Carga viral
Es una herramienta básica en el manejo clínico de la persona seropositiva ya que permite: - Detectar el fracaso terapéutico con rapidez.
- Ayudar a modificar el plan terapéutico antes de que se desarrollen complicaciones clínicas.
Para el pronóstico se considera que a mayor carga vírica basal, menor probabilidad de una respuesta sostenida.
Se considera una buena respuesta al tratamiento antiviral si se obtiene una carga viral indetectable al término del tratamiento y una carga viral indetectable y/o ARN cualitativo negativo a las 24 semanas (respuesta vírica sostenida).
La carga viral se requiere para monitorización de la profilaxis y del tratamiento preventivo o curativo con medicamentos antivirales que se recomienda en los casos de trasplante, dado que el CMV es el agente patógeno más importante que afecta los casos de trasplante por su correlación directa con el rechazo del injerto u órgano trasplantado.
[2][3] Igualmente la carga viral existente en líquido amniótico es un factor predictivo de la transmisión intrauterina, y los niños con infección congénita sintomática excretan más virus en la orina que los que tienen una infección asintomática, aunque todavía no se ha podido relacionar la carga vírica con el pronóstico en niños infectados de las complicaciones y secuelas de la infección por CMV como la hipoacusia neurosensorial.
Todos estos sistemas (a excepción de la amplificación Qβ) se encuentran actualmente en el mercado.
La sonda empleada y la señal no son amplificadas (algo que sí ocurre en alguna de las técnicas descritas más abajo en este mismo documento).
Se comienza con una población de pacientes que han resultado ser seropositivos tras la prueba diagnóstica ELISA.
Para la realización de NASBA la muestra susceptible de poseer ARN vírico se incuba junto con una mezcla de tres enzimas (retrotranscriptasa, ARNasaH o II y T7 ARN polimerasa) y dos cebadores (a+ complementario al extremo 5' y b- complementario al extremo 3', b- además se encuentra unido a una secuencia promotora T7).
Este ciclo se repetirá ya de forma continua hasta que detengamos el proceso (inactivando las enzimas por desnaturalización, sacando el tubo del baño isotérmico...).
Estos calibradores se encontrarán a unas concentraciones conocidas previamente: baja, media y alta respectivamente.
Pero cada vez que NASBA pase por el paso 6º o 12º las balizas moleculares se unirán a las secuencias complementarias del ARN diana amplificadas, separándose sus extremos y quedando liberado el fluorocromo, que emitirá una fluorescencia proporcional al número de hebras de ARN.
Esto tiene como consecuencia que, aunque sea adecuada para cuantificar, NASBA no debe ser empleada para confirmar o desmentir la presencia de ARNm de un determinado virus, ya que no es demasiado fiable.
Mediante esta técnica se amplifica la sonda específica que se une a la secuencia de interés (en este caso, del genoma viral), en lugar de amplificar tal secuencia, como ocurre en otros métodos.
Se suelen hacer una serie de nuevas hibridaciones con sonda captura y lavados, con el objetivo de eliminar sonda señalizadora sin unir y tener así solamente secuencia metaestable unida a la diana.
Esta replicación es muy eficiente, generándose 106-109 copias por sonda señalizadora original en menos de 15 minutos.
