Doubletime ( DBT ), también conocido como disco de crecimiento excesivo ( DCO ), es un gen que codifica la proteína doubletime en las moscas de la fruta ( Drosophila melanogaster ) . Michael Young y su equipo de la Universidad Rockefeller identificaron y caracterizaron por primera vez el gen en 1998.
La proteína codificada por DBT es una quinasa que fosforila la proteína del período (PER), que es crucial en el control del reloj biológico que regula los ritmos circadianos . [1] Se ha observado que varias mutaciones en el gen DBT causan alteraciones en el período de actividad locomotora en las moscas, incluido el alargamiento, el acortamiento o la pérdida completa del período en las moscas. En los mamíferos, el homólogo de DBT es la caseína quinasa I épsilon , que tiene un papel similar en la regulación del ritmo circadiano.
La función circadiana de la Drosophila y de ciertas enzimas caseína quinasa 1 de vertebrados se ha conservado a lo largo de una larga escala de tiempo evolutiva , lo que hace que la DBT y sus homólogos sean objetivos esenciales para la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación del ritmo circadiano en varios organismos. [2]
El gen doubletime ( DBT ) fue descubierto y caracterizado por primera vez en 1998 por Michael Young y su equipo en la Universidad Rockefeller. [3] El grupo de investigación de Young, encabezado por Jeffrey Price, publicó sus hallazgos en un artículo que caracterizaba tres alelos de DBT en moscas de la fruta. [4] Se informó que dos alelos mutantes , llamados short y long ( DBT s y DBT l , respectivamente), fueron capaces de alterar el ciclo normal de los genes Period ( per ) y Timeless ( TIM ). [3] [4]
El equipo sospechó que el retraso entre el aumento de los niveles de ARNm de per y TIM y el aumento de las proteínas PER y TIM se debía a los efectos de otra proteína.
Young sospechó que esta proteína retrasaba la acumulación intercelular de la proteína PER destruyéndola. Sólo cuando PER se combinaba con TIM esta degradación no era posible. Este trabajo demostró que la DBT regulaba la degradación de PER. [3] [4]
Young denominó al nuevo gen "doubletime" debido a su efecto sobre el período normal de Drosophila . Las moscas mutantes que solo expresaban DBT S tenían un período de 18 horas, mientras que las que expresaban DBT L tenían un período de 28 horas. [4] El equipo de Young también identificó un tercer alelo, DBT P , que es letal para las pupas mientras elimina cualquier producto per o TIM en las larvas. [4] Los mutantes DBT P son importantes porque proporcionaron pistas sobre cómo funcionaba el producto del gen. [3]
Sin la proteína DBT funcional, las moscas acumulan altos niveles de PER. Estas proteínas PER no se desintegran sin emparejarse con proteínas TIM. Estos mutantes expresaron niveles citosólicos más altos de PER que las células en las que la proteína PER estaba asociada con la proteína TIM. El gen doubletime regula la expresión de PER, que a su vez controla el ritmo circadiano. [3] El equipo de Young clonó posteriormente el gen DBT y descubrió que la proteína DBT era una quinasa que fosforilaba específicamente las proteínas PER; concluyeron que las proteínas PER no eran fosforiladas por la proteína DBT en los mutantes DBT P. [4]
El gen está ubicado en el brazo derecho del cromosoma 3. [4] La transcripción de ARNm para DBT tiene una longitud de 3,2 kilopares de bases y contiene cuatro exones y tres intrones .
La proteína DBT está compuesta por 440 aminoácidos . [5] La proteína tiene un sitio de unión de ATP , dominios catalíticos de serina/treonina quinasa y varios sitios potenciales de fosforilación , incluido un sitio de autofosforilación . [5]
En Drosophila , un mecanismo de reloj impulsado molecularmente trabaja para regular los ritmos circadianos como la actividad locomotora y la eclosión al oscilar los niveles de las proteínas PER y TIM a través de bucles de retroalimentación positiva y negativa . [4] [6] Dbt produce una quinasa que fosforila PER para regular su acumulación en el citoplasma y su degradación en el núcleo. [6] [7] En el citoplasma, los niveles de PER y TIM aumentan durante la noche, y DBT se une a PER mientras los niveles de TIM aún son bajos. [8] DBT fosforila el PER citoplasmático, lo que conduce a su degradación. Cuando TIM se acumula, PER y TIM se unen, lo que inhibe la degradación de PER. Esta degradación citoplasmática de PER, seguida de acumulación, causa un retraso de cuatro a seis horas entre los niveles de ARNm de per y proteína PER. [8] El complejo PER/TIM, todavía unido a DBT, migra al núcleo, donde suprime la transcripción de per y tim . El TIM se pierde del complejo, tras lo cual el DBT fosforila el PER, degradándolo. Este mecanismo permite la transcripción del CLOCK y de los genes que controla (con transcripción controlada por mecanismos circadianos). [8] [9]
La transcripción del ARNm de DBT y los niveles de la proteína DBT son constantes a lo largo del día y no están controlados por los niveles de PER/TIM; sin embargo, la ubicación y la concentración de la proteína DBT dentro de la célula cambian a lo largo del día. [5] Está presente de manera constante en el núcleo en niveles variables, pero en el citoplasma está presente predominantemente al final del día y al principio de la noche, cuando los niveles de PER y TIM alcanzan su punto máximo. [5]
Antes de que la DBT comience a fosforilar PER, una proteína diferente llamada quinasa NEMO/NLK comienza a fosforilar PER en su dominio per -corto. [ aclaración necesaria ] La fosforilación estimula a la DBT para que comience a fosforilar PER en múltiples sitios cercanos. En total, hay alrededor de 25-30 sitios de fosforilación en PER. [10] El PER fosforilado se une a la proteína F-box SLIMB, y luego se dirige a la degradación a través de la vía ubiquitina-proteasoma; Syed y Saez concluyen que la fosforilación de PER por DBT conduce a una disminución en la abundancia de PER, que es un paso necesario en el funcionamiento del reloj interno del organismo. [7]
La actividad de DBT sobre PER se ve facilitada por la actividad de las proteínas CKII y SHAGGY (SGG), así como por una proteína fosfatasa expresada rítmicamente que actúa como antagonista. Es posible, pero actualmente se desconoce, si DBT regula otras funciones de PER u otras proteínas circadianas. [6] No ha habido evidencia que sugiera que DBT se una directamente a TIM. [5] La única quinasa conocida que fosforila directamente TIM es la proteína quinasa SGG, pero esto no afecta principalmente a la estabilidad de TIM, lo que sugiere la presencia de una quinasa o fosfatasa diferente. [11] DBT está involucrada en el reclutamiento de otras quinasas en complejos de represión PER. Estas quinasas fosforilan el factor de transcripción CLK, que libera el complejo CLK- CYC de la E-Box y reprime la transcripción. [1]
Hay tres alelos mutantes primarios de DBT : DBT S , que acorta el período de funcionamiento libre del organismo (su período interno en condiciones de luz constante); DBT L , que alarga el período de funcionamiento libre; y DBT P , que causa letalidad pupal y elimina las proteínas del ciclo circadiano y la transcripción de per y TIM . [4] Todos los mutantes excepto DBT S producen una degradación diferencial de PER que se corresponde directamente con su comportamiento fenotípico. La degradación de PER de DBT S se asemeja a la de DBT de tipo salvaje, lo que sugiere que DBT S no afecta el reloj a través de este mecanismo de degradación. Se ha sugerido que DBT S funciona actuando como un represor o produciendo un patrón de fosforilación diferente del sustrato. DBT S causa la terminación temprana de la transcripción de per . [7]
La mutación DBT L hace que el período de oscilaciones PER y TIM y la actividad conductual animal se alarguen hasta aproximadamente 27 horas. Este ritmo prolongado se debe a una menor tasa de fosforilación de PER debido a niveles más bajos de actividad de la cinasa DBT. Esta mutación se debe a una sustitución en la secuencia de la proteína (mutación Met-80→Ile).
La mutación DBT S causa un período de oscilación PER/TIM de 18 a 20 horas. No hay evidencia actual del mecanismo afectado por la mutación, pero se debe a una sustitución en la secuencia de la proteína (mutación Pro-47→ Ser). [7]
Otra mutación de DBT es DBT AR , que causa actividades arrítmicas en Drosophila . Es un alelo hipermórfico resultante de una mutación His 126→Tyr. Las moscas homocigotas con esta mutación son viables pero arrítmicas, mientras que los heterocigotos DBT AR/+ tienen períodos extralargos de aproximadamente 29 horas, y su actividad de la quinasa DBT se reduce a la tasa más baja de todos los alelos DBT . [7]
Las mutaciones del gen del reloj, incluidas las del DBT de Drosophila , alteran la sensibilización de la actividad locomotora inducida por fármacos después de la exposición repetida a psicoestimulantes . La Drosophila con alelos mutantes de DBT no mostró sensibilización locomotora en respuesta a la exposición repetida a la cocaína . [12] Además, existe evidencia experimental de que este gen funciona en 13 procesos biológicos únicos: regulación biológica, proceso metabólico del fósforo, establecimiento de polaridad planar, regulación positiva del proceso biológico, proceso celular, proceso de desarrollo de un solo organismo, respuesta al estímulo, respuesta a una sustancia orgánica, desarrollo de órganos sensoriales, modificación de macromoléculas, crecimiento, organización o biogénesis de componentes celulares y proceso rítmico. [13] El nombre alternativo del gen, discos crecidos , se refiere a su papel como gen regulador del crecimiento celular que tiene fuertes efectos en la supervivencia celular y el control del crecimiento en discos imaginales , un atributo de la etapa de mosca larvaria . La proteína es necesaria en el mecanismo que vincula la supervivencia celular durante la proliferación y el arresto del crecimiento. [5]
La proteína DBT puede desempeñar un papel no catalítico en la atracción de quinasas que fosforilan CLOCK ( CLK ), un activador de la transcripción. [1] DBT tiene un papel no catalítico en el reclutamiento de quinasas, algunas de las cuales aún no se han descubierto, en el ciclo de retroalimentación transcripción-traducción. [14] La actividad catalítica de DBT no está asociada con la fosforilación de CLK o su represión transcripcional. La fosforilación de PER por DBT es fundamental para reprimir la transcripción dependiente de CLK. La proteína DBT no es catalítica en el reclutamiento de quinasas adicionales que fosforilan indirectamente CLK, lo que regula negativamente la transcripción. Existe una vía similar en los mamíferos debido a la conservación mecanicista del homólogo CKI. [1] En 2004, se observó que las células de Drosophila tenían una actividad reducida de CKI-7 en mutantes DBT s y DBT l . [15]
La familia de quinasas de caseína quinasa 1 (CK1) comprende un grupo altamente conservado de proteínas que se encuentran en organismos que van desde Arabidopsis hasta Drosophila y los humanos. [16] Dado que DBT es un miembro de esta familia, ha suscitado preguntas sobre las funciones de estos genes relacionados en otros sistemas modelo. Dentro de los mamíferos, hay siete isoformas de CK1 , cada una con funciones distintas en torno a la fosforilación de proteínas. Se encontró que CK1ε era la más homóloga a DBT con una similitud del 86%. [16] Esta similitud genética se extiende a la homología funcional; por ejemplo, mientras que la fosforilación por DBT en Drosophila apunta a las proteínas PER para la degradación del proteasoma, la fosforilación de CK1ε marca las proteínas PER de los mamíferos para la degradación al reducir su estabilidad. [16] [17] [18] Aunque DBT y CK1ε desempeñan funciones similares en sus respectivos organismos, los estudios que examinan la eficacia de CK1ε en Drosophila han revelado que no son completamente intercambiables funcionalmente, [19] aunque sus funciones son altamente análogas; por ejemplo, se ha demostrado que CK1ε reduce la vida media de mPER1, uno de los tres homólogos de PER en mamíferos. [16] La localización nuclear de las proteínas mPER está asociada con la fosforilación, lo que subraya otra función vital de la proteína CK1ε. [16]
Inicialmente, el papel de CKIε dentro del reloj circadiano de los mamíferos se descubrió debido a una mutación en hámsteres. La mutación tau en el hámster dorado sirio fue la primera en mostrar una anomalía hereditaria de los ritmos circadianos en mamíferos. [16] Los hámsteres con la mutación exhiben un período más corto que el tipo salvaje. Los heterocigotos tienen un período de aproximadamente 22 horas, mientras que el período de los mutantes homocigóticos es de aproximadamente 20 horas. [16] Debido a investigaciones previas que investigaron el papel de DBT en el establecimiento de períodos, se encontró que la mutación tau estaba en el mismo locus que el gen CKIε. [20] La mutación es similar a las mutaciones DBT S y DBT L , que afectan el período interno de Drosophila . Sin embargo, las fuerzas que impulsan estos cambios en el período parecen diferentes. Se encontró que la mutación puntual que resultó en el mutante tau disminuyó la actividad de la quinasa CKIε in vitro . En las moscas, la mutación DBT L se asocia con una disminución de la actividad de DBT y un período más largo, lo que es consistente con otro experimento realizado en hámsteres que mostró un alargamiento del período causado por la inhibición de CKI. [18] Para investigar esta discrepancia, los investigadores estudiaron la vida media de PER2 en relación con CKIε de tipo salvaje, CKIεtau y CKIε (K38A), que es un mutante inactivo de la quinasa. Los resultados indicaron que la mutación tau era en realidad una mutación de ganancia de función que causaba la degradación más rápida de las proteínas PER. [18]
La CKIε también desempeña un papel en los seres humanos en relación con el síndrome de la fase avanzada del sueño familiar , en el que los individuos presentan un período circadiano significativamente más corto en comparación con la población general. La anomalía no parece deberse a una mutación en la proteína CKIε, sino más bien al sitio de unión para la fosforilación en la proteína PER2. [16]
La actividad de la quinasa está implicada en la localización nuclear de PER y otros genes fundamentales para la ritmicidad circadiana. [21]
Se ha propuesto que la fosforilación rítmica podría ser un factor fundamental de los relojes circadianos. Tradicionalmente, se ha reconocido que el ciclo de retroalimentación negativa de la transcripción y la traducción es la fuente de las oscilaciones y los ritmos en los relojes biológicos. Sin embargo, los experimentos in vitro que muestran la fosforilación de la proteína cianobacteriana KaiC demostraron que las oscilaciones rítmicas podrían persistir incluso en ausencia de procesos de transcripción o traducción. [22]