Doubletime ( DBT ), también conocido como discos sobrecrecidos ( DCO ), es un gen que codifica la proteína doubletime en la mosca de la fruta ( Drosophila melanogaster ) . Michael Young y su equipo de la Universidad Rockefeller identificaron y caracterizaron el gen por primera vez en 1998.
La proteína codificada por DBT es una quinasa que fosforila la proteína del período (PER), que es crucial para controlar el reloj biológico que regula los ritmos circadianos . [1] Se ha observado que varias mutaciones en el gen DBT causan alteraciones en el período de actividad locomotora en las moscas, incluido el alargamiento, el acortamiento o la pérdida completa del período en las moscas. En los mamíferos, el homólogo de la DBT es la caseína quinasa I épsilon , que tiene un papel similar en la regulación del ritmo circadiano.
La función circadiana de Drosophila y ciertas enzimas caseína quinasa 1 de vertebrados se ha conservado durante una larga escala de tiempo evolutiva , lo que convierte a la DBT y sus homólogos en objetivos esenciales para la investigación de los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación del ritmo circadiano en varios organismos. [2]
El gen del doble tiempo ( DBT ) fue descubierto y caracterizado por primera vez en 1998 por Michael Young y su equipo de la Universidad Rockefeller. [3] El grupo de investigación de Young, encabezado por Jeffrey Price, publicó sus hallazgos en un artículo que caracterizaba tres alelos de DBT en moscas de la fruta. [4] Se informó que dos alelos mutantes , denominados corto y largo ( DBT sy DBT l , respectivamente), fueron capaces de alterar el ciclo normal de los genes Period ( per ) y Timeless (TIM ). [3] [4]
El equipo sospechaba que el retraso entre el aumento de los niveles de ARNm de per y TIM y el aumento de las proteínas PER y TIM se debía a los efectos de otra proteína.
Young sospechaba que esta proteína posponía la acumulación intercelular de la proteína PER destruyéndola. Sólo cuando PER se combinó con TIM no fue posible este desglose. Este trabajo demostró que DBT regulaba la descomposición del PER. [3] [4]
Young denominó al nuevo gen "doble tiempo" debido a su efecto sobre el período normal de Drosophila . Las moscas mutantes que solo expresaron DBT S tuvieron un período de 18 horas, mientras que aquellas que expresaron DBT L tuvieron un período de 28 horas. [4] El equipo de Young también identificó un tercer alelo, DBT P , que es letal para las pupas y elimina cualquier producto per o TIM en las larvas. [4] Los mutantes DBT P son importantes porque proporcionaron pistas sobre cómo funcionaba el producto genético. [3]
Sin la proteína DBT funcional, las moscas acumulan altos niveles de PER. Estas proteínas PER no se desintegran sin emparejarse con proteínas TIM. Estos mutantes expresaron niveles citosólicos más altos de PER que las células en las que la proteína PER estaba asociada con la proteína TIM. El gen del doble tiempo regula la expresión de PER, que a su vez controla el ritmo circadiano. [3] Posteriormente, el equipo de Young clonó el gen DBT y descubrió que la proteína DBT era una quinasa que fosforilaba específicamente las proteínas PER; Llegaron a la conclusión de que las proteínas PER no estaban fosforiladas por la proteína DBT en mutantes DBT P. [4]
El gen está ubicado en el brazo derecho del cromosoma 3. [4] La transcripción de ARNm de DBT tiene 3,2 pares de kilobases de largo y contiene cuatro exones y tres intrones .
La proteína DBT está compuesta por 440 aminoácidos . [5] La proteína tiene un sitio de unión a ATP , dominios catalíticos de serina/treonina quinasa y varios sitios potenciales de fosforilación , incluido un sitio para la autofosforilación . [5]
En Drosophila , un mecanismo de reloj impulsado molecularmente funciona para regular los ritmos circadianos, como la actividad locomotora y la eclosión, al hacer oscilar los niveles de las proteínas PER y TIM a través de bucles de retroalimentación positiva y negativa . [4] [6] Dbt produce una quinasa que fosforila PER para regular su acumulación en el citoplasma y su degradación en el núcleo. [6] [7] En el citoplasma, los niveles de PER y TIM aumentan durante la noche, y la DBT se une a PER mientras los niveles de TIM aún son bajos. [8] La DBT fosforila el PER citoplasmático, lo que conduce a su degradación. Cuando TIM se acumula, PER y TIM se unen, lo que inhibe la degradación de PER. Esta degradación citoplásmica de PER, seguida de acumulación, provoca un retraso de cuatro a seis horas entre los niveles de ARNm per y proteína PER. [8] El complejo PER/TIM, todavía unido a DBT, migra al núcleo, donde suprime la transcripción de per y tim . TIM se pierde del complejo, tras lo cual DBT fosforila PER, degradándolo. Este mecanismo permite la transcripción del RELOJ y los genes que controla (con la transcripción controlada por mecanismos circadianos). [8] [9]
La transcripción del ARNm de DBT y los niveles de la proteína DBT son consistentes a lo largo del día y no están controlados por los niveles de PER/TIM; sin embargo, la ubicación y concentración de la proteína DBT dentro de la célula cambian a lo largo del día. [5] Está constantemente presente en el núcleo en diferentes niveles, pero en el citoplasma está predominantemente presente al final del día y temprano en la noche, cuando los niveles de PER y TIM alcanzan su punto máximo. [5]
Antes de que DBT comience a fosforilar PER, una proteína diferente llamada quinasa NEMO/NLK comienza a fosforilar PER en su dominio corto . [ aclaración necesaria ] La fosforilación estimula a DBT para que comience a fosforilar PER en múltiples sitios cercanos. En total, hay entre 25 y 30 sitios de fosforilación en PER. [10] El PER fosforilado se une a la proteína F-box SLIMB y luego es objetivo de degradación a través de la vía ubiquitina-proteosoma; Syed y Saez concluyen que la fosforilación de PER por la DBT conduce a una disminución en la abundancia de PER, que es un paso necesario en el funcionamiento del reloj interno del organismo. [7]
La actividad de DBT sobre PER se ve favorecida por la actividad de las proteínas CKII y SHAGGY (SGG), así como por una proteína fosfatasa expresada rítmicamente que actúa como antagonista. Es posible, pero actualmente se desconoce, si la DBT regula otras funciones de PER u otras proteínas circadianas. [6] No ha habido evidencia que sugiera que DBT se une directamente a TIM. [5] La única quinasa que se sabe que fosforila directamente TIM es la proteína quinasa SGG, pero esto no afecta en gran medida la estabilidad de TIM, lo que sugiere la presencia de una quinasa o fosfatasa diferente. [11] DBT participa en el reclutamiento de otras quinasas en complejos de represión PER. Estas quinasas fosforilan el factor de transcripción CLK, que libera el complejo CLK- CYC de la E-Box y reprime la transcripción. [1]
Hay tres alelos mutantes primarios de DBT : DBT S , que acorta el período de libre funcionamiento del organismo (su período interno en condiciones de luz constante); DBT L , que alarga el periodo de libre ejecución; y DBT P , que causa letalidad pupal y elimina las proteínas del ciclo circadiano y la transcripción de per y TIM . [4] Todos los mutantes, excepto DBT S, producen una degradación diferencial de PER que se corresponde directamente con su comportamiento fenotípico. La degradación de DBT S PER se parece a la DBT de tipo salvaje, lo que sugiere que DBT S no afecta el reloj a través de este mecanismo de degradación. Se ha sugerido que DBT S actúa actuando como represor o produciendo un patrón de fosforilación diferente del sustrato. DBT S provoca la terminación anticipada de la transcripción. [7]
La mutación DBT L hace que el período de oscilaciones PER y TIM y la actividad del comportamiento animal se alargue hasta aproximadamente 27 horas. Este ritmo extendido es causado por una menor tasa de fosforilación de PER debido a niveles más bajos de actividad de la DBT quinasa. Esta mutación es causada por una sustitución en la secuencia de la proteína (mutación Met-80→Ile).
La mutación DBT S provoca un período de oscilación PER/TIM de 18 a 20 horas. No hay evidencia actual del mecanismo afectado por la mutación, pero está causada por una sustitución en la secuencia de la proteína (mutación Pro-47→ Ser). [7]
Otra mutación de DBT es DBT AR , que provoca actividades arrítmicas en Drosophila . Es un alelo hipermórfico resultante de una mutación His 126→Tyr. Las moscas homocigotas con esta mutación son viables pero arrítmicas, mientras que los heterocigotos DBT AR/+ tienen períodos extralargos de aproximadamente 29 horas y su actividad quinasa DBT se reduce a la tasa más baja de todos los alelos DBT . [7]
Las mutaciones del gen del reloj, incluidas las del DBT de Drosophila , alteran la sensibilización de la actividad locomotora inducida por fármacos después de una exposición repetida a psicoestimulantes . Drosophila con alelos mutantes de DBT no logró mostrar sensibilización locomotora en respuesta a la exposición repetida a la cocaína . [12] Además, existe evidencia experimental de que este gen funciona en 13 procesos biológicos únicos: regulación biológica, proceso metabólico del fósforo, establecimiento de polaridad plana, regulación positiva del proceso biológico, proceso celular, proceso de desarrollo de un solo organismo, respuesta. al estímulo, respuesta a una sustancia orgánica, desarrollo de órganos sensoriales, modificación de macromoléculas, crecimiento, organización de componentes celulares o biogénesis y proceso rítmico. [13] El nombre alternativo del gen, discos demasiado crecidos , se refiere a su papel como gen regulador del crecimiento celular que tiene fuertes efectos sobre la supervivencia celular y el control del crecimiento en los discos imaginales , un atributo de la etapa de larva de mosca. La proteína es necesaria en el mecanismo que vincula la supervivencia celular durante la proliferación y la detención del crecimiento. [5]
La proteína DBT puede desempeñar un papel no catalítico en la atracción de quinasas que fosforilan CLOCK ( CLK ), un activador de la transcripción. [1] La DBT tiene un papel no catalítico en el reclutamiento de quinasas, algunas de las cuales aún no se han descubierto, en el circuito de retroalimentación de transcripción-traducción. [14] La actividad catalítica de DBT no está asociada con la fosforilación de CLK o su represión transcripcional. La fosforilación de PER por DBT es fundamental para reprimir la transcripción dependiente de CLK. La proteína DBT no es catalítica en el reclutamiento de quinasas adicionales que fosforilan indirectamente a CLK, lo que regula negativamente la transcripción. Existe una vía similar en los mamíferos debido a la conservación mecánica del homólogo de CKI. [1] En 2004, se observó que las células de Drosophila tenían una actividad CKI-7 reducida en los mutantes DBT sy DBT l . [15]
La familia de quinasas caseína quinasa 1 (CK1) comprende un grupo altamente conservado de proteínas que se encuentran en organismos que van desde Arabidopsis hasta Drosophila y los humanos. [16] Dado que DBT es miembro de esta familia, ha generado preguntas sobre las funciones de estos genes relacionados en otros sistemas modelo. Dentro de los mamíferos, hay siete isoformas de CK1 , cada una con funciones distintas en torno a la fosforilación de proteínas. Se encontró que CK1ε era el más homólogo de DBT con una similitud del 86%. [16] Esta similitud genética se extiende a la homología funcional; por ejemplo, mientras que la fosforilación por DBT en Drosophila apunta a las proteínas PER para la degradación del proteasoma, la fosforilación de CK1ε marca las proteínas PER de los mamíferos para su degradación al reducir su estabilidad. [16] [17] [18] Aunque DBT y CK1ε desempeñan funciones similares en sus respectivos organismos, los estudios que examinan la eficacia de CK1ε en Drosophila han revelado que no son completamente funcionalmente intercambiables, [19] aunque sus funciones son muy análogas; por ejemplo, se ha demostrado que CK1ε reduce la vida media de mPER1, uno de los tres homólogos de PER de mamíferos. [16] La localización nuclear de las proteínas mPER está asociada con la fosforilación, lo que subraya otra función vital de la proteína CK1ε. [dieciséis]
Inicialmente, el papel de CKIε dentro del reloj circadiano de los mamíferos se descubrió debido a una mutación en los hámsteres. La mutación tau en el hámster dorado sirio fue la primera en mostrar una anomalía hereditaria de los ritmos circadianos en los mamíferos. [16] Los hámsteres con la mutación exhiben un período más corto que el tipo salvaje. Los heterocigotos tienen un período de aproximadamente 22 horas, mientras que el período de los mutantes homocigotos es de aproximadamente 20 horas. [16] Debido a investigaciones previas que investigaron el papel de la DBT en el establecimiento de períodos, se encontró que la mutación tau estaba en el mismo locus que el gen CKIε. [20] La mutación es similar a las mutaciones DBT S y DBT L , que afectan el período interno de Drosophila . Sin embargo, las fuerzas que impulsaron estos cambios en el período parecen diferentes. Se descubrió que la mutación puntual que dio lugar al mutante tau disminuía la actividad de la quinasa CKIε in vitro . En moscas, la mutación DBT L se asocia con una disminución de la actividad de DBT y un período más prolongado, lo que concuerda con otro experimento realizado en hámsteres que mostró un alargamiento del período causado por la inhibición de CKI. [18] Para investigar esta discrepancia, los investigadores estudiaron la vida media de PER2 en relación con CKIε, CKIεtau y CKIε (K38A) de tipo salvaje, que es un mutante inactivo de quinasa. Los resultados indicaron que la mutación tau era en realidad una mutación de ganancia de función que causaba una degradación más rápida de las proteínas PER. [18]
CKIε también desempeña un papel en los seres humanos en relación con el síndrome familiar de fase avanzada del sueño , en el que los individuos presentan un período circadiano significativamente más corto en comparación con la población general. La anomalía no parece deberse a una mutación en la proteína CKIε, sino más bien en el sitio de unión para la fosforilación de la proteína PER2. [dieciséis]
La actividad quinasa está implicada en la localización nuclear de PER y otros genes fundamentales para el ritmo circadiano. [21]
Existe la propuesta de que la fosforilación rítmica podría ser un impulsor fundamental de los relojes circadianos. Tradicionalmente, el circuito de retroalimentación negativa transcripción-traducción ha sido reconocido como la fuente de oscilaciones y ritmos en los relojes biológicos. Sin embargo, experimentos in vitro que mostraron la fosforilación de la proteína cianobacteriana KaiC demostraron que las oscilaciones rítmicas podrían persistir incluso en ausencia de procesos de transcripción o traducción. [22]