Timeless ( tim ) es un gen presente en múltiples especies, pero es más conocido por su función en Drosophila al codificar TIM, una proteína esencial que regula el ritmo circadiano . El ARNm y la proteína Timeless oscilan rítmicamente con el tiempo como parte de un ciclo de retroalimentación negativa de transcripción-traducción que involucra al gen period ( per ) y su proteína.
En 1994, se descubrió timeless a través de una prueba genética avanzada realizada por Jeffery L. Price mientras trabajaba en el laboratorio de Michael W. Young . [1] Este gen se encontró cuando notaron un mutante arrítmico tim 01 a través de una prueba del elemento P. [2] [3] La mutación tim 01 causó un comportamiento arrítmico, definido por la falta de capacidad para establecer ritmos circadianos adecuados. [1] En 1995, el gen timeless fue clonado por Amita Sehgal y sus socios en el laboratorio de Michael W. Young. [4] A diferencia del gen timeless de Drosophila , se han descubierto homólogos en otras especies que no son esenciales para el ritmo circadiano. [5] El descubrimiento de lo atemporal siguió al descubrimiento de los mutantes del período en 1971 a través de una prueba genética avanzada, la clonación de per en 1984 y un experimento que determinó que per es circadiano en 1990. Esto ocurrió durante un período de rápida expansión en el campo de la cronobiología en la década de 1990.
La longitud de la región codificante del gen timeless de Drosophila es de 4029 pares de bases, a partir de los cuales se transcribe una proteína de 1398 aminoácidos . [6] El gen comienza en un sitio de tapa de consenso aguas arriba de un codón de metionina . Contiene 11 exones y 10 intrones . En varias especies de Drosophila , la proteína timeless TIM contiene dominios funcionales y secuencias de aminoácidos más altamente conservados que su contraparte, PER (proteína codificada por per ). CLD fue la menos conservada de estas regiones entre D. virilis y D. melanogaster . [6] Estas partes conservadas incluyen: el dominio de interacción PER, la señal de localización nuclear (NLS), el dominio de localización citoplasmática (CLD), el extremo N-terminal (no funcional) y el extremo C-terminal . [6] También se sabe que TIM tiene una región básica, que interactúa con el dominio PAS de la proteína PER, y una región ácida central. También hay una región de función desconocida cerca del extremo N de la proteína TIM que contiene una secuencia de 32 aminoácidos que, cuando se elimina, provoca un comportamiento arrítmico en la mosca. En varias especies de Drosophila, como D. virilis y D. melanogaster , la metionina iniciadora para la traducción del gen atemporal en TIM se encuentra en diferentes lugares, con el sitio de inicio de D. virilis aguas abajo del sitio de inicio en D. melanogaster . [6]
El gen atemporal es un componente esencial del reloj circadiano molecular en Drosophila . [3] Actúa como parte de un ciclo de retroalimentación autorregulatoria junto con el producto del gen del período (per), como se observó en estudios colaborativos realizados por los laboratorios de Michael W. Young y Amita Sehgal. [7] Estudios posteriores de los laboratorios de Young, Sehgal, Charles Weitz y Michael Rosbash indicaron que la proteína atemporal (TIM) y la proteína del período (PER) forman un heterodímero que exhibe ritmos circadianos en la Drosophila de tipo salvaje . [8] [9] Los investigadores del laboratorio de Rosbash también demostraron que los niveles de ARNm de tim y los niveles de proteína TIM tienen ritmos circadianos que son similares a los del ARNm del período ( per ) y su producto. [8] [10] [11] Los experimentos realizados conjuntamente por los laboratorios de Weitz, Young y Sehgal utilizando levadura 2-híbrida demostraron que TIM se une directamente con PER. [12] Durante las primeras horas de la tarde, PER y TIM se dimerizan y se acumulan. A última hora de la noche, el dímero viaja al núcleo para inhibir la transcripción de PER y TIM . En 1996, los equipos de Sehgal, Edery y Young descubrieron que la exposición a la luz conduce a la degradación de TIM y, posteriormente, de PER. [1] [11] [13]
El heterodímero PER/TIM regula negativamente la transcripción de los genes period ( per ) y timeless ( tim ). Dentro de este ciclo de retroalimentación negativa, primero los heterodímeros PER/TIM se forman en el citoplasma, se acumulan y luego se translocan al núcleo. [14] Luego, el complejo bloquea los factores de transcripción positivos clock (CLK) y cycle (CYC), reprimiendo así la transcripción de per .
Como parte del reloj circadiano, la atemporalidad es esencial para la sincronización con los ciclos de luz-oscuridad (LD). La duración típica del período de una Drosophila en libertad es de 23,9 horas, lo que requiere adaptaciones al ciclo ambiental de 24 horas. [15] La adaptación comienza primero con la exposición a la luz. Este proceso conduce a la rápida degradación de la proteína TIM, lo que permite que los organismos se sincronicen al amanecer con los ciclos ambientales. [16]
En los ciclos de luz-oscuridad, el nivel de proteína TIM disminuye rápidamente a última hora de la noche o a primera hora de la mañana, seguido de cambios similares pero más graduales en el nivel de proteína PER. La degradación de TIM es independiente de per y su proteína, y libera PER del complejo PER/TIM. [8] En algunos tipos de células, la proteína fotorreceptora criptocromo (CRY) se asocia físicamente con TIM y ayuda a regular la degradación dependiente de la luz. CRY se activa con la luz azul, que se une a TIM y lo marca para su degradación. [17] Esto pone fin a la represión PER/TIM de la transcripción mediada por CLK/CYC de los genes per y tim , lo que permite que se produzca el ARNm de per y tim para reiniciar el ciclo. [8]
Este mecanismo permite que las moscas se adapten a las señales luminosas ambientales. Cuando las Drosophila reciben entradas de luz en las primeras horas de la noche subjetiva, la degradación de TIM inducida por la luz provoca un retraso en la acumulación de TIM, lo que crea un retraso de fase. [17] Cuando se reciben entradas de luz en las últimas horas de la noche subjetiva, un pulso de luz hace que la degradación de TIM se produzca antes que en condiciones normales, lo que conduce a un avance de fase. [17]
En Drosophila , el regulador negativo PER, del complejo PER/TIM, se degrada finalmente mediante un ciclo de fosforilación mediado por la caseína quinasa , lo que permite fluctuaciones en la expresión génica según las señales ambientales. Estas proteínas median la expresión oscilante del factor de transcripción VRILLE (VRI), que es necesario para la ritmicidad conductual, la expresión de per y tim y la acumulación de PDF (factor de dispersión de pigmentos). [16]
La atemporalidad no parece ser esencial para la oscilación del reloj circadiano de todos los insectos. En el tipo salvaje Gryllus bimaculatus , el ARNm de tim muestra una expresión rítmica tanto en LD como en DD (ciclos oscuro-oscuro) similar a la de per , alcanzando un máximo durante la noche subjetiva. Cuando se inyectó con ARN bicatenario de tim ( dstim ), los niveles de ARNm de tim se redujeron significativamente y se eliminó su ritmo de expresión circadiana. Sin embargo, después del tratamiento con dstim , los grillos adultos mostraron un ritmo locomotor claro en oscuridad constante, con un período de funcionamiento libre significativamente más corto que el de los grillos de control inyectados con ARNbc de Discosoma sp. Red2 (DsRed2). Estos resultados sugieren que en el grillo, tim juega algún papel en el ajuste fino del período de funcionamiento libre, pero puede no ser esencial para la oscilación del reloj circadiano. [5]
En 1998, los investigadores identificaron un homólogo de ratón y un homólogo humano del gen timeless de Drosophila . [18] El papel exacto de TIM en mamíferos aún no está claro. Trabajos recientes sobre el timeless de mamíferos ( mTim ) en ratones han sugerido que el gen puede no desempeñar el mismo papel esencial en mamíferos que en Drosophila como una función necesaria del reloj circadiano. [19] Si bien Tim se expresa en el núcleo supraquiasmático (SCN), que se cree que es el oscilador primario en humanos, su transcripción no oscila rítmicamente en condiciones constantes, y la proteína TIM permanece en el núcleo. [19] [20]
Sin embargo, se ha demostrado que mTim es necesario para el desarrollo embrionario en ratones, lo que indica una función genética diferente a la de Drosophila . Esto sugiere una divergencia entre los relojes de los mamíferos y el reloj de Drosophila . [19] Además, el tim de los mamíferos es más ortólogo al parálogo Tim-2 ( Timeout ) del gen Timeless de Drosophila que el propio gen. [21] Al igual que el tim-2 , los ortólogos de los mamíferos tienen un dominio de unión a PARP1 (PAB) C-terminal . El complejo del que forman promueve la reparación del ADN por recombinación homóloga . [22]
Se cree que la proteína atemporal conecta directamente el ciclo celular con el ritmo circadiano en los mamíferos. En este modelo, denominado “acoplamiento directo”, [23] los dos ciclos comparten una proteína clave cuya expresión muestra un patrón circadiano. El papel esencial de Tim en Drosophila en la creación del ritmo circadiano lo cumple Cry en los mamíferos. En los mamíferos, la transcripción de Cry y Per es activada por el complejo CLOCK / BMAL1 y reprimida por el complejo PER/CRY. [24]
Se ha demostrado que la proteína atemporal humana (hTIM) es necesaria para la producción de oscilaciones eléctricas emitidas por el núcleo supraquiasmático (SCN), el reloj principal que rige todos los ritmos circadianos específicos de los tejidos del cuerpo. [25] Esta proteína también interactúa con los productos de los principales genes del reloj CLOCK , BMAL , PER1 , PER2 y PER3 .
Sancar y sus colegas investigaron si hTIM desempeñaba un papel similar a los ortólogos en C. elegans y tipos de levadura, que se sabe que desempeñan papeles importantes en el ciclo celular . [23] Sus experimentos sugirieron que hTIM desempeña un papel integral en los puntos de control del ciclo celular G2/M e intra-S. [23] Con respecto al punto de control G2/M, hTIM se une a la subunidad ATRIP en ATR , una proteína quinasa sensible al daño del ADN. Esta unión entre hTIM y ATR conduce a la fosforilación de Chk1 , lo que resulta en la detención del ciclo celular o apoptosis. [23] Este proceso sirve como un control importante para detener la proliferación de células con daño del ADN antes de la división mitótica . El papel de hTIM en el punto de control intra-S es menos claro a nivel molecular; sin embargo, la regulación negativa de hTIM conduce a un aumento en la tasa de generación de horquillas de replicación, incluso en presencia de daño del ADN y otras respuestas reguladoras. [23]
También se ha descubierto que el gen Timeless influye en el desarrollo de enfermedades en humanos. La regulación negativa del gen timeless en células de carcinoma humano conduce a telómeros acortados , lo que indica su papel en el mantenimiento de la longitud de los telómeros. El daño del ADN asociado a los telómeros también aumenta en células agotadas de timeless , junto con el retraso de la replicación de los telómeros. Swi1 es una proteína relacionada con timeless que es necesaria para la replicación del ADN en la región de los telómeros. [26] Esta asociación entre timeless y telómeros es indicativa de la posible asociación del gen con el cáncer. [27]
Una sustitución de un solo polimorfismo de nucleótido que resulta en la transformación de glutamina en arginina en la secuencia de aminoácidos del gen humano timeless no muestra asociación con las tendencias matutinas o vespertinas en los humanos. [28] Esto es consistente con otras investigaciones, que sugieren que htim no es importante en el ritmo circadiano de los humanos.
En la actualidad, se ha descubierto que Timeless se sobreexpresa con frecuencia en muchos tipos de tumores diferentes. En un estudio que utilizó oligos de ARNi dirigidos a Timeless , seguido de un microarreglo de expresión del genoma completo, así como un análisis de red. Se realizaron más pruebas de la regulación negativa de Timeless en las tasas de proliferación celular de una línea celular de cáncer de cuello uterino y de mama. Se descubrió que la expresión elevada de Timeless se asociaba significativamente con un estadio tumoral más avanzado y un peor pronóstico del cáncer de mama. [29] La similitud en las firmas de expresión genética ha permitido identificar a TIMELESS como un supresor de quinasa de Ras -1 (KSR1) y un objetivo potencial necesario para la supervivencia de las células cancerosas. La sobreexpresión de TIMELESS representa una vulnerabilidad en los tumores impulsados por Ras que ofrece una perspectiva potencial de objetivos nuevos y selectivos encontrados en los cánceres impulsados por Ras, que se pueden aprovechar para desarrollar terapias selectivas y más efectivas. [30]