[6]​ El rey había invitado en 1524 (aunque no formalmente encargado) al explorador florentino Giovanni da Verrazzano a dirigir una expedición a la costa oriental de América del Norte en nombre de Francia.

(También se cree que Cartier podría haber acompañado a Verrazzano en esa expedición, que exploró la costa desde Carolina del Sur hasta Nueva Escocia e islas como la de Terranova.)

Según el encargo, iba a «descubrir ciertas islas y tierras en donde se dice que se encuentran gran cantidad de oro y otros objetos preciosos».

[nota 4]​ Cartier escribió que por ellos le dio a la región donde fueron capturados el nombre de «Honguedo».

[2]​ Cartier partió y tras rodear casi completamente la isla de Anticosti, a la que bautizó como isla Assomption (Asunción), siguió cabotando por la costa septentrional del golfo de San Lorenzo en dirección noreste.

La expedición constaba de 110 hombres y tres navíos: La Grande Hermine (120 toneladas), la nave en la que iba Cartier; La Petite Hermine (60 toneladas), al mando de su cuñado Macé Jalobert; y la Emerillon (40 toneladas), a cargo de Guillaume, el bretón.

Los dos nativos del primer viaje iban de vuelta, hablando ambos ya el francés.

En Anacosti (en ese momento consagrada a San Lorenzo) los tres barcos se reunieron de nuevo y, gracias a los consejos de los dos nativos, lograron navegar remontando el estuario del San Lorenzo y luego el curso del río San Lorenzo, descubriendo que se trataba de un río al comprobar que el agua era dulce.

Cartier no aceptó, liberó a sus dos hijos y decidió seguir sin guías ni intérpretes.

Cartier dejó los dos barcos grandes y parte de la expedición en un puerto natural en el río.

Siguió remontándolo con cuarenta hombres a bordo de la Emerillon y dos chalupas.

Hochelaga era mucho más impresionante que el pequeño y miserable pueblo de Stadacona, y más de 1000 iroqueses se acercaron a la orilla para saludar a los franceses.

La expedición no pudo seguir adelante, ya que el río estaba bloqueado por una zona de rápidos.

No se sabe exactamente cuándo se decidió a pasar el invierno de 1535-36 allí, y que por entonces ya era demasiado tarde para volver a Francia.

Los nativos recolectaban y secaban la hoja en verano y luego la reducían a polvo, un polvo que transportaban en pequeñas bolsas colgadas del cuello que luego lo fumaban.

Los nativos lo consideraban muy provechoso para la salud y Cartier accedió a probarlo, pero tras la aspiración, casi muere asfixiado.

Los hombres enfermaron de escorbuto, primero los iroqueses y luego los franceses.

Este remedio posiblemente salvó a la expedición de la destrucción permitiendo que 85 franceses sobreviviesen ese invierno.

Donnacona comprendió qué era lo que están buscando los franceses, oro, gemas, especias, y les describió lo que deseaban escuchar, el mitológico reino de Saguenay, y Francisco I, a pesar de sus preocupaciones militares por las disputas con Carlos I, se deja convencer para pertrechar una tercera expedición exploratoria, pero en ningún momento los franceses parecen decididos a establecer una colonia.

Roberval fue el encargado de dirigir la expedición con Cartier como principal navegante.

Mientras Roberval esperaba por la artillería y suministros, dio permiso a Cartier para que navegase por delante con sus barcos: se preparó la expedición, armaron cinco barcos, embarcaron ganado y liberaron condenados para convertirlos en colonos.

Navegó a vela unas millas río arriba, a un lugar que en el anterior viaje había observado, y decidió asentarse en la confluencia del río San Lorenzo con el río del Cabo Rojo, el sitio de la actual Cap-Rouge (Quebec).

Su decepción dio origen a la expresión francesa de que es «falso como los diamantes del Canadá» («faux comme des diamants du Canada»).

Tras haber fijado tareas para todos, Cartier dejó el fuerte el 7 de septiembre y partió con un bote a la búsqueda del reino de Saguenay.

De vuelta a Charlesbourg-Royal, Cartier encontró que la situación era ominosa.

Si bien algunas de sus acciones con los iroqueses en el río San Lorenzo fueron deshonrosas, intentó al tiempo establecer amistad con ellos y con los otros pueblos indígenas que vivían a lo largo del río San Lorenzo, un preliminar indispensable para el asentamiento de Francia en sus tierras.

La contribución más importante de Cartier al descubrimiento de Canadá fue ser el primer europeo en penetrar en el continente, y, más precisamente, en la región oriental del interior a lo largo del río San Lorenzo.