Era también el sobrino de Georges d'Amboise, cardenal y primer ministro del rey Luis XII de Francia.

De 1507 a 1508, Leonardo pintará magníficas obras como "La Virgen de las Rocas" y "Santa Ana", pero además, realizó por cuenta de Charles II de Amboise trabajos de hidráulica, estatuas, e incluso los planos del su nuevo palacio.

Tuvo también un hijo natural, Michel de Amboise, nacido en Nápoles el 1503.

Este hijo ilegítimo, Michael, es el origen de la familia de Amboise que ha perdurado hasta hoy día.

Su retrato que se atribuía a Leonardo da Vinci, pero luego lo ha sido en Andrea Solario, se encuentra ante la "Mona Lisa" en el Museo del Louvre en París.