La huella de masa peptídica ( PMF ), también conocida como huella de proteína , es una técnica analítica para la identificación de proteínas en la que la proteína desconocida de interés se escinde primero en péptidos más pequeños , cuyas masas absolutas se pueden medir con precisión con un espectrómetro de masas como MALDI-TOF. o ESI-TOF . [1] El método fue desarrollado en 1993 por varios grupos de forma independiente. [2] [3] [4] [5] [6] Las masas de péptidos se comparan con una base de datos que contiene secuencias de proteínas conocidas o incluso con el genoma. Esto se logra mediante el uso de programas informáticos que traducen el genoma conocido del organismo en proteínas, luego, teóricamente, cortan las proteínas en péptidos y calculan las masas absolutas de los péptidos de cada proteína. Luego comparan las masas de los péptidos de la proteína desconocida con las masas peptídicas teóricas de cada proteína codificada en el genoma. Los resultados se analizan estadísticamente para encontrar la mejor coincidencia.
La ventaja de este método es que sólo es necesario conocer las masas de los péptidos. Una desventaja es que la secuencia de proteínas tiene que estar presente en la base de datos de interés. Además, la mayoría de los algoritmos PMF suponen que los péptidos provienen de una única proteína. [7] La presencia de una mezcla puede complicar significativamente el análisis y potencialmente comprometer los resultados. Típico para la identificación de proteínas basada en PMF es el requisito de una proteína aislada. Las mezclas que exceden un número de 2 a 3 proteínas generalmente requieren el uso adicional de identificación de proteínas basada en MS/MS para lograr una especificidad de identificación suficiente. Por lo tanto, las muestras típicas de PMF son proteínas aisladas de electroforesis en gel bidimensional (geles 2D) o bandas de SDS-PAGE aisladas . Los análisis adicionales mediante MS/MS pueden ser directos, por ejemplo, análisis MALDI-TOF/TOF o análisis posteriores nanoLC-ESI-MS/MS de eluatos de manchas de gel. [7] [8]
Debido al largo y tedioso proceso de análisis de proteínas, se desarrolló la identificación de masas peptídicas. La degradación de Edman se utilizó en el análisis de proteínas y se necesitó casi una hora para analizar un residuo de aminoácido. [9] SDS-PAGE también se utilizó para separar proteínas en mezclas muy complejas, que también emplearon métodos de electrotransferencia y tinción. [10] Luego, las bandas se extraerían del gel y se secuenciarían automáticamente. Un problema recurrente en el proceso fue que las proteínas que interfieren también se purificarían con la proteína de interés. Las secuencias de estas proteínas interferentes se compilaron en lo que se conoció como la base de datos Dayhoff. [11] En última instancia, tener las secuencias de estos contaminantes proteicos conocidos en bases de datos disminuyó el tiempo del instrumento y los gastos involucrados en el análisis de proteínas.
Las muestras de proteínas pueden derivarse de SDS-PAGE [7] o HPLC de fase reversa y luego están sujetas a algunas modificaciones químicas. Los puentes disulfuro en las proteínas se reducen y los aminoácidos de cisteína se carbamidometilan químicamente o se acrilamidan durante la electroforesis en gel.
Luego las proteínas se cortan en varios fragmentos utilizando enzimas proteolíticas como tripsina , quimotripsina o Glu-C . Una proporción típica de muestra:proteasa es 50:1. La proteólisis normalmente se lleva a cabo durante la noche y los péptidos resultantes se extraen con acetonitrilo y se secan al vacío. Luego, los péptidos se disuelven en una pequeña cantidad de agua destilada o se concentran y purifican aún más y están listos para el análisis espectrométrico de masas.
La proteína digerida se puede analizar con diferentes tipos de espectrómetros de masas como el ESI-TOF o el MALDI-TOF . MALDI-TOF suele ser el instrumento preferido porque permite un alto rendimiento de muestras y se pueden analizar varias proteínas en un solo experimento, si se complementa con análisis MS/MS . LC/ESI-MS y CE/ESI-MS también son excelentes técnicas para la identificación de masas peptídicas. [12] [13]
Se pipetea una pequeña fracción del péptido (generalmente 1 microlitro o menos) sobre un objetivo MALDI y se agrega una sustancia química llamada matriz a la mezcla de péptidos. Las matrices comunes son el ácido sinapínico , el ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico y el ácido 2,3-dihidroxibenzoico . Las moléculas de la matriz son necesarias para la desorción de las moléculas peptídicas. Las moléculas de matriz y péptido cocristalizan en el objetivo MALDI y están listas para ser analizadas. Existe una técnica de preparación de muestras predominantemente MALDI-MS, a saber, la técnica de gotas secas. [14] El objetivo se inserta en la cámara de vacío del espectrómetro de masas y la desorción e ionización de los fragmentos polipeptídicos se inicia mediante un rayo láser pulsado que transfiere grandes cantidades de energía a las moléculas de la matriz. La transferencia de energía es suficiente para promover la ionización y la transición de las moléculas de la matriz y los péptidos de la fase sólida a la fase gaseosa. Los iones son acelerados en el campo eléctrico del espectrómetro de masas y vuelan hacia un detector de iones, donde se detecta su llegada como señal eléctrica. Su relación masa-carga es proporcional a su tiempo de vuelo (TOF) en el tubo de deriva y se puede calcular en consecuencia.
El acoplamiento de ESI con LC capilar puede separar péptidos de digestiones de proteínas y, al mismo tiempo, obtener sus masas moleculares. [15] La electroforesis capilar junto con ESI-MS es otra técnica; sin embargo, funciona mejor cuando se analizan pequeñas cantidades de proteínas. [13]
El análisis espectrométrico de masas produce una lista de pesos moleculares que a menudo se denomina lista de picos. Las masas de péptidos se comparan con bases de datos de proteínas como Swissprot , que contienen información sobre la secuencia de proteínas. El software realiza digestiones in silico de las proteínas de la base de datos con la misma enzima (por ejemplo, tripsina) utilizada en la reacción de escisión química. Luego se calcula la masa de estos péptidos y se compara con la lista de picos de masas medidas. Los resultados se analizan estadísticamente y las posibles coincidencias se devuelven en una tabla de resultados.