Beggiatoa es un género de Gammaproteobacteria perteneciente al orden Thiotrichales , en el filo Pseudomonadota . Estas bacterias forman filamentos incoloros compuestos por células que pueden tener hasta 200 μm de diámetro, y son uno de los procariotas más grandes de la Tierra. [3] Beggiatoa son oxidadores de azufre quimiolitotróficos , que utilizan especies de azufre reducido como fuente de energía. Viven en ambientes ricos en azufre como el suelo, tanto marino como de agua dulce, en los respiraderos hidrotermales de aguas profundas y en ambientes marinos contaminados. En asociación con otras bacterias del azufre, por ejemplo Thiothrix , pueden formar biopelículas que son visibles a simple vista como esteras de filamentos blancos largos; el color blanco se debe a los glóbulos de azufre almacenados dentro de las células.
Beggiatoa fue descrita originalmente como un tipo de alga verdeazulada (hoy conocida como Cyanobacteria ) por el botánico Vittore Trevisan en 1842, quien la bautizó en honor al médico y botánico italiano Francesco Secondo Beggiato (1806 - 1883), de Venecia. [4] Más tarde, se demostró que Beggiatoa en su hábitat natural de manantiales de azufre acumula glóbulos de azufre en sus células. El microbiólogo ucraniano Sergei Winogradsky , trabajando en el laboratorio de Anton de Bary , demostró que estos glóbulos de azufre intracelulares se formaban cuando Beggiatoa oxidaba sulfuro de hidrógeno (H2S ) como fuente de energía, con oxígeno como aceptor terminal de electrones y CO2 utilizado como fuente de carbono. [5] Winogradsky se refirió a esta forma de metabolismo como "inorgoxidación" (oxidación de compuestos inorgánicos), hoy llamada quimiolitotrofia . El hallazgo representó el primer descubrimiento de la litotrofia . [6] [7]
El género Beggiatoa es diverso, con representantes que ocupan varios hábitats y nichos, tanto en agua dulce como salada. En el pasado, se los ha confundido con parientes cercanos de Oscillatoria spp. (filo Cyanobacteria ) porque tienen morfología y motilidad similares, [8] pero el análisis de ARNr 5S mostró que los miembros de Beggiatoa son filogenéticamente distantes de Cyanobacteria, y en cambio son miembros del filo Gammaproteobacteria . [9]
A pesar de su diversidad, solo se han descrito formalmente dos especies de Beggiatoa : las especies tipo Beggiatoa alba y Beggiatoa leptomitoformis , la última de las cuales se publicó recién en 2017. [2] [10]
La capacidad de oxidar sulfuro y almacenar azufre son las principales características que definen a Beggiatoa y su pariente cercano Thioploca como bacterias filamentosas incoloras de azufre, en contraste con otras bacterias filamentosas como las cianobacterias y las Cytophaga y Flexibacter que no oxidan azufre . [11] Otra característica definitoria es la capacidad de almacenar nitrato dentro de las vacuolas de las células de las especies marinas anchas. Los estudios basados en secuencias de ARNr 16S infirieron que esta característica es compartida entre los miembros de un clado monofilético anidado en los géneros Beggiatoa ; este clado también incluye miembros de Thioploca y Thiomargarita , ambos presentando solo ligeras diferencias con Beggiatoas: mientras que el primero crece compartiendo una vaina limosa común, el segundo no ha conservado el crecimiento filamentoso y forma cadenas de células redondeadas. Dado que la historia filogenética no refleja la nomenclatura, existe la necesidad de una nueva denominación de géneros y especies . [12] La cepa Neo-tipo es la B18LB y estableció los criterios para la identificación de la especie de agua dulce Beggiatoa alba . [13]
Debido a la falta de un cultivo puro , se sabe poco sobre la genética de Beggiatoa . Beggiatoa alba tiene un contenido de GC entre 40 y 42,7 mol%, dos o tres plásmidos similares y un tamaño de genoma de aproximadamente 3 Megabase (Mbp) (cepa B18LD). [3] En un estudio sobre secuencias del genoma de Beggiatoa obtenidas de dos filamentos individuales de una cepa vacuolada, el mapeo óptico mostró que el tamaño del genoma era de aproximadamente 7,4 Mbp; se detectaron vías para la oxidación de azufre, la respiración de nitrato y oxígeno y la fijación de CO 2 , lo que confirma su fisiología quimiolitoautotrófica . Además, la genómica comparativa indicó transferencia horizontal de genes entre Beggiatoa y Cyanobacteria de capacidades de almacenamiento, metabólicas y de deslizamiento. [14]
Beggiatoa spp. se puede dividir en tres categorías morfológicas [15] (con algunas excepciones):
Los filamentos estrechos suelen estar compuestos por células cilíndricas cuya longitud es de aproximadamente 1,5 a 8 veces su grosor; en los filamentos más anchos, las células tienen forma de disco con longitudes celulares de 0,10 a 0,90 veces su ancho celular. En todas las cepas cultivadas, las células terminales de los filamentos aparecen redondeadas. [15]
Aunque son bacterias Gram-negativas , Beggiatoa muestra una organización inusual de la pared celular y la membrana . A veces hay una cantidad variable de membranas adicionales que cubren la capa de peptidoglicano . Su presencia puede deberse a las duras condiciones en las que viven algunos de estos organismos. Los gránulos intracelulares también pueden estar cubiertos por estructuras membranosas. Además de los gránulos de azufre, las células de Beggiatoa a menudo contienen gránulos de polihidroxibutirato y polifosfato . Los Beggiatoa vacuolados marinos grandes comúnmente tienen células con un citoplasma estrecho que rodea una gran vacuola central utilizada para almacenar nitrato. [5] [15]
Beggiatoa se mueve a través de la motilidad de deslizamiento , utilizando la excreción de moco. [16] Los mecanismos exactos de esta motilidad de deslizamiento son desconocidos. [17] En la especie Beggiatoa alba , este rastro de moco está compuesto de manosa y glucosa, dos tipos de polisacáridos neutros. Se han observado estructuras similares a cuerdas en la membrana externa y canales de transpeptidoglicano en la capa superficial, que también pueden desempeñar un papel. [15] [17] La motilidad de deslizamiento de Beggiatoa se induce a través de la quimiotaxis , que permite que los filamentos se alejen de los altos niveles de oxígeno, sulfuro y luz. [15] Los filamentos de Beggiatoa invierten su dirección de deslizamiento para alcanzar condiciones más adecuadas para su metabolismo. Los filamentos largos que se mueven en direcciones opuestas pueden dividirse en dos al matar una célula intermedia, denominada necrida, que luego corta la comunicación y el movimiento coordinado entre los dos segmentos. [15]
Los beggiatoa utilizan la fragmentación como estrategia reproductiva. Una colonia puede convertirse en una estera mediante la alternancia de elongación y rotura de filamentos. La rotura puede ocurrir en el medio de un filamento estirado, en la punta de un bucle de filamento o donde antes estaba colocada la punta de un bucle. Las células sacrificiales interrumpen la comunicación entre dos partes de un filamento; de esta manera, cada sección puede cambiar su dirección de deslizamiento y provocar la división. [ cita requerida ]
La longitud media de los filamentos que se consigue mediante este proceso también es resultado de interacciones entre genes y ambiente, ya que, por ejemplo, el crecimiento y la posición de los filamentos son función de gradientes verticales de oxígeno y sulfuro. Por lo tanto, se propone que las buenas condiciones ambientales provocarán, paradójicamente, la muerte celular para favorecer la rotura de los filamentos y, por lo tanto, la reproducción. [18]
El grupo Beggiatoa está compuesto principalmente por bacterias quimiolitotróficas , oxidantes de sulfuro. Sin embargo, el rango de posibles vías metabólicas es muy diverso, y varía desde la heterotrofia hasta la quimiolitoautotrofia . Debido a esta enorme variabilidad, las diversas bacterias de este género pueden diferir mucho entre sí. [15]
En el grupo Beggiatoa están presentes tanto metabolismos autótrofos como heterotróficos . Los Beggiatoa autótrofos llevan a cabo la fijación de CO2 a través del ciclo de Calvin y el empleo de la enzima RuBisCO . Esta última muestra diferentes niveles de regulación en autótrofos obligados y facultativos. Por ejemplo, en la cepa autótrofa obligada MS-81-1c RuBisCO no puede ser reprimida, mientras que en la cepa autótrofa facultativamente MS-81-6 está estrechamente regulada para cambiar de crecimiento autótrofo a heterotrófico y viceversa. Además de las cepas autótrofas, la mayoría de las cepas de Beggiatoa de agua dulce son heterotróficas, requiriendo sustratos orgánicos para su crecimiento. Específicamente, muchas de ellas pueden considerarse mixótrofas , porque crecen heterotróficamente, oxidando compuestos orgánicos, pero también pueden usar sulfuro u otros compuestos de azufre reducido como donantes de electrones. Mediante esta estrategia, los esqueletos de carbono orgánico se ahorran con el propósito de aumentar la biomasa y no se requiere la fijación autótrofa de CO2 . Se ha sospechado que la mixotrofia es la modalidad trófica de muchas cepas de agua dulce, pero solo se ha encontrado en una cepa marina de Beggiatoa , MS-81-6. [15] También se ha revelado una vía metabólica de utilización de compuestos C-1 en la cepa D-402 de Beggiatoa leptomitoformis, a través de un análisis exhaustivo de su genómica, bioquímica, fisiología y biología molecular. [19]
El grupo Beggiatoa muestra una versatilidad sustancial en el uso de compuestos nitrogenados. El nitrógeno puede ser una fuente para el crecimiento o, en el caso del nitrato , puede ser un aceptor de electrones para la respiración anaeróbica . Las especies de Beggiatoa de agua dulce heterótrofas asimilan el nitrógeno para el crecimiento. Las fuentes de nitrógeno incluyen nitrato , nitrito , amoníaco , aminoácidos , urea , aspartato , asparagina , alanina y tiourea , dependiendo de la capacidad de cepas específicas.
Las Beggiatoa vacuoladas autótrofas son capaces de almacenar nitrato en sus vacuolas en una concentración 20.000 veces superior a la del agua de mar circundante, y utilizarlo como aceptor terminal de electrones en condiciones anóxicas. Este proceso, llamado Reducción Disimilatoria de Nitrato a Amonio (DNRA), reduce el nitrato a amonio. La capacidad de utilizar nitrato como aceptor de electrones permite la colonización de entornos anóxicos, como esteras microbianas y sedimentos. Varias especies son capaces de fijar nitrógeno utilizando la enzima nitrogenasa (p. ej., Beggiatoa alba ). [3] [15]
Una de las características definitorias del género Beggiatoa es la producción de inclusiones intracelulares de azufre resultantes de la oxidación de fuentes de azufre reducidas (por ejemplo, sulfuro de hidrógeno ). En Beggiatoa autótrofas , el sulfuro es una fuente de energía y electrones para la fijación de carbono y el crecimiento. La oxidación del sulfuro puede ser aeróbica o anaeróbica , de hecho puede estar acoplada con la reducción de oxígeno o con la reducción de nitrato . El azufre producido por la oxidación del sulfuro se almacena en glóbulos internos y se puede utilizar cuando la concentración de sulfuro disminuye. Por lo tanto, el almacenamiento temporal de azufre elemental (S 0 ) aumenta la adaptabilidad de un organismo y su tolerancia a los cambios en las concentraciones de sulfuro y oxígeno. [3] [15]
Oxidación aeróbica de sulfuros:
Oxidación anaeróbica de sulfuro:
También existen algunos casos de quimioorganotrofia . Por ejemplo, la cepa Beggiatoa sp. 35Flor suele realizar una respiración aeróbica acoplada a la oxidación de sulfuro, pero en condiciones anóxicas se activa un tipo diferente de respiración. La energía se obtiene quimioorganotróficamente a partir de la oxidación de PHA ( polihidroxialcanoatos ), compuestos orgánicos previamente sintetizados a través de la fijación de CO2 durante el crecimiento quimiolitotrófico en oxígeno y sulfuro. En este caso, el aceptor de electrones es el azufre almacenado en la célula, por lo que el producto final es sulfuro de hidrógeno. [20]
Respiración anaeróbica:
La cepa Beggiatoa sp. 35Flor es capaz de utilizar el hidrógeno como donador de electrones alternativo al sulfuro. Este proceso de oxidación puede proporcionar energía para fines de mantenimiento y asimilación y es útil para reducir el azufre almacenado cuando se vuelve excesivo, pero no puede proporcionar crecimiento a la cepa. [21]
Oxidación del hidrógeno:
El metabolismo de Beggiatoa incluye el uso de fósforo en forma de polifosfato . La regulación de este metabolismo depende de las condiciones ambientales. Un entorno oxigenado provoca una acumulación de polifosfato, mientras que la anoxia (acoplada con una concentración creciente de sulfuro) produce una descomposición del polifosfato y su posterior liberación de las células. El fosfato liberado puede depositarse luego como minerales de fosforita en los sedimentos o permanecer disuelto en el agua. [15]
Se ha observado que los filamentos forman esteras densas sobre sedimentos en una gran variedad de entornos. Aparecen como una capa blanquecina y, dado que están presentes y prosperan en entornos marinos que han estado sujetos a contaminación , pueden considerarse como una especie indicadora . [22] Beggiatoa y otras bacterias filamentosas relacionadas pueden causar problemas de sedimentación en plantas de tratamiento de aguas residuales , lagunas de desechos industriales en conservas , pulpa de papel , elaboración de cerveza y molienda , causando el fenómeno llamado " bulking ". Beggiatoa también puede desintoxicar el sulfuro de hidrógeno en el suelo y tiene un papel en la inmovilización de metales pesados. [23] [24]
Los beggiatoa viven en la interfaz óxica/anóxica, donde se benefician de la presencia de sulfuro de hidrógeno y oxígeno. Las cepas quimiolitoautotróficas de Beggiatoa también se consideran importantes productores primarios en ambientes oscuros. [3]
La increíble cantidad de adaptaciones y metabolismos de este género de bacterias son consecuencias de la extraordinaria variabilidad ambiental en la que pueden vivir. Beggiatoa es casi bentónica, se puede encontrar en ambientes marinos ( Beggiatoa sp . MS-81-6 y MS-81-1c) o de agua dulce ( Beggiatoa alba ) y solo necesitan sulfuro o tiosulfuro como donador de electrones y un oxidante. Por lo general, se pueden encontrar en hábitats que tienen altos niveles de sulfuro de hidrógeno, estos ambientes incluyen filtraciones frías , manantiales de azufre , aguas contaminadas con aguas residuales, capas de lodo de lagos y cerca de respiraderos hidrotermales profundos . Beggiatoa también se puede encontrar en la rizosfera de plantas de pantano, [25] [26] en el suelo, sedimentos marinos y en la laguna de manglares también (donde contribuyen al acervo de lípidos de los sedimentos [27] ). [28] Las especies de agua dulce tienen hábitats típicos en manantiales de azufre, zanjas, charcos, humedales, sedimentos de lagos y en arrozales, donde pueden crecer asociadas a las raíces de las plantas de arroz. Las Beggiatoa que viven en agua marina se pueden encontrar en regiones donde su fuente de energía (sulfuro o tiosulfuro) está disponible. Puede extraerse tanto de fuentes inorgánicas como orgánicas y generalmente está acoplada a condiciones microóxicas , por lo tanto, una concentración muy baja de oxígeno. [3] Este género de Gammaprotobacteria también es común en áreas localizadas de descomposición anaeróbica, como los cadáveres de ballenas en el fondo marino del océano profundo. [3]
Las Beggiatoa vacuoladas pueden ser muy comunes en regiones costeras de surgencia (por ejemplo, las costas de Perú y Chile ), fuentes hidrotermales de aguas profundas y fuentes frías ; en estos ambientes, las esteras de flóculos (pechos con forma de pelo) pueden crecer y cubrir grandes áreas y alcanzar una altura de 30 cm. En fuentes hidrotermales de aguas profundas y fuentes frías, las Beggiatoa pueden crecer en filamentos que pueden tener hasta 200 micrómetros de diámetro, lo que las convierte en las procariotas más grandes conocidas actualmente. Las Beggiatoa vacuoladas también se pueden encontrar en fondos marinos hipóxicos, donde los filamentos pueden vivir dentro de los sedimentos a una profundidad de pocos centímetros (de 2 a 4 cm); en algunos casos, los filamentos bacterianos de Beggiatoa pueden ser la parte más abundante de la biomasa microbiana en los sedimentos. [3]
Beggiatoa también se encuentra en marismas , salinas y cuevas submarinas geotermalmente activas. Algunos estudios sobre estos ambientes se han llevado a cabo en las cuevas submarinas de caliza dolomitizada en Capo Palinuro , Salerno , ( Italia ). Aquí hay manantiales sulfúricos hidrotermales y la biopelícula microbiana está asociada con el flujo de fluidos hidrotermales, cuya actividad es intermitente y comienza durante la marea baja. Las esteras encontradas en las cuevas estaban compuestas por filamentos que se parecían en su mayor parte a Beggiatoa , Thiothrix y Flexibacter , y estos filamentos similares a Beggiatoa eran morfológicamente similares a los encontrados adheridos a las rocas y al biso de los mejillones de los respiraderos hidrotermales Lucky Strike en la dorsal mesoatlántica . [3]
Beggiatoa puede formar tapetes microbianos complejos en asociación con otras bacterias filamentosas, como las cianobacterias . Las cianobacterias suelen ocupar la capa superficial del tapete y producen una gran cantidad de oxígeno durante el día a través de la fotosíntesis. Por el contrario, Beggiatoa crece debajo de los fotótrofos , a lo largo de una interfaz óxica/anóxica (oxígeno/sulfuro), donde producen manchas blancas. [3] Sin embargo, durante la aclimatación a la oscuridad, el tapete se volvió anóxico, por lo que Beggiatoa se movió a la superficie del tapete, para evitar los altos niveles de H 2 S y permanecer en la interfaz oxígeno/sulfuro, mientras que las cianobacterias permanecieron en una capa densa debajo. [29] A veces, los tapetes de Beggiatoa también se enriquecen con la presencia de diatomeas y euglenoides verdes , [23] pero también se han encontrado protistos como ciliados y dinoflagelados asociados con los tapetes en el ecosistema de ventilación hidrotermal de la cuenca de Guaymas y es probable que consuman una gran cantidad de biomasa bacteriana. [30]
Como las esteras microbianas pueden alcanzar 3 cm de ancho, pueden ser una fuente de alimento para muchos herbívoros. Esta conexión trófica se ha observado en sistemas de manglares , donde Beggiatoa cubre parte de los sedimentos marinos. Las bacterias contribuyen a la dieta de la meiofauna , en particular rotíferos , poliquetos , nematodos y algunos grupos de platelmintos , asquelmintos y gnatostomúlidos . [31] Los nematodos parecen estimular el desarrollo de las esteras de Beggiatoa , al aumentar la penetración de oxígeno y la difusión de nutrientes en la estera. [32]
Además, muchas carroñas aparecen cubiertas por esteras de bacterias filamentosas similares a Beggiatoa que recubren las bacterias anaeróbicas reductoras de sulfato . Atraen a muchos metazoos carroñeros , pero cuando rompen la estera, liberan sulfuro de hidrógeno que ahuyenta a los carroñeros. Por lo tanto, Beggiatoa también puede considerarse una defensa de la carroña contra los carroñeros. [33]
Varias especies de bacterias blancas del azufre de la familia Beggiatoaceae pueden acumular y transportar NO 3 − , extraído de sedimentos costeros poco profundos, que es fundamental en el metabolismo, así como acumularlo en filamentos. La reducción de NO 3 − a amonio implica la oxidación de H 2 S (excepto en los respiraderos geotérmicos, el sulfuro deriva del sedimento anaeróbico subyacente en el que se produce la reducción disimilatoria del sulfato [23] ): esta reducción conduce a la formación de zonas subóxicas caracterizadas por un potencial redox positivo y solo concentraciones traza de H 2 S libre. En el medio marino, la presencia de estas especies es importante porque tienen un papel fundamental en la regulación de la cantidad de H 2 S y NO 3 − :
Beggiatoa también puede acumular fósforo en forma de polifosfato, que posteriormente libera como fosfato en condiciones anóxicas. Esto podría aumentar la disponibilidad de fósforo para los productores primarios si el fosfato se libera desde el sedimento a la columna de agua. Los estudios sobre el ciclo del fósforo y la liberación de fósforo por parte de Beggiatoa en el mar Báltico han descubierto que la oxidación del sulfuro por parte de estas bacterias puede reducir la tasa de formación de sulfuro de hierro en los sedimentos y, por lo tanto, aumentar la capacidad de retención de fósforo del sedimento. [15]
Los enriquecimientos más exitosos para Beggiatoa spp. se han realizado utilizando una bandeja o acuario poco profundo al que se le ha agregado unos centímetros de arena, diferentes cantidades de CaSO 4 y K 2 HPO 4 , una fuente de polímeros orgánicos complejos como algas marinas , varios centímetros de lodo marino rico en sulfuro y agua de mar. El enriquecimiento debe contener la interfaz sulfuro-oxígeno adecuada que solo puede ser posible si se introduce aire, por ejemplo, mediante un flujo lento y constante de agua de mar recién aireada. Otro tipo de enriquecimiento asociado con Beggiatoa spp . se basa en el uso de pasto o heno seco extraído en un medio mineral porque los polímeros complejos como los residuos de celulosa en el material son un sustrato que apoya la reducción de sulfato por otros microbios. Esto también proporciona el sulfuro de hidrógeno necesario para enriquecer para Beggiatoa . [3]
Existen tres técnicas diferentes posibles para obtener cepas aisladas de Beggiatoa en cultivo puro:
El procedimiento para aislar una cepa heterotrófica requiere una placa de agar que contenga sustratos orgánicos diluidos, como una pequeña cantidad de peptona. Luego, se recogen mechones de filamentos de Beggiatoa del entorno, se lavan con una solución de lavado estéril y se colocan en la placa de agar. De esta manera, habrá algunos filamentos en crecimiento que se alejarán del inóculo central y que se pueden usar como inóculo para una nueva placa de agar. [3]
Para el aislamiento de cepas marinas de Beggiatoa (que presentan crecimiento autótrofo ), dado que son microaerófilos obligados, es esencial proporcionar condiciones microóxicas y utilizar placas de agar particulares hechas con agua de mar filtrada y suplementada con sulfuro de sodio y acetato de sodio. En comparación, para cepas de agua dulce, el aislamiento debe realizarse en condiciones óxicas (atmósfera de aire) utilizando una variedad de medios que contengan una baja concentración de un solo compuesto orgánico como acetato, Na 2 S o tiosulfato . [3]
Los medios líquidos se utilizan a menudo para el enriquecimiento, la enumeración del número más probable (NMP) y el cultivo en masa de Beggiatoa . Para cultivar con éxito Beggiatoa de agua dulce heterotrófica o mixotrófica , los medios líquidos deben contener pequeñas cantidades de sustrato de carbono, ya sea extractos de suelo o acetato. La especie y cepa tipo ( Beggiatoa alba str. B18LD) y cepas relacionadas generalmente se cultivan en medios que incluyen una base de sal, acetato como fuente de carbono y adiciones variables de extracto de levadura y sulfuro. [35] Algunas cepas de Beggiatoa autótrofas marinas también se cultivan en un medio mineral líquido definido con tiosulfato, CO 2 y condiciones microóxicas bajo aireación con 0,25% de O 2 (v/v) en la fase gaseosa. [3]
Las cepas autótrofas que provienen de un aislamiento de un solo filamento en agar se pueden mantener y propagar fácilmente en tubos de gradiente de sulfuro en los que los tapones de agar ricos en sulfuro se superponen con agar blando libre de sulfuro. Los tubos se cierran de forma suelta para permitir el intercambio de gases del espacio de cabeza con la atmósfera. Como resultado, se forman dos capas opuestas, una que contiene sulfuro mientras que la otra contiene oxígeno: esto permite el crecimiento de una capa de Beggiatoa bien definida en la interfaz sulfuro-oxígeno. La construcción del medio de gradiente requiere diferentes cantidades de medio J3 (fabricado con agar y NaHCO 3 ) suplementado con Na 2 S neutralizado colocado en un tubo con tapa de rosca. Aquí, la fuente de azufre es proporcionada por el flujo de sulfuro. Otra “capa” está formada por NaHCO3 sin sulfuro ni tiosulfato: todo el sulfuro estará debajo de la interfase entre el tapón de agar sulfídico y el agar superpuesto sin sulfuro, mientras que habrá otra capa en la parte superior del tubo que representa el reservorio de oxígeno. Comienza a tomar forma de gradiente debido a la reacción entre el sulfuro y el oxígeno: como resultado, los filamentos proliferan rápidamente en la interfase sulfuro-oxígeno, formando una capa marcada, o “placa”, de 1 mm, pero también es posible apreciar que estas bacterias pueden rastrear la interfase y descender lentamente debido al agotamiento gradual del reservorio de sulfuro. [3]
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