática pi. [9] Cuando estos cationes duros se encuentran con los aniones duros, por ejemplo en forma de sulfato, forman sales sin tener en cuenta la naturaleza química precisa del anión. Las sales resultantes son muy estables pero pueden intercambiarse lentamente con una alta concentración de sales. El lavado con agua o tratamiento alcalino después de la tinción provoca una hidrólisis catalizada por una base y la eliminación de las cadenas laterales colgantes con carga positiva y el compuesto resultante es azul de ftalocianina , que forma un precipitado de tinte azul insoluble en agua. [25] Los precipitados son tan robustos que soportan condiciones duras como PAS u otras tinciones de contraste y también tratamientos de deshidratación e inclusión (en contraste, el azul de toluidina se extrae parcialmente durante la deshidratación). Esta lixiviabilidad es la base química del teñido ingrain para el cual la industria de tintes diseñó originalmente AB (Ingrain blue 1).
El histórico Alcian Blue varió tanto de un lote a otro que más tarde se decidió que sólo el lote 8GX (por ejemplo, ni siquiera el 8GS) producido por ICI era el biológicamente útil. Los lotes disponibles comercialmente generalmente contenían alrededor del 49% del tinte real y el resto solía ser sulfato, ácido bórico, dextrina y otras impurezas y mediante varios métodos de extracción se pueden obtener extractos puros de hasta el 80%. En realidad, el tinte no contiene necesariamente los 4 sustituyentes, pero puede contener 2 o 3 de ellos y tener varios isómeros geométricos. Pero de todos modos, la fabricación de 8GX por parte de ICI se detuvo a mediados de la década de 1970 debido a peligros ambientales y había lotes muy pequeños disponibles que se recibieron de fuentes alternativas. Recientemente, Alcian Blue se ha vuelto a fabricar a granel utilizando procedimientos más seguros, pero el producto más nuevo no tiene el sufijo X (o S) ya que el proceso de fabricación (y la composición exacta del producto) es algo diferente. [9]
El azul alcián irrita los ojos y las vías respiratorias. El azul alcián sólido es un polvo combustible y nunca debe manipularse cerca del calor o de una llama desnuda. Calentar el azul alcián produce vapores tóxicos de compuestos nitrogenados. Puede reaccionar violentamente si se mezcla con materiales oxidantes. La solución de azul alcián es sensibilizante cutáneo y corrosivo (en parte debido al pH ácido necesario para mantenerlo sin hidrolizar en solución) y nocivo por absorción cutánea. La mayoría de los proveedores MSDS (hojas de datos de seguridad de materiales) mencionan que se desconoce el efecto de la ingestión o se desconoce el órgano objetivo. Sin embargo, algunos mencionan que los órganos diana potenciales son los dientes y los riñones. [26]
Este tinte fue descubierto originalmente por ICI en la década de 1940 como miembro de la competitiva industria de tintes con el fin de realizar teñidos industriales. Se utilizó durante algún tiempo para teñir textiles, productos de cuero y tintas. ICI vendió miles de toneladas de azul alcián y presentó múltiples patentes sobre su proceso de fabricación para mantener su química en secreto. Sin embargo, ICI había tenido problemas con la solubilidad del tinte en condiciones de teñido de textiles, y durante las décadas de 1950 y 1960 se realizaron varios cambios en el proceso de fabricación.
Además de su uso como tinte o tinte, el azul alcián también encuentra otros usos en la ciencia de los materiales.
El azul alcián se ha utilizado como adhesivo para ayudar a pegar secciones de metacrilato de glicol a portaobjetos de vidrio (que tienen grupos de silicato cargados negativamente). [27]
El azul alcián tiene una gran superficie aromática que puede participar en la interacción de Van der Waal, así como en múltiples cargas localizadas. Por lo tanto, se puede recubrir superficies y modificar significativamente las propiedades y la carga de la superficie. Algunas células en cultivo crecen mejor en superficies recubiertas con carga positiva como poli-L-lisina o poliornitina o azul alcián. Las superficies recubiertas de azul alcián sujetan el glicocálix con carga negativa con tanta fuerza que incluso se puede utilizar para cubrir una capa de células y luego hacerlas flotar para despegar el techo ("destechar") para estudiar el lado citoplasmático de la membrana plasmática. [28]
El azul alcián se ha utilizado como agente gelificante para fluidos lubricantes, probablemente debido a las propiedades de apilamiento de este compuesto aromático macrocíclico .
Otra aplicación es el "Electrodo de pasta de carbón modificado con azul alcián" (ABMCPE), que actúa como un sensor redox altamente sensible en comparación con el electrodo de pasta de carbón desnudo (BCPE) y exhibe un fuerte efecto "promotor" y estabilidad. [ cita necesaria ]
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