CLOCK (de ciclos circadianos de producción locomotora kaput ) es un gen que codifica un factor de transcripción PAS básico de hélice-bucle - hélice que se sabe que afecta tanto la persistencia como el período de los ritmos circadianos .
Las investigaciones muestran que el gen CLOCK desempeña un papel importante como activador de elementos posteriores en la vía crítica para la generación de ritmos circadianos . [5] [6]
El gen CLOCK fue identificado por primera vez en 1997 por Joseph Takahashi y sus colegas. Takahashi utilizó la detección de mutagénesis directa en ratones tratados con N-etil-N-nitrosourea para crear e identificar mutaciones en genes clave que afectan ampliamente la actividad circadiana. [7] Los mutantes CLOCK descubiertos a través de la pantalla mostraron un período anormalmente largo de actividad diaria. Este rasgo resultó ser hereditario . Los ratones criados para ser heterocigotos mostraron períodos más largos de 24,4 horas en comparación con el período de control de 23,3 horas. Los ratones homocigotos para la mutación mostraron períodos de 27,3 horas, pero finalmente perdieron todo el ritmo circadiano después de varios días en constante oscuridad. [8] Eso demostró que los " genes CLOCK intactos " son necesarios para la función circadiana normal de los mamíferos [ ¿cómo? ] .
Se ha descubierto que la proteína CLOCK desempeña un papel central como factor de transcripción en el marcapasos circadiano. [9] En Drosophila , el CLOCK (CLK) recién sintetizado se hipofosforila en el citoplasma antes de ingresar al núcleo. Una vez en los núcleos, CLK se localiza en focos nucleares y luego se redistribuye de manera homogénea. CYCLE (CYC) (también conocido como dBMAL por el ortólogo BMAL1 en mamíferos) se dimeriza con CLK a través de sus respectivos dominios PAS . Este dímero luego recluta la proteína de unión a CREB (CBP) coactivadora y se fosforila aún más. [10] Una vez fosforilado, este complejo CLK-CYC se une a los elementos de la caja E de los promotores de period (per) y timeless (tim) a través de su dominio bHLH, provocando la estimulación de la expresión génica de per y tim . Un gran exceso molar de proteínas period (PER) y timeless (TIM) provoca la formación del heterodímero PER-TIM que evita que el heterodímero CLK-CYC se una a las cajas E de per y tim , esencialmente bloqueando la transcripción de per y tim . [6] [11] CLK se hiperfosforila cuando la quinasa de doble tiempo (DBT) interactúa con el complejo CLK-CYC de manera dependiente de PER, desestabilizando tanto CLK como PER, lo que lleva a la degradación de ambas proteínas. [11] La CLK hipofosforilada luego se acumula, se une a las cajas E de per y tim y activa su transcripción una vez más. [11] Este ciclo de fosforilación postraduccional sugiere que la fosforilación temporal de CLK ayuda en el mecanismo de sincronización del reloj circadiano. [10]
Se encuentra un modelo similar en ratones, en los que BMAL1 se dimeriza con CLOCK para activar la transcripción per y criptocromo ( cry ). Las proteínas PER y CRY forman un heterodímero que actúa sobre el heterodímero CLOCK-BMAL para reprimir la transcripción de per y cry . [12] El heterodímero CLOCK:BMAL1 funciona de manera similar a otros complejos activadores transcripcionales; RELOJ:BMAL1 interactúa con los elementos reguladores de la E-box. Las proteínas PER y CRY se acumulan y dimerizan durante la noche subjetiva y se trasladan al núcleo para interactuar con el complejo CLOCK:BMAL1, inhibiendo directamente su propia expresión. Esta investigación ha sido realizada y validada mediante análisis cristalográfico. [13]
CLOCK exhibe actividad histona acetil transferasa (HAT), que se ve reforzada por la dimerización con BMAL1. [14] El Dr. Paolo Sassone-Corsi y sus colegas demostraron in vitro que la actividad HAT mediada por CLOCK es necesaria para rescatar los ritmos circadianos en mutantes Clock. [14]
El dímero CLOCK-BMAL participa en la regulación de otros genes y circuitos de retroalimentación. Una enzima SIRT1 también se une al complejo CLOCK-BMAL y actúa para suprimir su actividad, tal vez mediante la desacetilación de Bmal1 y las histonas circundantes . [15] Sin embargo, el papel de SIRT1 sigue siendo controvertido y también puede tener un papel en la desacetilación de la proteína PER, dirigiéndose a su degradación. [dieciséis]
El dímero CLOCK-BMAL actúa como un miembro positivo de un circuito de retroalimentación. La unión de CLOCK-BMAL a un elemento promotor de E-box activa la transcripción de genes de reloj como per 1, 2 y 3 y tim en ratones. Se ha demostrado en ratones que CLOCK-BMAL también activa el gen de la nicotinamida fosforribosiltransferasa (también llamado Nampt ), que forma parte de un circuito de retroalimentación independiente. Este circuito de retroalimentación crea un oscilador metabólico. El dímero CLOCK-BMAL activa la transcripción del gen Nampt , que codifica la proteína NAMPT. NAMPT es parte de una serie de reacciones enzimáticas que convierten la niacina (también llamada nicotinamida ) en NAD . SIRT1, que requiere NAD para su actividad enzimática, luego utiliza niveles elevados de NAD para suprimir BMAL1 mediante desacetilación. Esta supresión da como resultado una menor transcripción de NAMPT, menos proteína NAMPT, menos producción de NAD y, por lo tanto, menos SIRT1 y menos supresión del dímero CLOCK-BMAL. Este dímero puede volver a activar positivamente la transcripción del gen Nampt y el ciclo continúa, creando otro bucle oscilatorio que involucra a CLOCK-BMAL como elementos positivos. El papel clave que desempeña Clock en los ciclos metabólicos y circadianos resalta la estrecha relación entre el metabolismo y los relojes circadianos. [17]
Los primeros ritmos circadianos probablemente se generaron mediante ciclos de división celular impulsados por la luz en especies procarióticas ancestrales. [18] Este protorritmo evolucionó más tarde hasta convertirse en un reloj autosostenible mediante la duplicación de genes y la divergencia funcional de los genes del reloj. Los grupos de genes kaiA / B / C siguen siendo los genes reloj más antiguos, ya que están presentes en las cianobacterias , siendo el kai C el ancestro más probable del kai A y el kaiB. [18] La función de estos genes de reloj ancestrales probablemente estaba relacionada con la función cromosómica antes de desarrollar un mecanismo de sincronización. [18] Los genes kai A y kai B surgieron después de que las cianobacterias se separaron de otros procariotas. [19] Las duras condiciones climáticas en la historia temprana de la formación de la Tierra, como la irradiación ultravioleta, pueden haber llevado a la diversificación de los genes del reloj en los procariotas en respuesta a cambios drásticos en el clima. [19]
Los criptocromos , proteínas sensibles a la luz reguladas por genes Cry , son probablemente descendientes de kaiC resultantes de una duplicación del genoma anterior a la explosión del Cámbrico y son responsables de la regulación negativa de los relojes circadianos. Otros linajes distintos de genes de reloj surgieron temprano en la evolución de los vertebrados, con el gen BMAL1 parálogo de CLOCK. Sin embargo, su ancestro común probablemente fue anterior a la división insecto-vertebrado hace aproximadamente 500 millones de años. [18] WC1, un análogo de CLOCK/BMAL1 que se encuentra en genomas de hongos, es un ancestro común candidato propuesto anterior a la división hongos-animales . [18] Una búsqueda BLAST realizada en una revisión de 2004 sobre la evolución del gen del reloj sugirió que el gen del reloj puede haber surgido de una duplicación en el gen BMAL1, aunque esta hipótesis sigue siendo especulativa. [18] Otra teoría propone alternativamente el gen NPAS2 como el parálogo de CLOCK que desempeña un papel similar en la vía del ritmo circadiano pero en tejidos diferentes. [20]
Se supone que las variaciones alélicas dentro del gen Clock1a en particular tienen efectos en el calendario estacional, según un estudio de 2014 realizado en una población de peces ciprínidos. [21] Los polimorfismos en el gen afectan principalmente la longitud de la región del dominio PolyQ, lo que proporciona un ejemplo de evolución divergente donde las especies que comparten un nicho ecológico dividirán los recursos en ambientes variables estacionalmente. [21] La longitud del dominio PolyQ está asociada con cambios en el nivel de transcripción de CLOCK. En promedio, las longitudes de alelos más largas se correlacionaron con especies derivadas recientemente y con especies de desove más temprano, probablemente debido a cambios estacionales en la temperatura del agua. [21] Los investigadores plantean la hipótesis de que la longitud del dominio puede servir para compensar los cambios de temperatura alterando la tasa de transcripción del RELOJ. Todos los demás aminoácidos permanecieron idénticos en las especies nativas, lo que indica que la restricción funcional puede ser otro factor que influye en la evolución del gen CLOCK además de la duplicación y diversificación de genes . [20] [21]
Un estudio de 2017 que investigó el papel de la expresión de CLOCK en las neuronas determinó su función en la regulación de redes transcripcionales que podrían proporcionar información sobre la evolución del cerebro humano. [22] Los investigadores sintetizaron neuronas humanas diferenciadas in vitro y luego realizaron una eliminación genética para probar el efecto de CLOCK en la señalización de las células neuronales. Cuando se interrumpió la actividad de CLOCK, se observó una mayor migración neuronal del tejido en la neocorteza , lo que sugiere un mecanismo molecular para la expansión cortical exclusivo del desarrollo del cerebro humano. [22] Sin embargo, el papel preciso de CLOCK en la regulación metabólica de las neuronas corticales aún está por determinar. Otro estudio que analizó la relación entre los polimorfismos CLOCK en la región flanqueante 3' y la preferencia matutina/vespertina en adultos encontró una correlación entre los sujetos con el alelo 3111C y la preferencia por las horas nocturnas según las respuestas proporcionadas en un cuestionario puntuado. [23] Esta región está bien conservada entre ratones y humanos y se ha demostrado que los polimorfismos afectan la estabilidad del ARNm, lo que indica que las variantes alélicas podrían alterar los patrones circadianos normales en los mamíferos y provocar afecciones como el insomnio u otros trastornos del sueño. [23]
Los organismos mutantes del reloj pueden poseer una mutación nula o un alelo antimórfico en el locus del reloj que codifica un antagonista de la proteína de tipo salvaje. La presencia de una proteína antimórfica regula negativamente los productos transcripcionales normalmente regulados positivamente por Clock . [24]
En Drosophila , Allada, Hall y Rosbash identificaron una forma mutante de Clock ( Jrk ) en 1998. El equipo utilizó genética directa para identificar ritmos no circadianos en moscas mutantes. Jrk resulta de un codón de parada prematuro que elimina el dominio de activación de la proteína CLOCK. Esta mutación provoca efectos dominantes: la mitad de las moscas heterocigotas con este gen mutante tienen un período prolongado de 24,8 horas, mientras que la otra mitad se vuelve arrítmica. Las moscas homocigotas pierden su ritmo circadiano. Además, los mismos investigadores demostraron que estas moscas mutantes expresan niveles bajos de proteínas PER y TIM, lo que indica que Clock funciona como un elemento positivo en el ciclo circadiano. Si bien la mutación afecta el reloj circadiano de la mosca, no causa ningún defecto fisiológico o de comportamiento. [25] La secuencia similar entre Jrk y su homólogo de ratón sugiere que componentes comunes del ritmo circadiano estaban presentes tanto en los ancestros de Drosophila como en los ratones. Un alelo recesivo de Clock conduce a una arritmicidad conductual mientras mantiene oscilaciones moleculares y transcripcionales detectables. Esto sugiere que Clk contribuye a la amplitud de los ritmos circadianos. [26]
El homólogo de ratón del mutante Jrk es el mutante ClockΔ19 que posee una deleción en el exón 19 del gen Clock . Esta mutación dominante negativa da como resultado un dímero CLOCK-BMAL defectuoso, lo que hace que los ratones tengan una menor capacidad de activación por transcripción. En constante oscuridad, los ratones ClockΔ19 heterocigotos para el alelo mutante Clock exhiben períodos circadianos alargados, mientras que los ratones ClockΔ19/Δ19 homocigotos para el alelo se vuelven arrítmicos. [8] Tanto en heterocigotos como en homocigotos, esta mutación también produce períodos prolongados y arritmicidad a nivel unicelular. [27]
Los ratones mutantes Clock -/- null, en los que Clock ha sido desactivado, muestran ritmos circadianos completamente normales. El descubrimiento de un mutante nulo de Clock con un fenotipo de tipo salvaje desafió directamente la premisa ampliamente aceptada de que Clock es necesario para la función circadiana normal. Además, sugirió que no es necesario que exista el dímero CLOCK-BMAL1 para modular otros elementos de la vía circadiana. [28] El dominio PAS neuronal que contiene la proteína 2 ( NPAS2 , un parálogo de CLOCK [29] ) puede sustituir a CLOCK en estos ratones sin reloj . Los ratones con un alelo NPAS2 mostraron períodos más cortos al principio, pero eventualmente un comportamiento arrítmico. [30]
En humanos, un polimorfismo en Clock , rs6832769, puede estar relacionado con el rasgo de personalidad amabilidad . [31] Otro polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) en Clock , 3111C, asociado con la preferencia diurna , [23] también se asocia con aumento del insomnio , [32] dificultad para perder peso, [33] y recurrencia de episodios depresivos mayores en pacientes con trastorno bipolar. desorden . [34]
En ratones, Clock ha sido implicado en trastornos del sueño , metabolismo , embarazo y trastornos del estado de ánimo . Los ratones mutantes del reloj duermen menos que los ratones normales cada día. [35] Los ratones también muestran niveles alterados de glucosa plasmática y ritmos en la ingesta de alimentos. [36] Estos mutantes desarrollan síntomas de síndrome metabólico con el tiempo. [37] Además, los mutantes Clock demuestran ciclos estrales interrumpidos y mayores tasas de fracaso del embarazo a término. [38] Mutant Clock también se ha relacionado con síntomas similares al trastorno bipolar en ratones, incluida la manía y la euforia . [39] Los ratones con mutación del reloj también exhiben una mayor excitabilidad de las neuronas de dopamina en los centros de recompensa del cerebro. [40] Estos resultados han llevado a Colleen McClung a proponer el uso de ratones mutantes Clock como modelo para los trastornos del comportamiento y el estado de ánimo humanos.
También se ha demostrado que el dímero CLOCK-BMAL activa el receptor alfa erb inverso ( Rev-ErbA alfa ) y el receptor alfa huérfano del ácido retinoico ( ROR-alfa ). REV-ERBα y RORα regulan Bmal uniéndose a elementos de respuesta del receptor huérfano relacionados con el ácido retinoico (RORES) en su promotor. [41] [42]
Las variaciones en la epigenética del gen Clock pueden conducir a un mayor riesgo de cáncer de mama . [43] Se descubrió que en mujeres con cáncer de mama, había significativamente menos metilación de la región promotora del Reloj . También se observó que este efecto era mayor en mujeres con tumores con receptores de estrógeno y progesterona negativos. [44]
El gen CLOCK también puede ser un objetivo para mutaciones somáticas en cánceres colorrectales inestables de microsatélites . En un estudio, el 53% de los casos de cáncer colorrectal con inestabilidad de microsatélites contenían mutaciones somáticas de CLOCK. [45] La investigación incipiente sobre la expresión de genes circadianos en el tejido adiposo sugiere que la supresión del gen CLOCK puede correlacionarse causalmente no solo con la obesidad, sino también con la diabetes tipo 2, [46] con respuestas físicas cuantitativas a la ingesta circadiana de alimentos como entradas potenciales. al sistema de reloj. [47]