La proteína verde fluorescente ( GFP ) es una proteína que exhibe fluorescencia verde cuando se expone a luz en el rango de azul a ultravioleta . [2] [3] La etiqueta GFP tradicionalmente se refiere a la proteína aislada por primera vez de la medusa Aequorea victoria y, a veces, se denomina avGFP . Sin embargo, se han encontrado GFP en otros organismos, incluidos corales , anémonas de mar , zoanítidos , copépodos y lancetas . [4]
La GFP de A. victoria tiene un pico de excitación mayor a una longitud de onda de 395 nm y uno menor a 475 nm. Su pico de emisión está a 509 nm, que se encuentra en la porción verde inferior del espectro visible . El rendimiento cuántico de fluorescencia (QY) de GFP es 0,79. La GFP del pensamiento de mar ( Renilla reniformis ) tiene un único pico de excitación importante a 498 nm. La GFP es una herramienta excelente en muchas formas de biología debido a su capacidad para formar un cromóforo interno sin requerir cofactores accesorios , productos genéticos o enzimas / sustratos distintos del oxígeno molecular. [5]
En biología celular y molecular , el gen GFP se utiliza frecuentemente como indicador de expresión . [6] Se ha utilizado en formas modificadas para fabricar biosensores y se han creado muchos animales que expresan GFP, lo que demuestra una prueba de concepto de que un gen puede expresarse en todo un organismo determinado, en órganos seleccionados o en células de interés. . La GFP puede introducirse en animales u otras especies mediante técnicas transgénicas y mantenerse en su genoma y en el de su descendencia. Hasta la fecha, la GFP se ha expresado en muchas especies, incluidas bacterias, levaduras, hongos, peces y mamíferos, incluidas células humanas. Los científicos Roger Y. Tsien , Osamu Shimomura y Martin Chalfie recibieron el Premio Nobel de Química 2008 el 10 de octubre de 2008 por su descubrimiento y desarrollo de la proteína verde fluorescente.
La mayoría de los genes disponibles comercialmente para GFP y proteínas fluorescentes similares tienen alrededor de 730 pares de bases de largo. La proteína natural tiene 238 aminoácidos. Su masa molecular es de 27 kD. [7] Por lo tanto, fusionar el gen GFP con el gen de una proteína de interés puede aumentar significativamente el tamaño y la masa molecular de la proteína, y puede alterar la función natural de la proteína o cambiar su ubicación o trayectoria de transporte dentro de la célula. [8]
En las décadas de 1960 y 1970, la GFP, junto con la proteína luminiscente separada aequorina (una enzima que cataliza la descomposición de la luciferina , liberando luz), se purificó por primera vez a partir de la medusa Aequorea victoria y sus propiedades fueron estudiadas por Osamu Shimomura . [9] En A. victoria , la fluorescencia de GFP se produce cuando la equorina interactúa con iones Ca 2+ , induciendo un brillo azul. Parte de esta energía luminiscente se transfiere a la GFP, cambiando el color general hacia el verde. [10] Sin embargo, su utilidad como herramienta para los biólogos moleculares no comenzó a realizarse hasta 1992, cuando Douglas Prasher informó sobre la clonación y la secuencia de nucleótidos de wtGFP en Gene . [11] Los fondos para este proyecto se habían agotado, por lo que Prasher envió muestras de ADNc a varios laboratorios. El laboratorio de Martin Chalfie expresó la secuencia codificante de wtGFP, con los primeros aminoácidos eliminados, en células heterólogas de E. coli y C. elegans , y publicó los resultados en Science en 1994. [12] El laboratorio de Frederick Tsuji informó de forma independiente la expresión de la proteína recombinante un mes después. [13] Sorprendentemente, la molécula de GFP se plegó y era fluorescente a temperatura ambiente, sin la necesidad de cofactores exógenos específicos de la medusa. Aunque esta GFP casi wt era fluorescente, tenía varios inconvenientes, incluidos espectros de excitación de pico dual, sensibilidad al pH, sensibilidad al cloruro, rendimiento cuántico de fluorescencia deficiente, fotoestabilidad deficiente y plegado deficiente a 37 °C (99 °F).
La primera estructura cristalina reportada de una GFP fue la del mutante S65T por el grupo Remington en Science en 1996. [14] Un mes después, el grupo Phillips informó de forma independiente la estructura de GFP de tipo salvaje en Nature Biotechnology . [15] Estas estructuras cristalinas proporcionaron antecedentes vitales sobre la formación de cromóforos y las interacciones de residuos vecinos. Los investigadores han modificado estos residuos mediante mutagénesis dirigida y aleatoria para producir la amplia variedad de derivados de GFP que se utilizan en la actualidad. Investigaciones adicionales sobre GFP han demostrado que es resistente a detergentes, proteasas, tratamientos con cloruro de guanidinio (GdmCl) y cambios drásticos de temperatura. [dieciséis]
Debido al potencial de uso generalizado y a las necesidades cambiantes de los investigadores, se han diseñado muchos mutantes diferentes de GFP. [17] [18] La primera mejora importante fue una mutación puntual única (S65T) informada en 1995 en Nature por Roger Tsien . [19] Esta mutación mejoró drásticamente las características espectrales de GFP, lo que resultó en una mayor fluorescencia, fotoestabilidad y un cambio del pico de excitación principal a 488 nm, con el pico de emisión mantenido en 509 nm. Esto coincidía con las características espectrales de los conjuntos de filtros FITC comúnmente disponibles , aumentando la practicidad de uso por parte del investigador en general. En 1995, los laboratorios de Thastrup [20] y Falkow descubrieron un mutante puntual con eficiencia de plegado a 37 °C (F64L) de este andamio, que produce GFP mejorada (EGFP). [21] EGFP permitió el uso práctico de GFP en células de mamíferos. EGFP tiene un coeficiente de extinción (denotado ε) de 55.000 M −1 cm −1 . [22] El rendimiento cuántico de fluorescencia (QY) de EGFP es 0,60. El brillo relativo, expresado como ε•QY, es 33.000 M −1 cm −1 .
En 2006 se informó sobre la supercarpeta GFP (sfGFP), una serie de mutaciones que permiten que GFP se pliegue y madure rápidamente incluso cuando se fusiona con péptidos que se pliegan mal. [23]
Se han realizado muchas otras mutaciones, incluidas mutantes de color; en particular, proteína fluorescente azul (EBFP, EBFP2, Azurite, mKalama1), proteína fluorescente cian (ECFP, Cerulean, CyPet, mTurquoise2) y derivados de proteínas fluorescentes amarillas (YFP, Citrine, Venus, YPet). Los derivados de BFP (excepto mKalama1) contienen la sustitución Y66H. Exhiben una amplia banda de absorción en el ultravioleta centrada cerca de 380 nanómetros y un máximo de emisión a 448 nanómetros. Se ha desarrollado una proteína mutante verde fluorescente (BFPms1) que se une preferentemente a Zn(II) y Cu(II). BFPms1 tiene varias mutaciones importantes, incluido el cromóforo BFP (Y66H), Y145F para un mayor rendimiento cuántico, H148G para crear un agujero en el barril beta y varias otras mutaciones que aumentan la solubilidad. La unión de Zn (II) aumenta la intensidad de la fluorescencia, mientras que la unión de Cu (II) apaga la fluorescencia y cambia el máximo de absorbancia de 379 a 444 nm. Por tanto, pueden utilizarse como biosensor de Zn. [24]
Unión de cromóforos. La mutación crítica en los derivados del cian es la sustitución Y66W, que hace que el cromóforo se forme con un componente de indol en lugar de fenol. Se requieren varias mutaciones compensatorias adicionales en el barril circundante para restaurar el brillo de este cromóforo modificado debido al mayor volumen del grupo indol. En ECFP y Cerulean, la mitad N-terminal de la séptima hebra exhibe dos conformaciones. Ambas conformaciones tienen un conjunto complejo de interacciones de van der Waals con el cromóforo. Las mutaciones Y145A y H148D en Cerulean estabilizan estas interacciones y permiten que el cromóforo sea más plano, mejor empaquetado y menos propenso a la extinción por colisión. [25]
La mutagénesis aleatoria adicional dirigida al sitio en combinación con la detección basada en la vida útil de la fluorescencia ha estabilizado aún más la séptima cadena β, lo que da como resultado una variante brillante, mTurquoise2, con un rendimiento cuántico (QY) de 0,93. [26] La longitud de onda desplazada al rojo de los derivados de YFP se logra mediante la mutación T203Y y se debe a interacciones de apilamiento de electrones π entre el residuo de tirosina sustituido y el cromóforo. [3] Estas dos clases de variantes espectrales se emplean a menudo para experimentos de transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET). Los reporteros FRET codificados genéticamente, sensibles a moléculas de señalización celular, como calcio o glutamato, estado de fosforilación de proteínas, complementación de proteínas, dimerización de receptores y otros procesos, proporcionan lecturas ópticas altamente específicas de la actividad celular en tiempo real.
La mutagénesis semiracional de varios residuos condujo a mutantes sensibles al pH conocidos como pHluorinas y, más tarde, pHluorinas supereclípticas. Al explotar el rápido cambio de pH tras la fusión de vesículas sinápticas, se han utilizado pHluorinas marcadas con sinaptobrevina para visualizar la actividad sináptica en las neuronas. [27]
La GFP sensible a redox ( roGFP ) se diseñó mediante la introducción de cisteínas en la estructura del barril beta. El estado redox de las cisteínas determina las propiedades fluorescentes de roGFP . [28]
La nomenclatura de las buenas prácticas agrarias modificadas suele ser confusa debido a la superposición de varias versiones de buenas prácticas agrarias en un solo nombre. Por ejemplo, mGFP a menudo se refiere a una GFP con una palmitoilación N-terminal que hace que la GFP se una a las membranas celulares . Sin embargo, el mismo término también se utiliza para referirse a la GFP monomérica , que a menudo se logra rompiendo la interfaz del dímero con la mutación A206K. [29] La GFP de tipo salvaje tiene una débil tendencia a la dimerización en concentraciones superiores a 5 mg/ml. mGFP también significa "GFP modificada", que se ha optimizado mediante el intercambio de aminoácidos para una expresión estable en células vegetales.
Se desconoce el propósito tanto de la bioluminiscencia (primaria) (de la acción de la aequorina sobre la luciferina) como de la fluorescencia (secundaria) de la GFP en las medusas. La GFP se coexpresa con la aequorina en pequeños gránulos alrededor del borde de la campana de la medusa. El pico de excitación secundaria (480 nm) de GFP absorbe parte de la emisión azul de la aequorina, dando a la bioluminiscencia un tono más verde. El residuo de serina 65 del cromóforo de GFP es responsable de los espectros de excitación de doble pico de GFP de tipo salvaje. Se conserva en las tres isoformas de GFP clonadas originalmente por Prasher. Casi todas las mutaciones de este residuo consolidan los espectros de excitación en un único pico a 395 nm o 480 nm. El mecanismo preciso de esta sensibilidad es complejo, pero, al parecer, implica la donación de hidrógeno de la serina 65 al glutamato 222, que influye en la ionización del cromóforo. [3] Dado que una sola mutación puede mejorar drásticamente el pico de excitación de 480 nm, lo que convierte a GFP en un socio mucho más eficiente de la aequorina, A. victoria parece preferir evolutivamente el espectro de excitación de doble pico, menos eficiente. Roger Tsien ha especulado que variar la presión hidrostática con la profundidad puede afectar la capacidad de la serina 65 para donar hidrógeno al cromóforo y cambiar la proporción de los dos picos de excitación. Así, la medusa puede cambiar el color de su bioluminiscencia con la profundidad. Sin embargo, un colapso en la población de medusas en Friday Harbor , donde se descubrió originalmente la GFP, ha dificultado estudios adicionales sobre el papel de la GFP en el entorno natural de las medusas.
Se sabe que la mayoría de las especies de lancetas producen GFP en varias regiones de su cuerpo. [30] A diferencia de A. victoria , las lancetas no producen su propia luz azul y aún se desconoce el origen de su GFP endógena . Algunos especulan que atrae plancton hacia la boca de la lanceta, sirviendo como mecanismo de caza pasivo. También puede servir como agente fotoprotector en las larvas, previniendo el daño causado por la luz azul de alta intensidad al convertirla en luz verde de menor intensidad. Sin embargo, estas teorías no han sido probadas.
Se han encontrado proteínas similares a GFP en múltiples especies de copépodos marinos , particularmente de las familias Pontellidae y Aetideidae . [31] La GFP aislada de Pontella mimocerami ha mostrado altos niveles de brillo con un rendimiento cuántico de 0,92, lo que la hace casi dos veces más brillante que la EGFP comúnmente utilizada aislada de A. victoria. [32]
Hay muchas proteínas similares a GFP que, a pesar de pertenecer a la misma familia de proteínas que GFP, no se derivan directamente de Aequorea victoria . Estos incluyen dsRed , eqFP611, Dronpa, TagRFPs, KFP, EosFP/IrisFP, Dendra, etc. Habiendo sido desarrolladas a partir de proteínas en diferentes organismos, estas proteínas a veces pueden mostrar enfoques imprevistos para la formación de cromóforos. Algunos de estos, como KFP, se desarrollan a partir de proteínas naturalmente no fluorescentes o débilmente fluorescentes y se pueden mejorar enormemente mediante mutagénesis. [33] Cuando se utilizan barriles similares a GFP con diferentes características espectrales, los espectros de excitación de un cromóforo se pueden utilizar para alimentar otro cromóforo (FRET), lo que permite la conversión entre longitudes de onda de luz. [34]
Las proteínas fluorescentes de unión a FMN (FbFP) se desarrollaron en 2007 y son una clase de proteínas fluorescentes pequeñas (11 a 16 kDa) independientes del oxígeno que se derivan de receptores de luz azul. Están destinados especialmente para su uso en condiciones anaeróbicas o hipóxicas, ya que la formación y unión del cromóforo Flavin no requiere oxígeno molecular, como es el caso de la síntesis del cromóforo GFP. [35]
Las proteínas fluorescentes con otros cromóforos, como UnaG con bilirrubina, pueden mostrar propiedades únicas como la emisión desplazada al rojo por encima de 600 nm o la fotoconversión de un estado de emisión verde a un estado de emisión rojo. Pueden tener longitudes de onda de excitación y emisión lo suficientemente separadas para lograr la conversión entre luz roja y verde.
Se evolucionó una nueva clase de proteína fluorescente a partir de una ficobiliproteína cianobacteriana ( Trichodesmium erythraeum ) , la α- aloficocianina , y se denominó proteína fluorescente ultra roja pequeña ( smURFP ) en 2016. smURFP autoincorpora autocatalíticamente el cromóforo biliverdina sin la necesidad de una proteína externa . conocido como liasa . [36] [37] Las proteínas similares a GFP derivadas de medusas y corales requieren oxígeno y producen una cantidad estequiométrica de peróxido de hidrógeno tras la formación del cromóforo . [38] smURFP no requiere oxígeno ni produce peróxido de hidrógeno y utiliza el cromóforo biliverdina . smURFP tiene un gran coeficiente de extinción (180.000 M −1 cm −1 ) y un rendimiento cuántico modesto (0,20), lo que lo hace comparable en brillo biofísico al eGFP y ~2 veces más brillante que la mayoría de las proteínas fluorescentes rojas o rojas lejanas derivadas de corales . Las propiedades espectrales de smURFP son similares a las del tinte orgánico Cy5 . [36] [39]
En las revisiones citadas se pueden encontrar reseñas sobre nuevas clases de proteínas fluorescentes y sus aplicaciones. [40] [41]
GFP tiene una estructura de barril beta que consta de once hebras β con una disposición de láminas plisadas, con una hélice alfa que contiene el cromóforo unido covalentemente 4-( p -hidroxibenciliden)imidazolidin-5-ona (HBI) que atraviesa el centro. [3] [14] [15] Cinco hélices alfa más cortas forman tapas en los extremos de la estructura. La estructura del barril beta es un cilindro casi perfecto, de 42 Å de largo y 24 Å de diámetro (algunos estudios han informado de un diámetro de 30 Å [16] ), [14] creando lo que se conoce como una formación de "lata β", que es única a la familia similar a GFP. [15] HBI, la forma modificada espontáneamente del tripéptido Ser65-Tyr66-Gly67, no es fluorescente en ausencia de la estructura de GFP plegada adecuadamente y existe principalmente en la forma de fenol no ionizado en wtGFP. [42] Las cadenas laterales del barril orientadas hacia adentro inducen reacciones de ciclación específicas en Ser65-Tyr66-Gly67 que inducen la ionización de HBI a la forma de fenolato y la formación de cromóforos . Este proceso de modificación postraduccional se denomina maduración . [43] La red de enlaces de hidrógeno y las interacciones de apilamiento de electrones con estas cadenas laterales influyen en el color, la intensidad y la fotoestabilidad de GFP y sus numerosos derivados. [44] La naturaleza compacta del cilindro excluye las moléculas de disolvente, protegiendo la fluorescencia del cromóforo para que no se apague con agua. Además de la autociclación de Ser65-Tyr66-Gly67, se produce una reacción de 1,2-deshidrogenación en el residuo Tyr66. [16] Además de los tres residuos que forman el cromóforo, residuos como Gln94, Arg96, His148, Thr203 y Glu222 actúan como estabilizadores. Los residuos de Gln94, Arg96 e His148 pueden estabilizarse deslocalizando la carga del cromóforo. Arg96 es el residuo estabilizador más importante debido al hecho de que provoca los realineamientos estructurales necesarios del anillo HBI. Cualquier mutación en el residuo Arg96 daría como resultado una disminución en la tasa de desarrollo del cromóforo porque se perderían las interacciones electrostáticas y estéricas adecuadas. Tyr66 es receptor de enlaces de hidrógeno y no se ioniza para producir electrostática favorable. [45]
Mecánicamente, el proceso implica una ciclación mediada por bases seguida de deshidratación y oxidación. En la reacción de 7a a 8 implica la formación de una enamina a partir de la imina, mientras que en la reacción de 7b a 9 se extrae un protón. [46] El fluoróforo HBI formado está resaltado en verde.
Las reacciones están catalizadas por los residuos Glu222 y Arg96. [46] [47] También es posible un mecanismo análogo con treonina en lugar de Ser65.
La proteína verde fluorescente puede usarse como gen informador . [48] [49]
Por ejemplo, la GFP se puede utilizar como indicador de los niveles de toxicidad ambiental. Se ha demostrado que esta proteína es una forma eficaz de medir los niveles de toxicidad de diversos productos químicos, incluidos etanol, p -formaldehído, fenol, triclosán y parabeno. La GFP es excelente como proteína informadora porque no tiene ningún efecto en el huésped cuando se introduce en su entorno celular. Debido a esta capacidad, no se necesitan tinciones de visualización externa, ATP ni cofactores. En cuanto a los niveles de contaminantes, se midió la fluorescencia para medir el efecto que tienen los contaminantes en la célula huésped. También se midió la densidad celular de la célula huésped. Los resultados del estudio realizado por Song, Kim y Seo (2016) mostraron que hubo una disminución tanto en la fluorescencia como en la densidad celular a medida que aumentaban los niveles de contaminantes. Esto era indicativo del hecho de que la actividad celular había disminuido. Más investigaciones sobre esta aplicación específica para determinar el mecanismo por el cual la GFP actúa como marcador de contaminantes. [50] Se han observado resultados similares en el pez cebra porque los peces cebra a los que se les inyectó GFP eran aproximadamente veinte veces más susceptibles a reconocer el estrés celular que los peces cebra a los que no se les inyectó GFP. [51]
La mayor ventaja de GFP es que puede ser heredable, dependiendo de cómo se introdujo, lo que permite un estudio continuo de las células y tejidos en los que se expresa. La visualización de GFP no es invasiva y solo requiere iluminación con luz azul. La GFP por sí sola no interfiere con los procesos biológicos, pero cuando se fusiona con proteínas de interés, se requiere un diseño cuidadoso de los conectores para mantener la función de la proteína de interés. Además, si se usa con un monómero, puede difundirse fácilmente por todas las células. [52]
La disponibilidad de GFP y sus derivados ha redefinido completamente la microscopía de fluorescencia y la forma en que se utiliza en biología celular y otras disciplinas biológicas. [53] Si bien la mayoría de las moléculas fluorescentes pequeñas como el FITC (isotiocianato de fluoresceína) son fuertemente fototóxicas cuando se usan en células vivas, las proteínas fluorescentes como la GFP suelen ser mucho menos dañinas cuando se iluminan en células vivas. Esto ha desencadenado el desarrollo de sistemas de microscopía de fluorescencia de células vivas altamente automatizados, que pueden usarse para observar células a lo largo del tiempo que expresan una o más proteínas marcadas con proteínas fluorescentes.
Existen muchas técnicas para utilizar GFP en un experimento de imágenes de células vivas. La forma más directa de utilizar GFP es unirla directamente a una proteína de interés. Por ejemplo, se puede incluir GFP en un plásmido que exprese otros genes para indicar una transfección exitosa de un gen de interés. Otro método consiste en utilizar una GFP que contenga una mutación en la que la fluorescencia cambiará de verde a amarillo con el tiempo, lo que se denomina temporizador fluorescente. Con el temporizador fluorescente, los investigadores pueden estudiar el estado de producción de proteínas, como activadas recientemente, activadas continuamente o desactivadas recientemente, según el color informado por la proteína fluorescente. [54] En otro ejemplo más, los científicos han modificado la GFP para que se active solo después de la exposición a la irradiación, lo que brinda a los investigadores una herramienta para activar selectivamente ciertas porciones de una célula y observar dónde se mueven las proteínas marcadas con la GFP desde la ubicación inicial. [55] Estos son sólo dos ejemplos en un campo floreciente de la microcopia fluorescente y aquí se puede encontrar una revisión más completa de los biosensores que utilizan GFP y otras proteínas fluorescentes [56]
Por ejemplo, la GFP se ha utilizado ampliamente para marcar los espermatozoides de diversos organismos con fines de identificación, como en Drosophila melanogaster , donde la expresión de GFP se puede utilizar como marcador de una característica particular. La GFP también se puede expresar en diferentes estructuras que permiten la distinción morfológica. En tales casos, el gen para la producción de GFP se incorpora al genoma del organismo en la región del ADN que codifica las proteínas diana y que está controlada por la misma secuencia reguladora ; es decir, la secuencia reguladora del gen ahora controla la producción de GFP, además de las proteínas marcadas. En las células donde se expresa el gen y se producen las proteínas marcadas, se produce GFP al mismo tiempo. Por lo tanto, sólo aquellas células en las que se expresa el gen marcado, o en las que se producen las proteínas diana, emitirán fluorescencia cuando se observen bajo microscopía de fluorescencia. El análisis de este tipo de películas secuenciales ha redefinido la comprensión de muchos procesos biológicos, incluido el plegamiento de proteínas, el transporte de proteínas y la dinámica del ARN, que en el pasado se habían estudiado utilizando material fijo (es decir, muerto). Los datos obtenidos también se utilizan para calibrar modelos matemáticos de sistemas intracelulares y estimar tasas de expresión genética. [57] De manera similar, las buenas prácticas agrarias se pueden utilizar como indicador de la expresión de proteínas en sistemas heterólogos. En este escenario, las proteínas de fusión que contienen GFP se introducen indirectamente, utilizando el ARN de la construcción, o directamente, con la propia proteína marcada. Este método es útil para estudiar las características estructurales y funcionales de la proteína marcada a escala macromolecular o de una sola molécula con microscopía de fluorescencia.
El microscopio Vertico SMI que utiliza la tecnología SPDM Phymod utiliza el llamado efecto de "fotoblanqueo reversible" de tintes fluorescentes como GFP y sus derivados para localizarlos como moléculas individuales en una resolución óptica de 10 nm. Esto también se puede realizar como una colocalización de dos derivados de GFP (2CLM). [58]
Otro uso poderoso de GFP es expresar la proteína en pequeños conjuntos de células específicas. Esto permite a los investigadores detectar ópticamente tipos específicos de células in vitro (en un plato) o incluso in vivo (en el organismo vivo). [59] La combinación genética de varias variantes espectrales de GFP es un truco útil para el análisis de los circuitos cerebrales ( Brainbow ). [60] Otros usos interesantes de las proteínas fluorescentes en la literatura incluyen el uso de FP como sensores del potencial de membrana de las neuronas , [61] el seguimiento de los receptores AMPA en las membranas celulares, [62] la entrada viral y la infección de virus de influenza individuales y virus lentivirales, [ 63] [64] etc.
También se ha descubierto que nuevas líneas de ratas transgénicas GFP pueden ser relevantes para la terapia genética y la medicina regenerativa. [65] Al utilizar GFP de "alta expresión", las ratas transgénicas muestran una alta expresión en la mayoría de los tejidos y muchas células que no se han caracterizado o se han caracterizado mal en ratas transgénicas GFP anteriores.
Se ha demostrado que la GFP es útil en criobiología como ensayo de viabilidad . La correlación de la viabilidad medida mediante ensayos de azul tripano fue de 0,97. [66] Otra aplicación es el uso de la cotransfección con GFP como control interno para la eficiencia de la transfección en células de mamíferos. [67]
Un posible uso novedoso de GFP incluye su uso como monitor sensible de procesos intracelulares a través de un sistema láser eGFP elaborado a partir de una línea celular de riñón embrionario humano. El primer láser vivo diseñado está formado por una célula que expresa eGFP dentro de una cavidad óptica reflectante y la golpea con pulsos de luz azul. En un cierto umbral de pulso, la salida óptica del eGFP se vuelve más brillante y completamente uniforme en color verde puro con una longitud de onda de 516 nm. Antes de emitirse como luz láser, la luz rebota hacia adelante y hacia atrás dentro de la cavidad del resonador y pasa por la celda numerosas veces. Al estudiar los cambios en la actividad óptica, los investigadores pueden comprender mejor los procesos celulares. [68] [69]
La GFP se utiliza ampliamente en la investigación del cáncer para etiquetar y rastrear células cancerosas. Se han utilizado células cancerosas marcadas con GFP para modelar la metástasis, el proceso mediante el cual las células cancerosas se propagan a órganos distantes. [70]
GFP se puede utilizar para analizar la colocalización de proteínas. Esto se logra "dividiendo" la proteína en dos fragmentos que sean capaces de autoensamblarse y luego fusionando cada uno de ellos con las dos proteínas de interés. Por sí solos, estos fragmentos incompletos de GFP no pueden emitir fluorescencia. Sin embargo, si las dos proteínas de interés se colocalizan, entonces los dos fragmentos de GFP se ensamblan para formar una estructura similar a GFP que es capaz de emitir fluorescencia. Por tanto, midiendo el nivel de fluorescencia es posible determinar si las dos proteínas de interés se colocalizan. [71]
Los procesos biológicos a macroescala, como la propagación de infecciones virales, se pueden seguir mediante el etiquetado GFP. [72] En el pasado, la luz ultravioleta (UV) mutagénica se ha utilizado para iluminar organismos vivos (por ejemplo, ver [73] ) para detectar y fotografiar la expresión de GFP. Recientemente, se ha desarrollado una técnica que utiliza luces LED no mutagénicas [74] para macrofotografía. [75] La técnica utiliza un accesorio de cámara de epifluorescencia [76] basado en el mismo principio utilizado en la construcción de microscopios de epifluorescencia .
Alba , un conejo verde fluorescente, fue creado por un laboratorio francés encargado por Eduardo Kac utilizando GFP con fines artísticos y de comentario social. [77] La empresa estadounidense Yorktown Technologies comercializa en tiendas de acuarios peces cebra verdes fluorescentes ( GloFish ), que fueron desarrollados inicialmente para detectar la contaminación en las vías fluviales. NeonPets, una empresa con sede en EE. UU., ha comercializado ratones fluorescentes verdes en la industria de las mascotas como NeonMice. [78] Los cerdos verdes fluorescentes, conocidos como Noels, fueron criados por un grupo de investigadores dirigidos por Wu Shinn-Chih en el Departamento de Ciencia y Tecnología Animal de la Universidad Nacional de Taiwán . [79] Un equipo japonés-estadounidense creó gatos verde fluorescente como prueba de concepto para usarlos potencialmente como organismos modelo para enfermedades, particularmente el VIH . [80] En 2009, un equipo surcoreano de la Universidad Nacional de Seúl crió los primeros beagles transgénicos con células de fibroblastos de anémonas de mar. Los perros emiten una luz fluorescente roja y están destinados a permitir a los científicos estudiar los genes que causan enfermedades humanas como la narcolepsia y la ceguera. [81]
Julian Voss-Andreae , un artista nacido en Alemania especializado en "esculturas de proteínas", [82] creó esculturas basadas en la estructura de GFP, incluida la "Proteína verde fluorescente" de 1,70 m (5'6") de altura (2004) [83 ] y "Steel Jellyfish" de 1,40 m (4'7") de altura (2006). Esta última escultura está ubicada en el lugar donde Shimomura descubrió el GFP en 1962, los Friday Harbor Laboratories de la Universidad de Washington . [84]
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