La citogenética es esencialmente una rama de la genética , pero también es parte de la biología celular/citología (una subdivisión de la anatomía humana), que se ocupa de cómo los cromosomas se relacionan con el comportamiento celular, particularmente con su comportamiento durante la mitosis y la meiosis . [1] Las técnicas utilizadas incluyen cariotipo , análisis de cromosomas con bandas G , otras técnicas de bandas citogenéticas, así como citogenética molecular como la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la hibridación genómica comparada (CGH).
Los cromosomas fueron observados por primera vez en células vegetales por Carl Nägeli en 1842. Su comportamiento en células animales ( salamandra ) fue descrito por Walther Flemming , el descubridor de la mitosis , en 1882. El nombre fue acuñado por otro anatomista alemán, von Waldeyer en 1888.
La siguiente etapa tuvo lugar tras el desarrollo de la genética a principios del siglo XX, cuando se apreció que el conjunto de cromosomas (el cariotipo ) era el portador de los genes. Levitsky parece haber sido el primero en definir el cariotipo como la apariencia fenotípica de los cromosomas somáticos , en contraste con su contenido genético . [2] [3] La investigación sobre el cariotipo humano llevó muchos años para resolver la pregunta más básica: ¿cuántos cromosomas contiene una célula humana diploide normal? [4] En 1912, Hans von Winiwarter informó 47 cromosomas en las espermatogonias y 48 en las oogonias , concluyendo un mecanismo de determinación del sexo XX/XO . [5] En 1922, Painter no estaba seguro de si el número diploide de humanos era 46 o 48, al principio favorecía 46. [6] Posteriormente revisó su opinión de 46 a 48, e insistió correctamente en que los humanos tenían un sistema XX/XY. de determinación del sexo. [7] Teniendo en cuenta sus técnicas, estos resultados fueron bastante notables. En los libros de ciencia, el número de cromosomas humanos se mantuvo en 48 durante más de treinta años. Se necesitaban nuevas técnicas para corregir este error. Joe Hin Tjio , que trabaja en el laboratorio de Albert Levan [8] [9], fue el responsable de encontrar el enfoque:
Hubo que esperar hasta 1956 para que se aceptara generalmente que el cariotipo del hombre incluía sólo 46 cromosomas. [10] [11] [12] Los grandes simios tienen 48 cromosomas. El cromosoma 2 humano se formó mediante la fusión de cromosomas ancestrales, lo que redujo su número. [13]
Barbara McClintock comenzó su carrera como citogenetista del maíz . En 1931, McClintock y Harriet Creighton demostraron que la recombinación citológica de cromosomas marcados se correlacionaba con la recombinación de rasgos genéticos ( genes ). McClintock, mientras estuvo en la Carnegie Institution , continuó estudios previos sobre los mecanismos de rotura cromosómica y fusión de los cromosomas en el maíz. Identificó un evento particular de rotura cromosómica que siempre ocurría en el mismo locus del cromosoma 9 del maíz, al que denominó " Ds" o locus de "disociación". [14] McClintock continuó su carrera en citogenética estudiando la mecánica y la herencia de los cromosomas rotos y en anillo (circulares) del maíz. Durante su trabajo citogenético, McClintock descubrió los transposones , un hallazgo que finalmente le valió el Premio Nobel en 1983.
En la década de 1930, Dobzhansky y sus colaboradores recolectaron Drosophila pseudoobscura y D. persimilis de poblaciones silvestres en California y estados vecinos. Utilizando la técnica de Painter [15] estudiaron los cromosomas politenos y descubrieron que las poblaciones salvajes eran polimórficas para las inversiones cromosómicas . Todas las moscas se parecen, independientemente de las inversiones que lleven: este es un ejemplo de polimorfismo críptico.
Rápidamente se acumuló evidencia que demostraba que la selección natural era la responsable. Utilizando un método inventado por L'Héritier y Teissier, Dobzhansky crió poblaciones en jaulas de población , lo que permitió la alimentación, la reproducción y el muestreo evitando al mismo tiempo el escape. Esto tuvo el beneficio de eliminar la migración como posible explicación de los resultados. Las acciones que contienen inversiones con una frecuencia inicial conocida se pueden mantener en condiciones controladas. Se descubrió que los distintos tipos de cromosomas no fluctúan al azar, como lo harían si fueran selectivamente neutrales, sino que se ajustan a determinadas frecuencias en las que se estabilizan. Cuando Dobzhansky publicó la tercera edición de su libro en 1951 [16], estaba convencido de que las formas cromosómicas se mantenían en la población gracias a la ventaja selectiva de los heterocigotos, como ocurre con la mayoría de los polimorfismos . [17] [18]
El lirio es un organismo favorito para el examen citológico de la meiosis ya que los cromosomas son grandes y cada etapa morfológica de la meiosis se puede identificar fácilmente microscópicamente. Hotta, Chandley et al. [19] presentaron evidencia de un patrón común de síntesis de corte y reparación de ADN en células meióticas masculinas de lirios y roedores durante las etapas de meiosis cigoteno-paquiteno cuando se presumía que ocurría el entrecruzamiento. La presencia de un patrón común entre organismos tan filogenéticamente distantes como el lirio y el ratón llevó a los autores a concluir que la organización del cruce meiótico en al menos eucariotas superiores probablemente tenga una distribución universal.
Tras la llegada de procedimientos que permitieron una fácil enumeración de cromosomas, rápidamente se hicieron descubrimientos relacionados con cromosomas aberrantes o número de cromosomas.
Citogenética constitucional: En algunos trastornos congénitos, como el síndrome de Down , la citogenética reveló la naturaleza del defecto cromosómico: una trisomía "simple". Las anomalías que surgen de eventos de no disyunción pueden causar células con aneuploidía (adiciones o eliminaciones de cromosomas completos) en uno de los padres o en el feto. En 1959, Lejeune [20] descubrió que los pacientes con síndrome de Down tenían una copia extra del cromosoma 21. El síndrome de Down también se conoce como trisomía 21.
Otras anomalías numéricas descubiertas incluyen anomalías de los cromosomas sexuales. Una mujer con un solo cromosoma X tiene el síndrome de Turner , mientras que un hombre con un cromosoma X adicional, lo que da como resultado 47 cromosomas en total, tiene el síndrome de Klinefelter . Muchas otras combinaciones de cromosomas sexuales son compatibles con los nacidos vivos, incluidas XXX , XYY y XXXX. La capacidad de los mamíferos para tolerar aneuploidías en los cromosomas sexuales surge de la capacidad de inactivarlos , algo que se requiere en las hembras normales para compensar el hecho de tener dos copias del cromosoma. No todos los genes del cromosoma X están inactivados, por lo que se observa un efecto fenotípico en individuos con cromosomas X adicionales.
La trisomía 13 se asoció con el síndrome de Patau y la trisomía 18 con el síndrome de Edwards .
Citogenética adquirida: en 1960, Peter Nowell y David Hungerford [21] descubrieron un pequeño cromosoma en los glóbulos blancos de pacientes con leucemia mielógena crónica (LMC). Este cromosoma anormal fue denominado cromosoma Filadelfia , ya que ambos científicos estaban realizando su investigación en Filadelfia, Pensilvania . Trece años más tarde, con el desarrollo de técnicas más avanzadas, Janet Rowley demostró que el cromosoma anormal era el resultado de una translocación de los cromosomas 9 y 22. La identificación del cromosoma Filadelfia mediante citogenética es diagnóstica de leucemia mieloide crónica. Más de 780 leucemias y cientos de tumores sólidos (pulmón, próstata, riñón, etc.) se caracterizan actualmente por una anomalía cromosómica adquirida, cuyo valor pronóstico es crucial. La identificación de estas anomalías cromosómicas ha llevado al descubrimiento de un gran número de "genes cancerosos" (u oncogenes ). El creciente conocimiento de estos genes del cáncer permite ahora el desarrollo de terapias dirigidas , lo que transforma las perspectivas de supervivencia de los pacientes. Así, la citogenética ha tenido y sigue teniendo un papel esencial en el progreso del conocimiento del cáncer. Las grandes bases de datos ( Atlas de Genética y Citogenética en Oncología y Hematología , base de datos sobre cáncer COSMIC , Base de datos Mitelman de aberraciones cromosómicas y fusiones de genes en cáncer ) permiten a investigadores y médicos disponer del corpus necesario para su trabajo en este campo.
A finales de la década de 1960, Torbjörn Caspersson desarrolló una técnica de tinción fluorescente con quinacrina (bandas Q) que reveló patrones de bandas únicos para cada par de cromosomas. Esto permitió diferenciar pares de cromosomas de igual tamaño mediante distintos patrones de bandas horizontales. Los patrones de bandas se utilizan ahora para dilucidar los puntos de ruptura y los cromosomas constituyentes implicados en las translocaciones cromosómicas . Las eliminaciones e inversiones dentro de un cromosoma individual también se pueden identificar y describir con mayor precisión utilizando una nomenclatura de bandas estandarizada. Las bandas G (que utilizan tripsina y tinción de Giemsa/Wright) se desarrollaron simultáneamente a principios de la década de 1970 y permiten la visualización de patrones de bandas utilizando un microscopio de campo brillante.
Los diagramas que identifican los cromosomas basándose en los patrones de bandas se conocen como idiogramas . Estos mapas se convirtieron en la base para que los campos prenatal y oncológico trasladaran rápidamente la citogenética al laboratorio clínico, donde el cariotipo permitió a los científicos buscar alteraciones cromosómicas. Las técnicas se ampliaron para permitir el cultivo de amniocitos libres recuperados del líquido amniótico y técnicas de elongación para todos los tipos de cultivo que permiten bandas de mayor resolución.
En la década de 1980 se produjeron avances en la citogenética molecular . Si bien las sondas marcadas con radioisótopos se habían hibridado con ADN desde 1969, ahora se estaba avanzando en el uso de sondas marcadas con fluorescencia. Su hibridación con preparaciones cromosómicas utilizando técnicas existentes llegó a conocerse como hibridación fluorescente in situ (FISH). [22] Este cambio aumentó significativamente el uso de técnicas de sondeo, ya que las sondas marcadas con fluorescencia son más seguras. Otros avances en la micromanipulación y el examen de los cromosomas condujeron a la técnica de la microdisección cromosómica mediante la cual las aberraciones en la estructura cromosómica podían aislarse, clonarse y estudiarse con mayor detalle.
El análisis cromosómico de rutina ( cariotipo ) se refiere al análisis de cromosomas en metafase que han sido bandeados usando tripsina seguido de Giemsa , Leishmann o una mezcla de ambos. Esto crea patrones de bandas únicos en los cromosomas. Se desconocen el mecanismo molecular y la razón de estos patrones, aunque probablemente esté relacionado con el tiempo de replicación y el empaquetamiento de la cromatina.
En los laboratorios de citogenética se utilizan varias técnicas de bandas de cromosomas. Las bandas de quinacrina (bandas Q) fueron el primer método de tinción utilizado para producir patrones de bandas específicos. Este método requiere un microscopio de fluorescencia y ya no se usa tan ampliamente como las bandas de Giemsa (bandas G). Las bandas inversas, o bandas R, requieren tratamiento térmico e invierten el patrón habitual en blanco y negro que se ve en las bandas G y Q. Este método es particularmente útil para teñir los extremos distales de los cromosomas. Otras técnicas de tinción incluyen tinciones de bandas C y de la región organizadora nucleolar (tinciones NOR). Estos últimos métodos tiñen específicamente ciertas porciones del cromosoma. Las bandas C tiñen la heterocromatina constitutiva , que generalmente se encuentra cerca del centrómero, y la tinción NOR resalta los satélites y los tallos de los cromosomas acrocéntricos .
Las bandas de alta resolución implican la tinción de los cromosomas durante la profase o la metafase temprana (prometafase), antes de que alcancen su máxima condensación. Debido a que los cromosomas en profase y prometafase están más extendidos que los cromosomas en metafase, el número de bandas observables para todos los cromosomas ( bandas por conjunto haploide , bph; "nivel de banda") aumenta de aproximadamente 300 a 450 hasta 800. Esto permite la detección de anomalías menos obvias que generalmente no se observan con las bandas convencionales. [23]
Las células de la médula ósea , la sangre, el líquido amniótico, la sangre del cordón umbilical , los tumores y los tejidos (incluidos la piel, el cordón umbilical , las vellosidades coriónicas, el hígado y muchos otros órganos) se pueden cultivar utilizando técnicas de cultivo celular estándar para aumentar su número. Luego se añade al cultivo un inhibidor mitótico ( colchicina , colcemid ). Esto detiene la división celular en la mitosis , lo que permite un mayor rendimiento de células mitóticas para el análisis. Luego se centrifugan las células y se eliminan el medio y el inhibidor mitótico y se reemplazan con una solución hipotónica. Esto hace que los glóbulos blancos o los fibroblastos se hinchen, de modo que los cromosomas se diseminen cuando se agregan a un portaobjetos y también lisan los glóbulos rojos. Después de dejar reposar las células en una solución hipotónica, se añade fijador de Carnoy (3:1 de metanol a ácido acético glacial ). Esto mata las células y endurece los núcleos de los glóbulos blancos restantes. Las células generalmente se fijan repetidamente para eliminar los restos o los glóbulos rojos restantes. Luego, la suspensión celular se deja caer sobre portaobjetos de muestras. Después de envejecer los portaobjetos en un horno o esperar unos días, están listos para el bandeo y el análisis.
El análisis de los cromosomas en bandas lo realiza un laboratorio clínico especialista en citogenética (CLSp(CG)) con un microscopio . Generalmente se analizan 20 células lo que es suficiente para descartar mosaicismo a un nivel aceptable. Los resultados se resumen y se entregan a un citogenetista certificado para que los revise y escriba una interpretación teniendo en cuenta la historia previa del paciente y otros hallazgos clínicos. Los resultados luego se publican en el Sistema Internacional de Nomenclatura Citogenética Humana de 2009 (ISCN2009).
La hibridación fluorescente in situ (FISH) se refiere al uso de una sonda marcada con fluorescencia para hibridar con preparaciones de células citogenéticas.
Además de los preparados estándar, el FISH también se puede realizar en:
Esta sección se refiere a la preparación de preparados citogenéticos estándar.
El portaobjetos se envejece utilizando una solución salina que normalmente consiste en 2X SSC (sal, citrato de sodio). A continuación, los portaobjetos se deshidratan en etanol y se añade la mezcla de sondas. Luego, la muestra de ADN y la sonda de ADN se codesnaturalizan utilizando una placa calentada y se dejan volver a hibridar durante al menos 4 horas. Luego se lavan los portaobjetos para eliminar el exceso de sonda no unida y se contratiñen con 4',6-diamidino-2-fenilindol ( DAPI ) o yoduro de propidio.
El análisis de las muestras de FISH lo realiza un laboratorio clínico especialista en citogenética mediante microscopía de fluorescencia . Para oncología, generalmente, se puntúa una gran cantidad de células en interfase para descartar enfermedad residual de bajo nivel; generalmente se cuentan y puntúan entre 200 y 1000 células. Para problemas congénitos normalmente se puntúan 20 células en metafase.
Los avances ahora se centran en la citogenética molecular , incluidos sistemas automatizados para contar los resultados de preparaciones FISH estándar y técnicas para cariotipo virtual , como matrices de hibridación genómica comparativa, CGH y matrices de polimorfismo de un solo nucleótido .