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Transformación genética

En esta imagen, un gen de una célula bacteriana se traslada a otra célula bacteriana. Este proceso, en el que la segunda célula bacteriana absorbe nuevo material genético, se denomina transformación.

En biología molecular y genética , la transformación es la alteración genética de una célula resultante de la captación e incorporación directa de material genético exógeno de su entorno a través de la (s) membrana (s) celular(es). Para que se produzca la transformación, la bacteria receptora debe estar en un estado de competencia , que puede ocurrir en la naturaleza como una respuesta limitada en el tiempo a condiciones ambientales como la inanición y la densidad celular, y también puede inducirse en un laboratorio. [1]

La transformación es uno de los tres procesos que conducen a la transferencia horizontal de genes , en la que el material genético exógeno pasa de una bacteria a otra; los otros dos son la conjugación (transferencia de material genético entre dos células bacterianas en contacto directo) y la transducción (inyección de ADN extraño por un virus bacteriófago en la bacteria huésped). [1] En la transformación, el material genético pasa a través del medio intermedio y la captación depende completamente de la bacteria receptora. [1]

En 2014 se sabía que alrededor de 80 especies de bacterias eran capaces de transformarse, divididas aproximadamente en partes iguales entre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas ; el número podría ser una sobreestimación ya que varios de los informes están respaldados por artículos individuales. [1]

El término "transformación" también puede utilizarse para describir la inserción de nuevo material genético en células no bacterianas, incluidas células animales y vegetales; sin embargo, debido a que " transformación " tiene un significado especial en relación con las células animales, que indica progresión a un estado canceroso, el proceso generalmente se denomina " transfección ". [2]

Historia

La transformación en bacterias fue demostrada por primera vez en 1928 por el bacteriólogo británico Frederick Griffith . [3] Griffith estaba interesado en determinar si las inyecciones de bacterias muertas por calor podrían usarse para vacunar ratones contra la neumonía. Sin embargo, descubrió que una cepa no virulenta de Streptococcus pneumoniae podría volverse virulenta después de ser expuesta a cepas virulentas muertas por calor. Griffith planteó la hipótesis de que algún " principio transformador " de la cepa muerta por calor era responsable de hacer virulenta a la cepa inofensiva. En 1944, Oswald Avery , Colin MacLeod y Maclyn McCarty identificaron este "principio transformador" como genético . Aislaron ADN de una cepa virulenta de S. pneumoniae y, utilizando solo este ADN, pudieron hacer virulenta una cepa inofensiva. A esta captación e incorporación de ADN por las bacterias la denominaron "transformación" (véase experimento de Avery-MacLeod-McCarty ) [4]. Los resultados de los experimentos de Avery et al. fueron recibidos al principio con escepticismo por la comunidad científica y no fue hasta el desarrollo de marcadores genéticos y el descubrimiento de otros métodos de transferencia genética ( conjugación en 1947 y transducción en 1953) por Joshua Lederberg que los experimentos de Avery fueron aceptados. [5]

Originalmente se pensaba que Escherichia coli , un organismo de laboratorio de uso común, era refractario a la transformación. Sin embargo, en 1970, Morton Mandel y Akiko Higa demostraron que se puede inducir a E. coli a captar ADN del bacteriófago λ sin el uso de fagos auxiliares después del tratamiento con solución de cloruro de calcio. [6] Dos años después, en 1972, Stanley Norman Cohen , Annie Chang y Leslie Hsu demostraron que CaCl
2El tratamiento también es eficaz para la transformación del ADN plasmídico. [7] El método de transformación de Mandel y Higa fue mejorado posteriormente por Douglas Hanahan . [8] El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en E. coli creó un procedimiento eficiente y conveniente para transformar bacterias que permite métodos de clonación molecular más simples en biotecnología e investigación , y ahora es un procedimiento de laboratorio utilizado rutinariamente.

La transformación mediante electroporación se desarrolló a finales de los años 1980, aumentando la eficiencia de la transformación in vitro y aumentando el número de cepas bacterianas que podían transformarse. [9] También se investigó la transformación de células animales y vegetales, y en 1982 se creó el primer ratón transgénico inyectando un gen de una hormona de crecimiento de rata en un embrión de ratón. [10] En 1897 se descubrió una bacteria que causaba tumores en las plantas, Agrobacterium tumefaciens , y a principios de los años 1970 se descubrió que el agente inductor de tumores era un plásmido de ADN llamado plásmido Ti . [11] Al eliminar los genes del plásmido que causaba el tumor y agregar genes nuevos, los investigadores pudieron infectar plantas con A. tumefaciens y dejar que las bacterias insertaran su ADN elegido en los genomas de las plantas. [12] No todas las células vegetales son susceptibles a la infección por A. tumefaciens , por lo que se desarrollaron otros métodos, incluida la electroporación y la microinyección . [13] El bombardeo de partículas fue posible gracias a la invención del Sistema de Entrega de Partículas Biolísticas (pistola genética) por John Sanford en la década de 1980. [14] [15] [16]

Definiciones

La transformación es una de las tres formas de transferencia horizontal de genes que ocurren en la naturaleza entre bacterias, en la que el ADN que codifica un rasgo pasa de una bacteria a otra y se integra en el genoma receptor por recombinación homóloga ; las otras dos son la transducción , realizada por medio de un bacteriófago , y la conjugación , en la que un gen se transmite a través del contacto directo entre bacterias. [1] En la transformación, el material genético pasa a través del medio intermedio y la captación depende completamente de la bacteria receptora. [1]

La competencia se refiere a un estado temporal de capacidad para absorber ADN exógeno del entorno; puede inducirse en un laboratorio. [1]

Parece ser un proceso antiguo heredado de un ancestro procariota común que es una adaptación beneficiosa para promover la reparación recombinatoria del daño del ADN, especialmente el daño adquirido en condiciones de estrés. La transformación genética natural parece ser una adaptación para la reparación del daño del ADN que también genera diversidad genética . [1] [17]

La transformación se ha estudiado en especies de bacterias gramnegativas de importancia médica como Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae y Vibrio cholerae . [18] También se ha estudiado en especies gramnegativas que se encuentran en el suelo, como Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi , y patógenos vegetales gramnegativos como Ralstonia solanacearum y Xylella fastidiosa . [18] La transformación entre bacterias grampositivas se ha estudiado en especies de importancia médica como Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus y Streptococcus sanguinis y en la bacteria grampositiva del suelo Bacillus subtilis . [17] También se ha informado en al menos 30 especies de Pseudomonadota distribuidas en varias clases diferentes. [19] Los Pseudomonadota mejor estudiados con respecto a la transformación son los patógenos humanos de importancia médica Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae y Helicobacter pylori . [17]

El término "transformación" también puede utilizarse para describir la inserción de nuevo material genético en células no bacterianas, incluidas células animales y vegetales; sin embargo, debido a que " transformación " tiene un significado especial en relación con las células animales, que indica progresión a un estado canceroso, el proceso generalmente se denomina " transfección ". [2]

Competencia natural y transformación

Las bacterias naturalmente competentes portan conjuntos de genes que proporcionan la maquinaria proteica para llevar el ADN a través de las membranas celulares. El transporte del ADN exógeno a las células puede requerir proteínas que participan en el ensamblaje de los pili de tipo IV y el sistema de secreción de tipo II , así como el complejo de translocasas de ADN en la membrana citoplasmática. [20]

Debido a las diferencias en la estructura de la envoltura celular entre las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, existen algunas diferencias en los mecanismos de captación de ADN en estas células, sin embargo, la mayoría de ellas comparten características comunes que involucran proteínas relacionadas. El ADN primero se une a la superficie de las células competentes en un receptor de ADN y pasa a través de la membrana citoplasmática a través de la translocasa de ADN. [21] Solo el ADN monocatenario puede pasar a través de ella, y la otra hebra se degrada por nucleasas en el proceso. El ADN monocatenario translocado puede luego integrarse en los cromosomas bacterianos mediante un proceso dependiente de RecA . En las células Gram-negativas, debido a la presencia de una membrana adicional, el ADN requiere la presencia de un canal formado por secretinas en la membrana externa. La pilina puede ser necesaria para la competencia, pero su papel es incierto. [22] La captación de ADN generalmente no es específica de la secuencia, aunque en algunas especies la presencia de secuencias de captación de ADN específicas puede facilitar la captación eficiente de ADN. [23]

Transformación natural

La transformación natural es una adaptación bacteriana para la transferencia de ADN que depende de la expresión de numerosos genes bacterianos cuyos productos parecen ser responsables de este proceso. [20] [19] En general, la transformación es un proceso de desarrollo complejo que requiere energía. Para que una bacteria se una, absorba y recombine ADN exógeno en su cromosoma, debe volverse competente, es decir, entrar en un estado fisiológico especial. El desarrollo de la competencia en Bacillus subtilis requiere la expresión de unos 40 genes. [24] El ADN integrado en el cromosoma del huésped suele derivar (pero con raras excepciones) de otra bacteria de la misma especie y, por lo tanto, es homólogo al cromosoma residente.

En B. subtilis, la longitud del ADN transferido es mayor a 1271 kb (más de 1 millón de bases). [25] Es probable que la longitud transferida sea ADN bicatenario y, a menudo, es más de un tercio de la longitud total del cromosoma de 4215 kb. [26] Parece que alrededor del 7-9% de las células receptoras ocupan un cromosoma entero. [27]

La capacidad de transformación natural parece ocurrir en varios procariotas, y hasta ahora se sabe que 67 especies procariotas (en siete filos diferentes) experimentan este proceso. [19]

La competencia para la transformación es típicamente inducida por una alta densidad celular y/o limitación nutricional, condiciones asociadas con la fase estacionaria del crecimiento bacteriano. La transformación en Haemophilus influenzae ocurre más eficientemente al final del crecimiento exponencial a medida que el crecimiento bacteriano se acerca a la fase estacionaria. [28] La transformación en Streptococcus mutans , así como en muchos otros estreptococos, ocurre a una alta densidad celular y está asociada con la formación de biopelículas . [29] La competencia en B. subtilis es inducida hacia el final del crecimiento logarítmico, especialmente bajo condiciones de limitación de aminoácidos. [30] De manera similar, en Micrococcus luteus (un representante del filo Actinomycetota menos estudiado ), la competencia se desarrolla durante la fase de crecimiento exponencial medio-tardío y también es desencadenada por la inanición de aminoácidos. [31] [32]

Se cree que ciertos bacteriófagos contribuyen a la transformación al liberar ADN plasmídico y del huésped intacto . [33]

La transformación como adaptación para la reparación del ADN

La competencia se induce específicamente mediante condiciones que dañan el ADN. Por ejemplo, la transformación se induce en Streptococcus pneumoniae mediante los agentes que dañan el ADN mitomicina C (un agente de reticulación del ADN) y fluoroquinolona (un inhibidor de la topoisomerasa que causa roturas de doble cadena). [34] En B. subtilis , la transformación aumenta con la luz UV, un agente que daña el ADN. [35] En Helicobacter pylori , la ciprofloxacina, que interactúa con la ADN girasa e introduce roturas de doble cadena, induce la expresión de genes de competencia, mejorando así la frecuencia de transformación [36] Utilizando Legionella pneumophila , Charpentier et al. [37] probaron 64 moléculas tóxicas para determinar cuáles de ellas inducen competencia. De estas, solo seis, todos agentes que dañan el ADN, causaron una fuerte inducción. Estos agentes dañinos del ADN fueron mitomicina C (que causa enlaces cruzados entre cadenas de ADN), norfloxacino, ofloxacino y ácido nalidíxico (inhibidores de la ADN girasa que causan roturas de doble cadena [38] ), biciclomicina (causa roturas de cadena simple y doble [39] ) e hidroxiurea (induce la oxidación de bases del ADN [40] ). La luz UV también indujo competencia en L. pneumophila . Charpentier et al. [37] sugirieron que la competencia para la transformación probablemente evolucionó como una respuesta al daño del ADN.

Las bacterias que crecen de manera logarítmica difieren de las bacterias en fase estacionaria en cuanto al número de copias del genoma presentes en la célula, y esto tiene implicaciones para la capacidad de llevar a cabo un importante proceso de reparación del ADN . Durante el crecimiento logarítmico, pueden estar presentes en una célula bacteriana dos o más copias de cualquier región particular del cromosoma, ya que la división celular no coincide exactamente con la replicación cromosómica. El proceso de reparación recombinatoria homóloga (HRR) es un proceso clave de reparación del ADN que es especialmente eficaz para reparar daños en la doble cadena, como roturas de doble cadena. Este proceso depende de un segundo cromosoma homólogo además del cromosoma dañado. Durante el crecimiento logarítmico, un daño del ADN en un cromosoma puede ser reparado por HRR utilizando información de secuencia del otro cromosoma homólogo. Sin embargo, una vez que las células se acercan a la fase estacionaria, normalmente tienen solo una copia del cromosoma, y ​​la HRR requiere la entrada de una plantilla homóloga desde fuera de la célula mediante transformación. [41]

Para probar si la función adaptativa de la transformación es la reparación de daños en el ADN, se llevó a cabo una serie de experimentos utilizando B. subtilis irradiada con luz UV como agente dañino (revisado por Michod et al. [42] y Bernstein et al. [41] ) Los resultados de estos experimentos indicaron que la transformación del ADN actúa para reparar daños potencialmente letales en el ADN introducidos por la luz UV en el ADN receptor. El proceso particular responsable de la reparación fue probablemente HRR. La transformación en bacterias puede verse como un proceso sexual primitivo, ya que implica la interacción del ADN homólogo de dos individuos para formar ADN recombinante que se transmite a las generaciones sucesivas. La transformación bacteriana en procariotas puede haber sido el proceso ancestral que dio lugar a la reproducción sexual meiótica en eucariotas (ver Evolución de la reproducción sexual ; Meiosis ).

Métodos y mecanismos de transformación en laboratorio.

Esquema de la transformación bacteriana, para la cual primero se debe inducir competencia artificial

Bacteriano

La competencia artificial se puede inducir en procedimientos de laboratorio que implican hacer que la célula sea pasivamente permeable al ADN al exponerla a condiciones que normalmente no ocurren en la naturaleza. [43] Normalmente, las células se incuban en una solución que contiene cationes divalentes (a menudo cloruro de calcio ) en condiciones de frío, antes de exponerlas a un pulso de calor (choque térmico). El cloruro de calcio altera parcialmente la membrana celular, lo que permite que el ADN recombinante entre en la célula huésped. Las células que pueden absorber el ADN se denominan células competentes.

Se ha descubierto que el crecimiento de bacterias Gram negativas en 20 mM de Mg reduce el número de enlaces proteína- lipopolisacárido al aumentar la relación de enlaces iónicos a covalentes, lo que aumenta la fluidez de la membrana y facilita la transformación. [44] El papel de los lipopolisacáridos aquí se verifica a partir de la observación de que las cadenas laterales O más cortas se transforman de manera más efectiva, tal vez debido a una mejor accesibilidad del ADN.

La superficie de bacterias como E. coli está cargada negativamente debido a los fosfolípidos y lipopolisacáridos que se encuentran en su superficie celular, y el ADN también está cargado negativamente. Por lo tanto, una función del catión divalente sería proteger las cargas mediante la coordinación de los grupos fosfato y otras cargas negativas, lo que permitiría que una molécula de ADN se adhiera a la superficie celular.

La entrada de ADN en las células de E. coli se produce a través de canales conocidos como zonas de adhesión o unión de Bayer, y una célula típica posee hasta 400 de estas zonas. Su papel se estableció cuando se descubrió que la cobalamina (que también utiliza estos canales) inhibe competitivamente la captación de ADN. Otro tipo de canal implicado en la captación de ADN consiste en poli (HB):poli P:Ca. En este caso, se cree que el poli (HB) envuelve al ADN (en sí mismo un polifosfato) y se transporta en un escudo formado por iones Ca. [44]

Se sugiere que la exposición de las células a cationes divalentes en condiciones de frío también puede cambiar o debilitar la estructura de la superficie celular, haciéndola más permeable al ADN. Se cree que el pulso de calor crea un desequilibrio térmico en la membrana celular, que obliga al ADN a entrar en las células a través de los poros celulares o de la pared celular dañada.

La electroporación es otro método para promover la competencia. En este método, las células reciben una descarga eléctrica breve de 10-20 kV /cm, que se cree que crea agujeros en la membrana celular a través de los cuales puede entrar el ADN plasmídico. Después de la descarga eléctrica, los agujeros se cierran rápidamente mediante los mecanismos de reparación de la membrana celular.

Levadura

La mayoría de las especies de levadura , incluida la Saccharomyces cerevisiae , pueden ser transformadas por el ADN exógeno presente en el medio ambiente. Se han desarrollado varios métodos para facilitar esta transformación con alta frecuencia en el laboratorio. [45]

Eficiencia – Los distintos géneros y especies de levaduras absorben el ADN extraño con diferentes eficiencias. [53] Además, la mayoría de los protocolos de transformación se han desarrollado para la levadura de panadería, S. cerevisiae , y por lo tanto pueden no ser óptimos para otras especies. Incluso dentro de una misma especie, diferentes cepas tienen diferentes eficiencias de transformación, a veces diferentes en tres órdenes de magnitud. Por ejemplo, cuando las cepas de S. cerevisiae se transformaron con 10 ug del plásmido YEp13, la cepa DKD-5D-H produjo entre 550 y 3115 colonias, mientras que la cepa OS1 produjo menos de cinco colonias. [54]

Plantas

Existen varios métodos para transferir ADN a las células vegetales. Algunos métodos mediados por vectores son:

Algunos métodos sin vectores incluyen:

Hongos

Existen algunos métodos para producir hongos transgénicos , la mayoría de ellos análogos a los utilizados para las plantas. Sin embargo, los hongos deben tratarse de manera diferente debido a algunas de sus características microscópicas y bioquímicas:

Como se dijo anteriormente, una serie de métodos utilizados para la transformación de plantas también funcionan en hongos:

Animales

La introducción de ADN en células animales se suele llamar transfección y se analiza en el artículo correspondiente.

Aspectos prácticos de la transformación en biología molecular

El descubrimiento de la competencia inducida artificialmente en bacterias permite que bacterias como Escherichia coli se utilicen como un huésped conveniente para la manipulación del ADN, así como para la expresión de proteínas. Normalmente, se utilizan plásmidos para la transformación en E. coli . Para mantenerse estable en la célula, una molécula de ADN plasmídica debe contener un origen de replicación , que le permita replicarse en la célula independientemente de la replicación del propio cromosoma de la célula.

La eficiencia con la que un cultivo competente puede captar ADN exógeno y expresar sus genes se conoce como eficiencia de transformación y se mide en unidades formadoras de colonias (ufc) por μg de ADN utilizado. Una eficiencia de transformación de 1×10 8 ufc/μg para un plásmido pequeño como pUC19 es aproximadamente equivalente a 1 de cada 2000 moléculas del plásmido utilizado que se transforma.

En la transformación del cloruro de calcio , las células se preparan enfriándolas en presencia de Ca2+
(en CaCl
2solución), haciendo que la célula se vuelva permeable al ADN plasmídico . Las células se incuban en hielo con el ADN y luego se someten a un breve choque térmico (p. ej., a 42 °C durante 30–120 segundos). Este método funciona muy bien para el ADN plasmídico circular. Las preparaciones no comerciales normalmente deberían dar de 10 6 a 10 7 transformantes por microgramo de plásmido; una preparación deficiente será de aproximadamente 10 4 /μg o menos, pero una buena preparación de células competentes puede dar hasta ~10 8 colonias por microgramo de plásmido. [60] Sin embargo, existen protocolos para hacer células supercompetentes que pueden producir una eficiencia de transformación de más de 10 9 . [61] Sin embargo, el método químico generalmente no funciona bien para el ADN lineal, como fragmentos de ADN cromosómico, probablemente porque las enzimas exonucleasas nativas de la célula degradan rápidamente el ADN lineal. Por el contrario, las células que son naturalmente competentes suelen transformarse de forma más eficiente con ADN lineal que con ADN plasmídico.

La eficiencia de transformación utilizando el CaCl
2El método disminuye con el tamaño del plásmido y, por lo tanto, la electroporación puede ser un método más eficaz para la captación de ADN plasmídico grande. [62] Las células utilizadas en la electroporación deben prepararse primero lavándolas con agua bidestilada fría para eliminar las partículas cargadas que pueden crear chispas durante el proceso de electroporación.

Selección y cribado en la transformación de plásmidos

Como la transformación suele producir una mezcla de relativamente pocas células transformadas y una abundancia de células no transformadas, es necesario un método para seleccionar las células que han adquirido el plásmido. [63] Por lo tanto, el plásmido requiere un marcador seleccionable de modo que las células que no lo tienen puedan ser eliminadas o su crecimiento detenido. La resistencia a los antibióticos es el marcador más comúnmente utilizado para los procariotas. El plásmido transformante contiene un gen que confiere resistencia a un antibiótico al que las bacterias son sensibles de otro modo. La mezcla de células tratadas se cultiva en medios que contienen el antibiótico de modo que sólo las células transformadas puedan crecer. Otro método de selección es el uso de ciertos marcadores auxotróficos que pueden compensar la incapacidad de metabolizar ciertos aminoácidos, nucleótidos o azúcares. Este método requiere el uso de cepas mutadas adecuadamente que sean deficientes en la síntesis o utilidad de una biomolécula particular, y las células transformadas se cultivan en un medio que permita que sólo las células que contienen el plásmido crezcan.

En un experimento de clonación, se puede insertar un gen en un plásmido utilizado para la transformación. Sin embargo, en dicho experimento, no todos los plásmidos pueden contener un gen insertado con éxito. Por lo tanto, se pueden emplear técnicas adicionales para detectar células transformadas que contengan plásmido con el inserto. Se pueden utilizar genes indicadores como marcadores , como el gen lacZ que codifica la β-galactosidasa utilizada en el cribado azul-blanco . Este método de cribado se basa en el principio de complementación α , donde un fragmento del gen lacZ ( lacZα ) en el plásmido puede complementar otro gen lacZ mutante ( lacZΔM15 ) en la célula. Ambos genes por sí mismos producen péptidos no funcionales, sin embargo, cuando se expresan juntos, como cuando un plásmido que contiene lacZ-α se transforma en células lacZΔM15 , forman una β-galactosidasa funcional. La presencia de una β-galactosidasa activa puede detectarse cuando las células se cultivan en placas que contienen X-gal , formando colonias azules características. Sin embargo, el sitio de clonación múltiple , donde un gen de interés puede ligarse al vector plasmídico , se encuentra dentro del gen lacZα . Por lo tanto, la ligación exitosa interrumpe el gen lacZα y no se puede formar una β-galactosidasa funcional, lo que da como resultado colonias blancas. Las células que contienen el inserto ligado con éxito se pueden identificar fácilmente por su coloración blanca de las azules que no lo han hecho.

Otros genes reporteros de uso común son la proteína fluorescente verde (GFP), que produce células que brillan de color verde bajo la luz azul, y la enzima luciferasa , que cataliza una reacción con la luciferina para emitir luz. El ADN recombinante también se puede detectar utilizando otros métodos, como la hibridación de ácidos nucleicos con una sonda de ARN radiactivo, mientras que las células que expresaron la proteína deseada a partir del plásmido también se pueden detectar utilizando métodos inmunológicos.

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