El transcriptoma es el conjunto de todos los transcritos de ARN , tanto codificantes como no codificantes , presentes en un individuo o en una población de células . El término también puede emplearse a veces para referirse a todos los ARN , o solo al ARNm , según el experimento en particular. El término transcriptoma es una combinación de las palabras transcripción y genoma ; está asociado al proceso de producción de transcritos durante el proceso biológico de transcripción .
Las primeras etapas de las anotaciones del transcriptoma comenzaron con las bibliotecas de ADNc publicadas en la década de 1980. Posteriormente, la llegada de la tecnología de alto rendimiento condujo a formas más rápidas y eficientes de obtener datos sobre el transcriptoma. Se utilizan dos técnicas biológicas para estudiar el transcriptoma, a saber, la micromatriz de ADN , una técnica basada en la hibridación y la secuenciación de ARN , un enfoque basado en la secuencia. [1] La secuenciación de ARN es el método preferido y ha sido la técnica transcriptómica dominante desde la década de 2010. La transcriptómica de una sola célula permite el seguimiento de los cambios de transcripción a lo largo del tiempo dentro de células individuales.
Los datos obtenidos del transcriptoma se utilizan en la investigación para obtener información sobre procesos como la diferenciación celular , la carcinogénesis , la regulación de la transcripción y el descubrimiento de biomarcadores, entre otros. Los datos obtenidos del transcriptoma también encuentran aplicaciones en el establecimiento de relaciones filogenéticas durante el proceso de evolución y en la fertilización in vitro . El transcriptoma está estrechamente relacionado con otros campos de estudio biológicos basados en -omas ; es complementario al proteoma y al metaboloma y abarca el translatoma , el exoma , el meioma y el tanatotranscriptoma , que pueden considerarse campos omas que estudian tipos específicos de transcripciones de ARN. Existen relaciones cuantificables y conservadas entre el transcriptoma y otros -omas, y los datos de la transcriptómica se pueden utilizar de manera eficaz para predecir otras especies moleculares, como los metabolitos. [2] Existen numerosas bases de datos de transcriptomas disponibles públicamente.
La palabra transcriptoma es un acrónimo de las palabras transcripción y genoma . Apareció junto con otros neologismos formados utilizando los sufijos -oma y -omics para denotar todos los estudios realizados a escala del genoma en los campos de las ciencias de la vida y la tecnología. Como tal, transcriptoma y transcriptómica fueron una de las primeras palabras que surgieron junto con genoma y proteoma. [3] El primer estudio que presentó un caso de una colección de una biblioteca de ADNc para el ARNm de la polilla de seda se publicó en 1979. [4] El primer estudio seminal que mencionó e investigó el transcriptoma de un organismo se publicó en 1997 y describió 60.633 transcripciones expresadas en S. cerevisiae utilizando análisis en serie de la expresión genética (SAGE). [5] Con el auge de las tecnologías de alto rendimiento y la bioinformática y el consiguiente aumento de la potencia computacional, se volvió cada vez más eficiente y fácil caracterizar y analizar una enorme cantidad de datos. [3] Los intentos de caracterizar el transcriptoma se hicieron más prominentes con el advenimiento de la secuenciación automatizada de ADN durante la década de 1980. [6] Durante la década de 1990, se utilizó la secuenciación de etiquetas de secuencia expresada para identificar genes y sus fragmentos. [7] A esto le siguieron técnicas como el análisis en serie de la expresión genética (SAGE), el análisis de la expresión genética (CAGE) y la secuenciación de firmas masivamente paralela (MPSS).
El transcriptoma comprende todos los transcritos de ácido ribonucleico (ARN) presentes en un organismo determinado o en una muestra experimental. [8] El ARN es el principal portador de información genética que es responsable del proceso de conversión del ADN en el fenotipo de un organismo. Un gen puede dar lugar a un ARN mensajero (ARNm) monocatenario a través de un proceso molecular conocido como transcripción ; este ARNm es complementario a la hebra de ADN de la que se originó. [6] La enzima ARN polimerasa II se une a la hebra de ADN molde y cataliza la adición de ribonucleótidos al extremo 3' de la secuencia en crecimiento del transcrito de ARNm. [9]
Para iniciar su función, la ARN polimerasa II necesita reconocer una secuencia promotora , ubicada aguas arriba (5') del gen. En eucariotas, este proceso está mediado por factores de transcripción , más notablemente el factor de transcripción II D (TFIID) que reconoce la caja TATA y ayuda en el posicionamiento de la ARN polimerasa en el sitio de inicio apropiado. Para finalizar la producción de la transcripción de ARN, la terminación tiene lugar generalmente a varios cientos de nucleótidos de distancia de la secuencia de terminación y se lleva a cabo la escisión. [9] Este proceso ocurre en el núcleo de una célula junto con el procesamiento del ARN por el cual las moléculas de ARNm se tapan , empalman y poliadenilan para aumentar su estabilidad antes de ser llevadas posteriormente al citoplasma. El ARNm da lugar a proteínas a través del proceso de traducción que tiene lugar en los ribosomas .
Casi todas las transcripciones funcionales se derivan de genes conocidos. Las únicas excepciones son una pequeña cantidad de transcripciones que podrían desempeñar un papel directo en la regulación de la expresión génica cerca de los promotores de genes conocidos. (Véase ARN potenciador ).
Los genes ocupan la mayor parte de los genomas procariotas, por lo que la mayor parte de sus genomas se transcriben. Muchos genomas eucariotas son muy grandes y los genes conocidos pueden ocupar solo una fracción del genoma. En los mamíferos, por ejemplo, los genes conocidos solo representan el 40-50% del genoma. [10] Sin embargo, las transcripciones identificadas a menudo se asignan a una fracción mucho mayor del genoma, lo que sugiere que el transcriptoma contiene transcripciones espurias que no provienen de genes. Se sabe que algunas de estas transcripciones no son funcionales porque se asignan a pseudogenes transcritos o transposones degenerativos y virus. Otras se asignan a regiones no identificadas del genoma que pueden ser ADN basura.
La transcripción espuria es muy común en eucariotas, especialmente en aquellos con genomas grandes que podrían contener una gran cantidad de ADN basura . [11] [12] [13] [14] Algunos científicos afirman que si una transcripción no ha sido asignada a un gen conocido, entonces la suposición predeterminada debe ser que es ARN basura hasta que se haya demostrado que es funcional. [11] [15] Esto significaría que gran parte del transcriptoma en especies con genomas grandes es probablemente ARN basura. (Véase ARN no codificante )
El transcriptoma incluye las transcripciones de genes codificantes de proteínas (ARNm más intrones), así como las transcripciones de genes no codificantes (ARN funcionales más intrones).
En el genoma humano, todos los genes se transcriben en ARN porque así se define el gen molecular (véase Gen ). El transcriptoma consta de regiones codificantes de ARNm más UTR no codificantes, intrones, ARN no codificantes y transcripciones no funcionales espurias.
Varios factores dificultan la determinación del contenido del transcriptoma, entre ellos el splicing alternativo , la edición de ARN y la transcripción alternativa, entre otros. [17] Además, las técnicas del transcriptoma son capaces de capturar la transcripción que se produce en una muestra en un momento determinado, aunque el contenido del transcriptoma puede cambiar durante la diferenciación. [6] Los principales objetivos de la transcriptómica son los siguientes: "catalogar todas las especies de transcripción, incluidos los ARNm, los ARN no codificantes y los ARN pequeños; determinar la estructura transcripcional de los genes, en términos de sus sitios de inicio, extremos 5′ y 3′, patrones de splicing y otras modificaciones postranscripcionales; y cuantificar los niveles de expresión cambiantes de cada transcripción durante el desarrollo y en diferentes condiciones". [1]
El término puede aplicarse al conjunto total de transcripciones en un organismo dado , o al subconjunto específico de transcripciones presentes en un tipo particular de célula. A diferencia del genoma , que es aproximadamente fijo para una línea celular dada (excluyendo mutaciones ), el transcriptoma puede variar con las condiciones ambientales externas. Debido a que incluye todas las transcripciones de ARNm en la célula, el transcriptoma refleja los genes que se expresan activamente en un momento dado, con la excepción de los fenómenos de degradación del ARNm como la atenuación transcripcional . El estudio de la transcriptómica (que incluye el perfil de expresión , el análisis de variantes de empalme , etc.), examina el nivel de expresión de los ARN en una población celular dada, a menudo centrándose en el ARNm, pero a veces incluyendo otros como los ARNt y los ARNs pequeños.
La transcriptómica es la ciencia cuantitativa que comprende la asignación de una lista de cadenas ("lecturas") al objeto ("transcripciones" en el genoma). Para calcular la fuerza de expresión, se cuenta la densidad de lecturas correspondientes a cada objeto. [18] Inicialmente, los transcriptomas se analizaron y estudiaron utilizando bibliotecas de etiquetas de secuencias expresadas y análisis serial y cap de expresión génica (SAGE).
En la actualidad, las dos principales técnicas transcriptómicas son los microarrays de ADN y el RNA-Seq . Ambas técnicas requieren el aislamiento del ARN mediante técnicas de extracción de ARN , seguido de su separación de otros componentes celulares y el enriquecimiento del ARNm. [19] [20]
Existen dos métodos generales para inferir secuencias de transcriptomas. Un enfoque asigna lecturas de secuencias a un genoma de referencia, ya sea del propio organismo (cuyo transcriptoma se está estudiando) o de una especie estrechamente relacionada. El otro enfoque, el ensamblaje de transcriptomas de novo , utiliza software para inferir transcripciones directamente a partir de lecturas de secuencias cortas y se utiliza en organismos con genomas que no están secuenciados. [21]
Los primeros estudios del transcriptoma se basaron en técnicas de microarrays (también conocidos como chips de ADN). Los microarrays consisten en capas delgadas de vidrio con puntos sobre los que se colocan oligonucleótidos , conocidos como "sondas"; cada punto contiene una secuencia de ADN conocida. [22]
Al realizar análisis de microarrays, se recolecta ARNm de una muestra de control y una muestra experimental, esta última generalmente representativa de una enfermedad. El ARN de interés se convierte en ADNc para aumentar su estabilidad y se marca con fluoróforos de dos colores, generalmente verde y rojo, para los dos grupos. El ADNc se extiende sobre la superficie del microarray donde se hibrida con oligonucleótidos en el chip y se utiliza un láser para escanearlo. La intensidad de fluorescencia en cada punto del microarray corresponde al nivel de expresión génica y, en función del color de los fluoróforos seleccionados, se puede determinar cuál de las muestras exhibe niveles más altos del ARNm de interés. [7]
Un microarray suele contener suficientes oligonucleótidos para representar todos los genes conocidos; sin embargo, los datos obtenidos mediante microarrays no proporcionan información sobre genes desconocidos. Durante la década de 2010, los microarrays fueron reemplazados casi por completo por técnicas de última generación que se basan en la secuenciación del ADN.
La secuenciación de ARN es una tecnología de secuenciación de última generación , por lo que requiere solo una pequeña cantidad de ARN y ningún conocimiento previo del genoma. [3] Permite el análisis tanto cualitativo como cuantitativo de las transcripciones de ARN; el primero permite el descubrimiento de nuevas transcripciones y el segundo una medida de las cantidades relativas de las transcripciones en una muestra. [16]
Los tres pasos principales de la secuenciación de transcriptomas de cualquier muestra biológica incluyen la purificación de ARN, la síntesis de una biblioteca de ARN o ADNc y la secuenciación de la biblioteca. [16] El proceso de purificación de ARN es diferente para ARN cortos y largos. [16] Este paso suele ir seguido de una evaluación de la calidad del ARN, con el fin de evitar contaminantes como el ADN o contaminantes técnicos relacionados con el procesamiento de la muestra. La calidad del ARN se mide mediante espectrometría UV con un pico de absorbancia de 260 nm. [23] La integridad del ARN también se puede analizar cuantitativamente comparando la relación y la intensidad del ARN 28S con el ARN 18S informados en la puntuación del Número de integridad del ARN (RIN). [23] Dado que el ARNm es la especie de interés y representa solo el 3% de su contenido total, la muestra de ARN debe tratarse para eliminar el ARNr y el ARNt y las transcripciones de ARN específicas de tejido. [23]
El paso de preparación de la biblioteca con el objetivo de producir fragmentos cortos de ADNc, comienza con la fragmentación del ARN a transcripciones de longitud entre 50 y 300 pares de bases . La fragmentación puede ser enzimática ( endonucleasas de ARN ), química (tampón de sal de trismagnesio, hidrólisis química ) o mecánica ( sonicación , nebulización). [24] La transcripción inversa se utiliza para convertir las plantillas de ARN en ADNc y se pueden utilizar tres métodos de cebado para lograrlo, incluido el oligo-DT, utilizando cebadores aleatorios o ligando oligos adaptadores especiales.
La transcripción también se puede estudiar a nivel de células individuales mediante la transcriptómica de células individuales . La secuenciación de ARN de células individuales (scRNA-seq) es una técnica desarrollada recientemente que permite el análisis del transcriptoma de células individuales, incluidas las bacterias . [25] Con la transcriptómica de células individuales, también se tienen en cuenta las subpoblaciones de tipos de células que constituyen el tejido de interés. [26] Este enfoque permite identificar si los cambios en las muestras experimentales se deben a cambios celulares fenotípicos en oposición a la proliferación, con la que un tipo de célula específico podría sobreexpresarse en la muestra. [27] Además, al evaluar la progresión celular a través de la diferenciación , los perfiles de expresión promedio solo pueden ordenar las células por tiempo en lugar de su etapa de desarrollo y, en consecuencia, no pueden mostrar tendencias en los niveles de expresión génica específicos de ciertas etapas. [28] Se han utilizado técnicas transcriptómicas de células individuales para caracterizar poblaciones de células raras, como células tumorales circulantes , células madre cancerosas en tumores sólidos y células madre embrionarias (ESC) en blastocistos de mamíferos . [29]
Aunque no existen técnicas estandarizadas para la transcriptómica de células individuales, es necesario realizar varios pasos. El primer paso incluye el aislamiento de las células, que se puede realizar mediante técnicas de bajo y alto rendimiento. A esto le sigue un paso de PCR cuantitativa y luego la secuenciación de ARN de células individuales, donde el ARN de interés se convierte en ADNc. Los avances más recientes en la transcriptómica de células individuales permiten la conservación de la localización tisular y subcelular mediante el criosección de cortes finos de tejidos y la secuenciación del transcriptoma en cada corte. Otra técnica permite la visualización de transcripciones individuales bajo un microscopio al tiempo que se conserva la información espacial de cada célula individual donde se expresan. [29]
Se han construido y anotado varias bases de datos de transcriptomas específicos de organismos para ayudar en la identificación de genes que se expresan de manera diferencial en distintas poblaciones de células.
La secuenciación de ARN está surgiendo (2013) como el método de elección para medir los transcriptomas de los organismos, aunque todavía se utiliza la técnica más antigua de microarreglos de ADN . [1] La secuenciación de ARN mide la transcripción de un gen específico convirtiendo ARN largos en una biblioteca de fragmentos de ADNc . Luego, los fragmentos de ADNc se secuencian utilizando tecnología de secuenciación de alto rendimiento y se alinean con un genoma o transcriptoma de referencia que luego se utiliza para crear un perfil de expresión de los genes. [1]
Los transcriptomas de las células madre y de las células cancerosas son de particular interés para los investigadores que buscan comprender los procesos de diferenciación celular y carcinogénesis . Se puede utilizar un proceso que utilice datos de secuenciación de ARN o de matrices de genes para rastrear los cambios genéticos que ocurren en las células madre y precursoras y requiere al menos tres datos de expresión génica independientes del tipo celular anterior y de las células maduras. [30]
El análisis de los transcriptomas de ovocitos y embriones humanos se utiliza para comprender los mecanismos moleculares y las vías de señalización que controlan el desarrollo embrionario temprano, y podría ser teóricamente una herramienta poderosa para hacer una selección adecuada de embriones en la fertilización in vitro . [ cita requerida ] Los análisis del contenido del transcriptoma de la placenta en el primer trimestre del embarazo en la fertilización in vitro y la transferencia de embriones (IVT-ET) revelaron diferencias en la expresión genética que se asocian con una mayor frecuencia de resultados perinatales adversos. Este conocimiento se puede utilizar para optimizar la práctica. [31] Los análisis del transcriptoma también se pueden utilizar para optimizar la criopreservación de ovocitos, al reducir las lesiones asociadas con el proceso. [32]
La transcriptómica es un campo emergente y en continuo crecimiento en el descubrimiento de biomarcadores para su uso en la evaluación de la seguridad de los medicamentos o la evaluación de riesgos químicos . [33]
Los transcriptomas también pueden utilizarse para inferir relaciones filogenéticas entre individuos o para detectar patrones evolutivos de conservación del transcriptoma. [34]
Se utilizaron análisis de transcriptoma para descubrir la incidencia de la transcripción antisentido, su papel en la expresión génica a través de la interacción con genes circundantes y su abundancia en diferentes cromosomas. [35] También se utilizó RNA-seq para mostrar cómo las isoformas de ARN, transcripciones derivadas del mismo gen pero con diferentes estructuras, pueden producir fenotipos complejos a partir de genomas limitados. [21]
El análisis del transcriptoma se ha utilizado para estudiar el proceso de evolución y diversificación de las especies vegetales. En 2014, se completó el Proyecto 1000 Genomas Vegetales en el que se secuenciaron los transcriptomas de 1.124 especies vegetales de las familias viridiplantae , glaucophyta y rhodophyta . Las secuencias codificantes de proteínas se compararon posteriormente para inferir relaciones filogenéticas entre plantas y caracterizar el momento de su diversificación en el proceso de evolución. [36] Los estudios del transcriptoma se han utilizado para caracterizar y cuantificar la expresión génica en polen maduro . Se encontró que los genes implicados en el metabolismo de la pared celular y el citoesqueleto estaban sobreexpresados. Los enfoques del transcriptoma también permitieron rastrear los cambios en la expresión génica a través de diferentes etapas de desarrollo del polen, que van desde la microspora hasta los granos de polen maduros; además, dichas etapas se podrían comparar entre especies de diferentes plantas, incluidas Arabidopsis , arroz y tabaco . [37]
De manera similar a otras tecnologías basadas en -ómicas , el análisis del transcriptoma permite un enfoque imparcial a la hora de validar hipótesis experimentalmente. Este enfoque también permite el descubrimiento de nuevos mediadores en las vías de señalización. [18] Al igual que con otras tecnologías basadas en -ómicas, el transcriptoma se puede analizar dentro del alcance de un enfoque multiómico . Es complementario a la metabolómica pero, a diferencia de la proteómica, no se puede establecer una asociación directa entre un transcrito y un metabolito .
Existen varios campos -oma que pueden considerarse subcategorías del transcriptoma. El exoma se diferencia del transcriptoma en que incluye solo aquellas moléculas de ARN que se encuentran en una población celular específica y, por lo general, incluye la cantidad o concentración de cada molécula de ARN además de las identidades moleculares. Además, el transcriptoma también se diferencia del translatoma , que es el conjunto de ARN que se traducen.
El término meioma se utiliza en genómica funcional para describir el transcriptoma meiótico o el conjunto de transcripciones de ARN producidas durante el proceso de meiosis . [38] La meiosis es una característica clave de los eucariotas que se reproducen sexualmente e implica el apareamiento de cromosomas homólogos , sinapsis y recombinación. Dado que la meiosis en la mayoría de los organismos ocurre en un corto período de tiempo, el perfil de transcripción meiótica es difícil debido al desafío del aislamiento (o enriquecimiento) de células meióticas ( meiocitos ). Al igual que con los análisis del transcriptoma, el meioma se puede estudiar a nivel de genoma completo utilizando técnicas transcriptómicas a gran escala. [39] El meioma ha sido bien caracterizado en sistemas de mamíferos y levaduras y algo menos extensamente caracterizado en plantas. [40]
El tanatotranscriptoma está formado por todos los transcritos de ARN que continúan expresándose o que comienzan a reexpresarse en los órganos internos de un cadáver entre 24 y 48 horas después de la muerte. Algunos genes incluyen aquellos que se inhiben después del desarrollo fetal . Si el tanatotranscriptoma está relacionado con el proceso de muerte celular programada ( apoptosis ), se lo puede denominar tanatotranscriptoma apoptótico. Los análisis del tanatotranscriptoma se utilizan en medicina forense . [41]
El mapeo de eQTL se puede utilizar para complementar la genómica con la transcriptómica; variantes genéticas a nivel de ADN y medidas de expresión genética a nivel de ARN. [42]
El transcriptoma puede verse como un subconjunto del proteoma , es decir, el conjunto completo de proteínas expresadas por un genoma.
Sin embargo, el análisis de los niveles relativos de expresión de ARNm puede complicarse por el hecho de que cambios relativamente pequeños en la expresión de ARNm pueden producir grandes cambios en la cantidad total de la proteína correspondiente presente en la célula. Un método de análisis, conocido como análisis de enriquecimiento del conjunto de genes , identifica redes de genes corregulados en lugar de genes individuales que están regulados al alza o a la baja en diferentes poblaciones de células. [1]
Aunque los estudios de microarrays pueden revelar las cantidades relativas de diferentes ARNm en la célula, los niveles de ARNm no son directamente proporcionales al nivel de expresión de las proteínas que codifican. [43] La cantidad de moléculas de proteína sintetizadas utilizando una molécula de ARNm dada como plantilla depende en gran medida de las características de iniciación de la traducción de la secuencia de ARNm; en particular, la capacidad de la secuencia de iniciación de la traducción es un determinante clave en el reclutamiento de ribosomas para la traducción de proteínas .
