La huella de masa de péptidos ( PMF ), también conocida como huella de proteína , es una técnica analítica para la identificación de proteínas en la que la proteína desconocida de interés primero se escinde en péptidos más pequeños , cuyas masas absolutas se pueden medir con precisión con un espectrómetro de masas como MALDI-TOF o ESI-TOF . [1] El método fue desarrollado en 1993 por varios grupos de forma independiente. [2] [3] [4] [5] [6] Las masas de los péptidos se comparan con una base de datos que contiene secuencias de proteínas conocidas o incluso con el genoma. Esto se logra utilizando programas informáticos que traducen el genoma conocido del organismo en proteínas, luego cortan teóricamente las proteínas en péptidos y calculan las masas absolutas de los péptidos de cada proteína. Luego comparan las masas de los péptidos de la proteína desconocida con las masas teóricas de péptidos de cada proteína codificada en el genoma. Los resultados se analizan estadísticamente para encontrar la mejor coincidencia.
La ventaja de este método es que sólo se deben conocer las masas de los péptidos. Una desventaja es que la secuencia de la proteína tiene que estar presente en la base de datos de interés. Además, la mayoría de los algoritmos PMF suponen que los péptidos provienen de una sola proteína. [7] La presencia de una mezcla puede complicar significativamente el análisis y potencialmente comprometer los resultados. Un requisito típico para la identificación de proteínas basada en PMF es una proteína aislada. Las mezclas que exceden un número de 2-3 proteínas generalmente requieren el uso adicional de la identificación de proteínas basada en MS/MS para lograr una especificidad de identificación suficiente. Por lo tanto, las muestras típicas de PMF son proteínas aisladas de electroforesis en gel bidimensional (geles 2D) o bandas aisladas de SDS-PAGE . Los análisis adicionales por MS/MS pueden ser directos, por ejemplo, análisis MALDI-TOF/TOF o análisis nanoLC-ESI-MS/MS posterior de eluidos de puntos de gel. [7] [8]
Debido al largo y tedioso proceso de análisis de proteínas, se desarrolló la huella de masa de péptidos. Se utilizó la degradación de Edman en el análisis de proteínas y se requirió casi una hora para analizar un residuo de aminoácido. [9] También se utilizó SDS-PAGE para separar proteínas en mezclas muy complejas, que también emplearon métodos de electrotransferencia y tinción. [10] Luego, se extraían bandas del gel y se secuenciaban automáticamente. Un problema recurrente en el proceso era que las proteínas interferentes también se purificaban con la proteína de interés. Las secuencias de estas proteínas interferentes se compilaron en lo que se conoció como la base de datos Dayhoff. [11] En última instancia, tener las secuencias de estos contaminantes proteicos conocidos en bases de datos disminuyó el tiempo de instrumento y los gastos involucrados en el análisis de proteínas.
Las muestras de proteínas pueden obtenerse mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS [7] o HPLC en fase reversa , y luego se someten a algunas modificaciones químicas. Los puentes disulfuro en las proteínas se reducen y los aminoácidos de cisteína se carbamidometilan químicamente o se acrilamidan durante la electroforesis en gel.
A continuación, las proteínas se cortan en varios fragmentos utilizando enzimas proteolíticas como la tripsina , la quimotripsina o la Glu-C . Una proporción típica de muestra:proteasa es de 50:1. La proteólisis se lleva a cabo normalmente durante la noche y los péptidos resultantes se extraen con acetonitrilo y se secan al vacío. A continuación, los péptidos se disuelven en una pequeña cantidad de agua destilada o se concentran y purifican aún más y están listos para el análisis espectrométrico de masas.
La proteína digerida se puede analizar con diferentes tipos de espectrómetros de masas, como ESI-TOF o MALDI-TOF . MALDI-TOF suele ser el instrumento preferido porque permite un alto rendimiento de la muestra y se pueden analizar varias proteínas en un solo experimento, si se complementa con el análisis MS/MS . LC/ESI-MS y CE/ESI-MS también son excelentes técnicas para la identificación de masas de péptidos. [12] [13]
Una pequeña fracción del péptido (generalmente 1 microlitro o menos) se pipetea sobre un objetivo MALDI y se agrega un químico llamado matriz a la mezcla de péptidos. Las matrices comunes son el ácido sinapínico , el ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico y el ácido 2,3-dihidroxibenzoico . Las moléculas de la matriz son necesarias para la desorción de las moléculas de péptidos. Las moléculas de matriz y péptidos cocristalizan en el objetivo MALDI y están listas para ser analizadas. Existe una técnica de preparación de muestras predominantemente MALDI-MS, a saber, la técnica de gotas secas. [14] El objetivo se inserta en la cámara de vacío del espectrómetro de masas y la desorción e ionización de los fragmentos de polipéptidos se inicia mediante un rayo láser pulsado que transfiere altas cantidades de energía a las moléculas de la matriz. La transferencia de energía es suficiente para promover la ionización y la transición de las moléculas de la matriz y los péptidos de la fase sólida a la fase gaseosa. Los iones se aceleran en el campo eléctrico del espectrómetro de masas y vuelan hacia un detector de iones, donde su llegada se detecta como una señal eléctrica. Su relación masa-carga es proporcional a su tiempo de vuelo (TOF) en el tubo de deriva y se puede calcular en consecuencia.
La combinación de ESI con LC capilar permite separar péptidos de los digestos proteicos, obteniendo al mismo tiempo sus masas moleculares. [15] La electroforesis capilar combinada con ESI-MS es otra técnica; sin embargo, funciona mejor cuando se analizan pequeñas cantidades de proteínas. [13]
El análisis espectrométrico de masas produce una lista de pesos moleculares que a menudo se denomina lista de picos. Las masas de los péptidos se comparan con bases de datos de proteínas como Swissprot , que contienen información de la secuencia de proteínas. El software realiza digestos in silico de las proteínas de la base de datos con la misma enzima (por ejemplo, tripsina) utilizada en la reacción de escisión química. A continuación, se calcula la masa de estos péptidos y se compara con la lista de picos de masas medidas. Los resultados se analizan estadísticamente y las posibles coincidencias se devuelven en una tabla de resultados.