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Indicador de voltaje codificado genéticamente

El indicador de voltaje codificado genéticamente (o GEVI ) es una proteína que puede detectar el potencial de membrana en una célula y relacionar el cambio de voltaje con una forma de salida, a menudo a nivel de fluorescencia . [1] Es una herramienta de registro optogenético prometedora que permite exportar señales electrofisiológicas de células cultivadas, animales vivos y, en última instancia, cerebro humano. Algunos ejemplos de GEVI notables incluyen ArcLight, [2] ASAP1, [3] ASAP3, [4] Archons, [5] SomArchon, [6] y Ace2N-mNeon. [7]

Historia

A pesar de que la idea de la medición óptica de la actividad neuronal se propuso a finales de los años 1960, [8] el primer GEVI exitoso que era lo suficientemente conveniente para ponerlo en uso real no se desarrolló hasta que las tecnologías de ingeniería genética habían madurado a finales de los años 1990. El primer GEVI, llamado FlaSh, [9] se construyó fusionando una proteína fluorescente verde modificada con un canal de K + sensible al voltaje ( Shaker ). A diferencia de las proteínas fluorescentes, el descubrimiento de nuevos GEVI rara vez estuvo inspirado por la naturaleza, ya que es difícil encontrar un organismo que naturalmente tenga la capacidad de cambiar su fluorescencia en función del voltaje. Por lo tanto, los nuevos GEVI son en su mayoría productos de la ingeniería genética y proteica.

Se pueden utilizar dos métodos para encontrar nuevas variantes de GEVI: el diseño racional y la evolución dirigida . El primer método contribuye a la mayoría de las nuevas variantes de GEVI, pero las investigaciones recientes que utilizan la evolución dirigida han mostrado resultados prometedores en la optimización de GEVI. [10] [11]

Estructura

La GEVI puede tener muchos diseños de configuración para realizar la función de detección de voltaje. [12] Una característica esencial de la estructura de la GEVI es que debe estar situada en la membrana celular. Conceptualmente, la estructura de una GEVI debería permitir la función de detección de la diferencia de voltaje y reportarla mediante un cambio en la fluorescencia. Por lo general, el dominio de detección de voltaje (VSD) de una GEVI se extiende a través de la membrana y está conectado a la(s) proteína(s) fluorescente(s). Sin embargo, no es necesario que la detección y el reporte ocurran en diferentes estructuras, por ejemplo, Archons.

Por estructura, las GEVI se pueden clasificar en cuatro categorías según los hallazgos actuales: (1) Las GEVI contienen un par de proteínas fluorescentes FRET, p. ej., VSFP1, (2) GEVI de opsina simple, p. ej., Arch, (3) GEVI de par FRET de opsina-FP, p. ej., MacQ-mCitrine, (4) FP simple con tipos especiales de dominios de detección de voltaje, p. ej., ASAP1. La mayoría de las GEVI se basan en la fosfatasa sensible al voltaje de Ciona intestinalis (Ci-VSP o Ci-VSD (dominio)), que se descubrió en 2005 a partir del estudio genómico del organismo. [13] Algunas GEVI pueden tener componentes similares, pero con diferente posicionamiento de ellos. Por ejemplo, ASAP1 y ArcLight utilizan un VSD y un FP, pero el FP de ASAP1 está en el exterior de la celda mientras que el de ArcLight está en el interior, y los dos FP de VSFP-Butterfly están separados por el VSD, mientras que los dos FP de Mermaid están relativamente cerca uno del otro.

  1. ↑Los nombres en cursiva indican GEVI que no están nombrados.

Características

Un GEVI puede evaluarse por sus muchas características. Estos rasgos pueden clasificarse en dos categorías: rendimiento y compatibilidad. Las propiedades de rendimiento incluyen brillo, fotoestabilidad , sensibilidad, cinética (velocidad), linealidad de respuesta, etc., mientras que las propiedades de compatibilidad cubren toxicidad ( fototoxicidad ), localización de membrana plasmática, adaptabilidad de imágenes de tejido profundo, etc. [43] Por ahora, ningún GEVI existente cumple con todas las propiedades deseadas, por lo que la búsqueda de un GEVI perfecto sigue siendo un área de investigación bastante competitiva.

Aplicaciones y ventajas

Se están desarrollando diferentes tipos de GEVI en muchas áreas de investigación biológica o fisiológica. Se cree que es superior a los métodos de detección de voltaje convencionales, como los registros electrofisiológicos basados ​​en electrodos , las imágenes de calcio o los tintes sensibles al voltaje . Tiene una resolución espacial subcelular [44] y una resolución temporal tan baja como 0,2 milisegundos, aproximadamente un orden de magnitud más rápido que las imágenes de calcio. Esto permite una fidelidad de detección de picos comparable a la electrofisiología basada en electrodos, pero sin la invasividad. [33] Los investigadores lo han utilizado para sondear las comunicaciones neuronales de un cerebro intacto (de Drosophila [45] o ratón [46] ), los picos eléctricos de bacterias ( E. coli [22] ) y los cardiomiocito derivados de células madre humanas . [47] [48]

Direcciones futuras

En cuanto al desarrollo de GEVI, su dirección futura está muy relacionada con las aplicaciones a las que se dirige. A medida que las nuevas generaciones de GEVI superen el bajo rendimiento de las de primera generación, veremos que se abren más caminos para que los GEVI se utilicen en aplicaciones más desafiantes y versátiles. Al igual que muchos otros biosensores y actuadores de proteínas, una vez que pase el umbral inicial de practicidad, habrá más intentos de remodelar la herramienta para su uso en diferentes aplicaciones de destino, cada una con un énfasis y un requisito diferentes para un subconjunto de métricas de rendimiento. Por ejemplo, los autores de JEDI-2P afirmaron que el sensor de dirección negativa (de brillante a tenue) es bueno para detectar despolarizaciones e hiperpolarizaciones subumbral, pero los sensores de dirección positiva (de tenue a brillante) podrían ser mejores para la detección de picos. [42] Podemos argumentar que se necesita esfuerzo para diseñar (evaluar) un sensor perfecto, pero a menudo la razón más convincente es que simplemente no existe una definición unánime de tal perfección. Por ejemplo, los científicos podrían preferir sensores con diferentes colores de emisión y excitación para que sean compatibles espectralmente con otros actuadores optogenéticos . Recientemente, para compensar la baja relación señal-ruido (SNR) debido al bajo brillo de GEVI, se han aplicado varios métodos de eliminación de ruido para aumentar la SNR.

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