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Proteómica de escopeta

La proteómica de escopeta se refiere al uso de técnicas de proteómica ascendente para identificar proteínas en mezclas complejas mediante una combinación de cromatografía líquida de alto rendimiento combinada con espectrometría de masas . [1] [2] [3] [4] [5] [6] El nombre se deriva de la secuenciación de ADN de escopeta , que a su vez lleva el nombre del patrón de disparo casi aleatorio y de rápida expansión de una escopeta . El método más común de proteómica de escopeta comienza con la digestión de las proteínas de la mezcla y la separación de los péptidos resultantes mediante cromatografía líquida. Luego se utiliza espectrometría de masas en tándem para identificar los péptidos.

La proteómica dirigida que utiliza SRM y métodos de adquisición independientes de datos a menudo se consideran alternativas a la proteómica de escopeta en el campo de la proteómica ascendente . Mientras que la proteómica de escopeta utiliza una selección de iones precursores dependiente de los datos para generar escaneos de iones fragmentados, los métodos antes mencionados utilizan un método determinista para la adquisición de escaneos de iones fragmentados.

Historia

La proteómica de escopeta surgió de las dificultades de utilizar tecnologías anteriores para separar mezclas complejas. En 1975, O'Farrell y Klose describieron la electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional ( 2D-PAGE ) con la capacidad de resolver mezclas complejas de proteínas. [7] [8] El desarrollo de la ionización por desorción láser asistida por matriz ( MALDI ), la ionización por electropulverización ( ESI ) y la búsqueda en bases de datos continuaron haciendo crecer el campo de la proteómica. Sin embargo, estos métodos todavía tenían dificultades para identificar y separar proteínas de baja abundancia, proteínas aberrantes y proteínas de membrana. La proteómica de escopeta surgió como un método que podría resolver incluso estas proteínas. [5]

Ventajas

La proteómica de escopeta permite la identificación global de proteínas, así como la capacidad de perfilar sistemáticamente proteomas dinámicos. [9] También evita la modesta eficiencia de separación y la pobre sensibilidad espectral de masas asociadas con el análisis de proteínas intactas. [1]

Desventajas

El filtrado de exclusión dinámica que se utiliza a menudo en la proteómica de escopeta maximiza el número de proteínas identificadas a expensas del muestreo aleatorio. [10] Este problema puede verse exacerbado por el submuestreo inherente a la proteómica de escopeta. [11]

HPLC Agilent 1200
Espectrómetro de masas en tándem de tiempo de vuelo cuadrupolo (Q-TOF)

Flujo de trabajo

Se cultivan células que contienen el complemento proteico deseado. Luego se extraen las proteínas de la mezcla y se digieren con una proteasa para producir una mezcla de péptidos. [9] Luego, la mezcla de péptidos se carga directamente en una columna microcapilar y los péptidos se separan por hidrofobicidad y carga. A medida que los péptidos eluyen de la columna, se ionizan y separan m/z en la primera etapa de la espectrometría de masas en tándem . Los iones seleccionados sufren una disociación inducida por colisión u otro proceso para inducir la fragmentación. Los fragmentos cargados se separan en la segunda etapa de la espectrometría de masas en tándem.

La "huella digital" del espectro de masas de fragmentación de cada péptido se utiliza para identificar la proteína de la que derivan mediante la búsqueda en una base de datos de secuencias con software disponible comercialmente (por ejemplo, Sequest o Mascot ). [9] Ejemplos de bases de datos de secuencias son la base de datos Genpept o la base de datos PIR. [12] Después de la búsqueda en la base de datos, es necesario evaluar la validez de cada coincidencia de espectro de péptido (PSM). [13] Este análisis permite a los investigadores perfilar varios sistemas biológicos. [9]

Desafíos con la identificación de péptidos.

Los péptidos degenerados (compartidos por dos o más proteínas en la base de datos) dificultan la identificación inequívoca de la proteína a la que pertenecen. Además, algunas muestras de proteomas de vertebrados tienen una gran cantidad de parálogos , y el empalme alternativo en eucariotas superiores puede dar como resultado muchas subsecuencias de proteínas idénticas. [1] Además, muchas proteínas se modifican de forma natural (cotraduccional o postraduccional) o artificial (artefactos de preparación de muestras). Esto desafía aún más la identificación de la secuencia peptídica mediante enfoques convencionales de comparación de bases de datos. Junto con los espectros de fragmentación de péptidos de mala calidad o alta complejidad (debido al co-aislamiento o limitaciones de sensibilidad), esto deja en un experimento de proteómica de escopeta convencional muchos espectros de secuenciación sin identificar. [14] [15] [16] [17]

Aplicaciones prácticas

Una vez secuenciado el genoma humano, el siguiente paso es la verificación y anotación funcional de todos los genes predichos y sus productos proteicos. [4] La proteómica de escopeta se puede utilizar para la clasificación funcional o el análisis comparativo de estos productos proteicos. Se puede utilizar en proyectos que van desde el proteoma completo a gran escala hasta centrarse en una sola familia de proteínas. Se puede realizar en laboratorios de investigación o comercialmente.

Análisis a gran escala

Un ejemplo de esto es un estudio realizado por Washburn, Wolters y Yates en el que utilizaron proteómica de escopeta en el proteoma de una cepa de Saccharomyces cerevisiae cultivada hasta la fase media de registro. Pudieron detectar e identificar 1.484 proteínas, así como identificar proteínas que rara vez se ven en el análisis de proteomas, incluidas proteínas de baja abundancia como factores de transcripción y proteínas quinasas . También pudieron identificar 131 proteínas con tres o más dominios transmembrana previstos . [2]

familia de proteínas

Vaisar et al. utiliza proteómica de escopeta para implicar la inhibición de proteasas y la activación del complemento en las propiedades antiinflamatorias de las lipoproteínas de alta densidad . [18] En un estudio realizado por Lee et al., se observó un mayor nivel de expresión de hnRNP A2/B1 y Hsp90 en células de hepatoma humano HepG2 que en células de tipo salvaje. Esto llevó a una búsqueda de roles funcionales mediados en conjunto por estos dos acompañantes celulares multifuncionales. [19]

Ver también

Referencias

  1. ^ abc Alves P, Arnold RJ, Novotny MV, Radivojac P, Reilly JP, Tang H (2007). "Avance en la inferencia de proteínas a partir de la proteómica de escopeta utilizando la detectabilidad de péptidos". Simposio del Pacífico sobre biocomputación. Simposio del Pacífico sobre biocomputación : 409–20. PMID  17990506.
  2. ^ ab Washburn MP, Wolters D, Yates JR (marzo de 2001). "Análisis a gran escala del proteoma de levadura mediante tecnología de identificación de proteínas multidimensional". Biotecnología de la Naturaleza . 19 (3): 242–7. doi :10.1038/85686. PMID  11231557. S2CID  16796135.
  3. ^ Wolters DA, Washburn MP, Yates JR (diciembre de 2001). "Una tecnología automatizada de identificación de proteínas multidimensional para proteómica de escopeta". Química analítica . 73 (23): 5683–90. doi :10.1021/ac010617e. PMID  11774908.
  4. ^ ab Hu L, Ye M, Jiang X, Feng S, Zou H (agosto de 2007). "Avances en técnicas analíticas con guiones para el análisis de peptidomas y proteomas de escopeta: una revisión". Analytica Chimica Acta . 598 (2): 193–204. doi :10.1016/j.aca.2007.07.046. PMID  17719892.
  5. ^ ab Fournier ML, Gilmore JM, Martin-Brown SA, Washburn MP (agosto de 2007). "Proteómica de escopeta basada en separaciones multidimensionales". Reseñas químicas . 107 (8): 3654–86. doi :10.1021/cr068279a. PMID  17649983.
  6. ^ Nesvizhskii AI (2007). "Identificación de proteínas mediante espectrometría de masas en tándem y búsqueda en bases de datos de secuencias". Análisis de datos de espectrometría de masas en proteómica . Métodos Mol. Biol. vol. 367, págs. 87-119. doi :10.1385/1-59745-275-0:87. ISBN 978-1-59745-275-5. PMID  17185772.
  7. ^ O'Farrell PH (mayo de 1975). "Electroforesis bidimensional de proteínas de alta resolución". La Revista de Química Biológica . 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754 . PMID  236308. 
  8. ^ Klose J (1975). "Mapeo de proteínas mediante electroforesis y enfoque isoeléctrico combinados de tejidos de ratón. Un enfoque novedoso para probar mutaciones puntuales inducidas en mamíferos". Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi :10.1007/bf00281458. PMID  1093965. S2CID  30981877.
  9. ^ abcd Wu CC, MacCoss MJ (junio de 2002). "Proteómica de escopeta: herramientas para el análisis de sistemas biológicos complejos". Opinión actual en terapéutica molecular . 4 (3): 242–50. PMID  12139310.
  10. ^ Zhang B, VerBerkmoes NC, Langston MA, Uberbacher E, Hettich RL, Samatova NF (noviembre de 2006). "Detección de expresión de proteínas diferencial y correlacionada en proteómica de escopeta sin etiquetas". Revista de investigación del proteoma . 5 (11): 2909–18. doi :10.1021/pr0600273. PMID  17081042. S2CID  22254554.
  11. ^ Tolmachev AV, Monroe ME, Purvine SO, Moore RJ, Jaitly N, Adkins JN, et al. (noviembre de 2008). "Caracterización de estrategias para obtener identificaciones confiables en mediciones de proteómica ascendente utilizando instrumentos híbridos FTMS". Química analítica . 80 (22): 8514–25. doi :10.1021/ac801376g. PMC 2692492 . PMID  18855412. 
  12. ^ Eng JK, McCormack AL, Yates JR (noviembre de 1994). "Un enfoque para correlacionar datos espectrales de masas en tándem de péptidos con secuencias de aminoácidos en una base de datos de proteínas". Revista de la Sociedad Estadounidense de Espectrometría de Masas . 5 (11): 976–89. CiteSeerX 10.1.1.377.3188 . doi : 10.1016/1044-0305(94)80016-2 . PMID  24226387. S2CID  18413192. 
  13. ^ Cerqueira FR, Ferreira RS, Oliveira AP, Gomes AP, Ramos HJ, Graber A, Baumgartner C (1 de enero de 2012). "MUMAL: análisis multivariado en proteómica de escopeta mediante técnicas de aprendizaje automático". Genómica BMC . 13 (Suplemento 5): T4. doi : 10.1186/1471-2164-13-S5-S4 . PMC 3477001 . PMID  23095859. 
  14. ^ Griss J, Pérez-Riverol Y, Lewis S, Tabb DL, Dianes JA, Del-Toro N, et al. (Agosto de 2016). "Reconocer millones de espectros constantemente no identificados en cientos de conjuntos de datos de proteómica de escopeta". Métodos de la naturaleza . 13 (8): 651–656. doi :10.1038/nmeth.3902. PMC 4968634 . PMID  27493588. 
  15. ^ den Ridder M, Daran-Lapujade P, Pabst M (febrero de 2020). "Proteómica de escopeta: por qué son importantes miles de señales no identificadas". Investigación de levaduras FEMS . 20 (1). doi : 10.1093/femsyr/foz088 . PMID  31860055.
  16. ^ Michalski A, Cox J, Mann M (abril de 2011). "Más de 100.000 especies de péptidos detectables eluyen en ensayos de proteómica de escopeta única, pero la mayoría es inaccesible para LC-MS/MS dependiente de datos". Revista de investigación del proteoma . 10 (4): 1785–93. doi :10.1021/pr101060v. PMID  21309581.
  17. ^ Devabhaktuni A, Lin S, Zhang L, Swaminathan K, González CG, Olsson N, et al. (Abril de 2019). "TagGraph revela vastos paisajes de modificación de proteínas a partir de grandes conjuntos de datos de espectrometría de masas en tándem". Biotecnología de la Naturaleza . 37 (4): 469–479. doi :10.1038/s41587-019-0067-5. PMC 6447449 . PMID  30936560. 
  18. ^ Vaisar T, Pennathur S, Green PS, Gharib SA, Hoofnagle AN, Cheung MC y otros. (Marzo de 2007). "La proteómica de escopeta implica la inhibición de proteasas y la activación del complemento en las propiedades antiinflamatorias del HDL". La Revista de Investigación Clínica . 117 (3): 746–56. doi :10.1172/JCI26206. PMC 1804352 . PMID  17332893. 
  19. ^ Lee CL, Hsiao HH, Lin CW, Wu SP, Huang SY, Wu CY, et al. (Diciembre de 2003). "Enfoque estratégico de proteómica de escopeta para la construcción eficiente de un mapa de expresión de familias de proteínas específicas en líneas celulares de hepatoma". Proteómica . 3 (12): 2472–86. doi : 10.1002/pmic.200300586 . PMID  14673797. S2CID  24518852.

Otras lecturas

enlaces externos