La actividad ribonucleasa rompe los enlaces 3'-O-P del ácido ribonucleico hibridado con ADN para producir extremos 3'-hidroxil y 5'-fosfato.

[2]​ El sitio activo de este enzima está centrado en un dominio conservado DEDD (residuos D443, E478, D498 y D549) que lleva a cabo la hidrólisis del enlace fosfodiéster.

Los siguientes genes humanos codifican para proteínas con actividad RNasa H: Se han asociado mutaciones en el gen RNASE2 con la enfermedad rara de origen genético conocida como síndrome de Aicardi-Goutières,[5]​ el cual se manifiesta a edades tempranas mediante síntomas neurológicos y dermatológicos.

[7]​[8]​ Inhibidores de este enzima podrían dar lugar a nuevos medicamentos contra enfermedades como el sida.

[10]​ El VIH-1 tiene esta actividad enzimática necesaria para producir ADN de doble cadena a partir del ARN vírico.