Cuantificación de ácidos nucleicos
Las reacciones en las que se utilizan ácidos nucleicos suelen requerir cantidades y pureza particulares para un rendimiento óptimo.
El análisis espectrofotométrico se basa en el principio de que los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta siguiendo un patrón específico.
En el caso del ADN y el ARN, se expone una muestra a la luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nanómetros (nm) y un fotodetector mide la luz que atraviesa la muestra.
Cuanta más luz absorba la muestra, mayor será la concentración de ácido nucleico en la misma.
El efecto resultante es que menos luz golpeará el fotodetector y esto producirá una mayor densidad óptica (DO).
[2] La densidad óptica[3] se genera a partir de la ecuación: En términos prácticos, una muestra que no contiene ADN o ARN no debería absorber la luz ultravioleta y, por tanto, producir una DO de 0.
Se aplican los mismos factores de conversión y, por tanto, en estos contextos: Es habitual que las muestras de ácidos nucleicos estén contaminadas con otras moléculas (por ejemplo, proteínas, compuestos orgánicos, etc.).
Estas proporciones se utilizan comúnmente para evaluar la cantidad de contaminación proteica que queda del proceso de aislamiento del ácido nucleico, ya que las proteínas absorben a 280 nm.
Un método alternativo para evaluar la concentración de ADN y ARN es etiquetar la muestra con un marcador fluorescente, que es un colorante fluorescente utilizado para medir la intensidad de los colorantes que se unen a los ácidos nucleicos y son fluorescentes selectivamente cuando se unen (por ejemplo, bromuro de etidio).
La ventaja de la cuantificación por fluorescencia del ADN y el ARN es la mayor sensibilidad con respecto al análisis espectrofotométrico.
