Técnicas de ingeniería genética

En primer lugar, los ingenieros genéticos deben elegir qué gen desean insertar, modificar o eliminar.

Este vector se utiliza entonces para insertar el gen en el genoma del huésped, creando un organismo transgénico o editado.

[3]​ En 1928, Frederick Griffith demostró la existencia de un "principio transformador" involucrado en la herencia, que fue identificado como ADN en 1944 por Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty .

Los plásmidos, descubiertos en 1952,[6]​ se convirtieron en herramientas importantes para transferir información entre células y replicar secuencias de ADN.

A principios de los años 70 se descubrió que esta bacteria insertaba su ADN en las plantas utilizando un plásmido Ti.

Para objetivos más complejos pueden estar implicadas vías biosintéticas enteras en las que intervienen múltiples genes.

Una vez aislado un gen, puede almacenarse en el interior de la bacteria, lo que proporciona un suministro ilimitado para la investigación.

[11]​ Se pueden realizar cribas genéticas para determinar genes potenciales, seguidas de otras pruebas que identifiquen a los mejores candidatos.

Una criba sencilla consiste en mutar aleatoriamente el ADN con sustancias químicas o radiaciones y luego seleccionar los que presentan el rasgo deseado.

A continuación hay que localizar el gen comparando la herencia del fenotipo con marcadores genéticos conocidos.

Este enfoque consiste en atacar a un gen específico con una mutación y luego observar qué fenotipo se desarrolla.

Una vez aislados, se añaden elementos genéticos adicionales al gen para permitir su expresión en el organismo huésped y ayudar a la selección.

Esta fase acuosa puede eliminarse y purificarse aún más si es necesario repitiendo los pasos de fenol-cloroformo.

Para determinar si un gen útil está presente en un fragmento concreto, se analiza la biblioteca de ADN en busca del fenotipo deseado.

[24]​ Una vez construido el gen, debe integrarse de forma estable en el genoma del organismo objetivo o existir como ADN extracromosómico.

Los métodos basados en sustancias químicas utilizan compuestos naturales o sintéticos para formar partículas que facilitan la transferencia de genes a las células.

[36]​ Estos vectores sintéticos tienen la capacidad de unir ADN y dar cabida a grandes transferencias genéticas.

La descendencia resultante es quimérica, y el apareamiento posterior puede producir ratones totalmente transgénicos con el gen de interés.

[43]​ Los virus modificados genéticamente pueden utilizarse como vectores virales para transferir genes diana a otro organismo en terapia génica.

Las bacterias constan de una sola célula y se reproducen clonalmente, por lo que no es necesaria la regeneración.

Para confirmar que un organismo contiene el nuevo gen se realizan pruebas adicionales mediante PCR, hibridación Southern y secuenciación del ADN.

Estas pruebas también pueden confirmar la localización cromosómica y el número de copias del gen insertado.

Entre ellos se incluyen la hibridación norte, la RT-PCR cuantitativa, el Western blot, la inmunofluorescencia, el ELISA y el análisis fenotípico.

Se desarrollaron métodos que insertaban el nuevo material genético en sitios específicos dentro del genoma de un organismo.

El uso de este método en células madre embrionarias ha permitido desarrollar ratones transgénicos con knock out selectivo.

La recombinasa Cre es una enzima que elimina ADN mediante recombinación homóloga entre secuencias de unión conocidas como sitios Lox-P.

Estas roturas están sujetas a procesos celulares de reparación del ADN que pueden aprovecharse para eliminar, corregir o insertar genes.

Esto aumenta su especificidad y reduce su toxicidad, ya que no se dirigen a tantos sitios dentro de un genoma.

CRISPR/Cpf1 es un sistema descubierto más recientemente que requiere un ARN guía diferente para crear roturas particulares de doble cadena (deja salientes al escindir el ADN) en comparación con CRISPR/Cas9.

Este método combina una transcriptasa inversa con una nucleasa dirigida por ARN que sólo corta una cadena, pero no rompe la doble.