Forma de electroforesis en gel utilizada para analizar proteínas.
Geles 2D (teñidos con Coomassie)En los laboratorios modernos se utilizan robots para aislar manchas de proteínas a partir de geles 2D.
La electroforesis en gel bidimensional , abreviada como electroforesis 2-DE o 2-D , es una forma de electroforesis en gel comúnmente utilizada para analizar proteínas . Las mezclas de proteínas se separan mediante dos propiedades en dos dimensiones en geles 2D. El 2-DE fue introducido por primera vez de forma independiente por O'Farrell [1] y Klose [2] en 1975.
Base para la separación
La electroforesis 2-D comienza con la electroforesis en la primera dimensión y luego separa las moléculas perpendicularmente de la primera para crear un electroferograma en la segunda dimensión. En la electroforesis en la primera dimensión, las moléculas se separan linealmente según su punto isoeléctrico. En la segunda dimensión, las moléculas se separan a 90 grados del primer electroferograma según la masa molecular. Dado que es poco probable que dos moléculas sean similares en dos propiedades distintas, las moléculas se separan más eficazmente en la electroforesis bidimensional que en la electroforesis unidimensional.
Las dos dimensiones en las que se separan las proteínas mediante esta técnica pueden ser el punto isoeléctrico , la masa del complejo proteico en estado nativo o la masa proteica .
La separación por punto isoeléctrico se llama enfoque isoeléctrico . De este modo, se aplica un gradiente de pH a un gel y se aplica un potencial eléctrico a través del gel, haciendo que un extremo sea más positivo que el otro. En todos los valores de pH distintos de su punto isoeléctrico, las proteínas estarán cargadas. Si tienen carga positiva, serán atraídos hacia el extremo más negativo del gel y si tienen carga negativa, serán atraídos hacia el extremo más positivo del gel. Las proteínas aplicadas en la primera dimensión se desplazarán a lo largo del gel y se acumularán en su punto isoeléctrico; es decir, el punto en el que la carga total de la proteína es 0 (una carga neutra).
La separación por masa de complejos proteicos se realiza mediante PAGE nativa , en la que las proteínas permanecen en su estado nativo y se separan en el campo eléctrico siguiendo su masa y la masa de sus complejos respectivamente. Para obtener una separación por tamaño y no por carga neta, como en IEF, se transfiere una carga adicional a las proteínas mediante el uso de azul brillante de Coomassie o dodecilsulfato de litio. El conocimiento del complejo proteico es importante para el análisis del funcionamiento de las proteínas en una célula , ya que las proteínas en su mayoría actúan juntas en complejos para ser completamente funcionales. El análisis de esta organización suborgánulo de la célula requiere técnicas que conserven el estado nativo de los complejos proteicos .
La separación solo por masa se logra comúnmente mediante SDS-PAGE . El SDS desnaturaliza las proteínas, rompe la mayoría de los complejos y aproximadamente iguala las relaciones masa-carga. SDS debe realizarse como la segunda dimensión perpendicular, ya que rompe complejos (haciendo imposible la PAGE nativa) e iguala las relaciones masa-carga (haciendo imposible el IEF).
Detectando proteínas
El resultado de esto es un gel con proteínas repartidas en su superficie. Luego, estas proteínas se pueden detectar mediante diversos medios, pero los tintes más utilizados son la tinción de plata y azul brillante de Coomassie. En el primer caso, se aplica un coloide de plata al gel. La plata se une a los grupos de cisteína dentro de la proteína. La plata se oscurece con la exposición a la luz ultravioleta. La cantidad de plata puede estar relacionada con la oscuridad y, por lo tanto, con la cantidad de proteína en un lugar determinado del gel. Esta medición sólo puede dar cantidades aproximadas, pero es adecuada para la mayoría de los propósitos. La tinción con plata es 100 veces más sensible que el azul brillante de Coomassie con un rango de linealidad 40 veces mayor. [3]
Otras moléculas además de las proteínas se pueden separar mediante electroforesis 2D. En los ensayos de superenrollamiento , el ADN enrollado se separa en la primera dimensión y se desnaturaliza mediante un intercalador de ADN (como el bromuro de etidio o la cloroquina , menos cancerígena ) en la segunda. Esto es comparable a la combinación de PAGE/SDS-PAGE nativa en la separación de proteínas.
Técnicas comunes
IPG-DALT
Una técnica común es utilizar un gradiente de pH inmovilizado (IPG) en la primera dimensión. Esta técnica se conoce como IPG-DALT . Primero se separa la muestra en gel IPG (que está disponible comercialmente) luego el gel se corta en rodajas para cada muestra que luego se equilibra en SDS-mercaptoetanol y se aplica a un gel SDS-PAGE para su resolución en la segunda dimensión. Normalmente, IPG-DALT no se utiliza para la cuantificación de proteínas debido a la pérdida de componentes de bajo peso molecular durante la transferencia al gel SDS-PAGE. [4]
Warping: Imágenes de dos geles de electroforesis 2D, superpuestos con Delta2D. La primera imagen está coloreada en naranja, la segunda en azul. Debido a las diferencias de carrera, los puntos correspondientes no se superponen.Deformación: Imágenes de dos geles de electroforesis 2D después de la deformación. La primera imagen está coloreada en naranja, la segunda en azul. Los puntos correspondientes se superponen después de la deformación. Las manchas comunes son de color negro, las manchas naranjas solo están presentes (o son mucho más fuertes) en la primera imagen, las manchas azules solo están presentes (o son mucho más fuertes) en la segunda imagen.
En proteómica cuantitativa , estas herramientas analizan principalmente biomarcadores cuantificando proteínas individuales y mostrando la separación entre uno o más "puntos" de proteínas en una imagen escaneada de un gel 2-DE. Además, estas herramientas hacen coincidir puntos entre geles de muestras similares para mostrar, por ejemplo, diferencias proteómicas entre las etapas tempranas y avanzadas de una enfermedad. Los paquetes de software incluyen Delta2D (descontinuado), ImageMaster (descontinuado), Melanie, PDQuest (descontinuado), SameSpots y REDFIN, entre otros. [ cita necesaria ] Si bien esta tecnología se utiliza ampliamente, la inteligencia no se ha perfeccionado. Por ejemplo, si bien PDQuest y SameSpots tienden a estar de acuerdo en la cuantificación y el análisis de puntos de proteínas bien definidos y separados, ofrecen diferentes resultados y tendencias de análisis con puntos menos definidos y menos separados. [5] Anteriormente se han publicado estudios comparativos para guiar a los investigadores sobre el "mejor" software para su análisis. [6] Aunque normalmente se utiliza para electroforesis en gel estándar , Sciugo también se puede utilizar para la creación y cuantificación de figuras.
Los desafíos para el análisis automático basado en software incluyen puntos incompletamente separados (superpuestos) (menos definidos o separados), puntos débiles/ruido (p. ej., "puntos fantasma"), diferencias de funcionamiento entre geles (p. ej., la proteína migra a diferentes posiciones en diferentes geles). ), puntos no coincidentes/no detectados, lo que genera valores faltantes , [7] [8] puntos no coincidentes, errores en la cuantificación (el software puede detectar erróneamente varios puntos distintos como un solo punto y partes de un punto pueden excluirse de la cuantificación) y diferencias en los algoritmos de software y, por lo tanto, tendencias de análisis.
Las listas de selección generadas se pueden utilizar para la digestión automatizada en gel de manchas de proteínas y la posterior identificación de las proteínas mediante espectrometría de masas . El análisis de espectrometría de masas puede identificar mediciones de masa precisas junto con la secuenciación de péptidos que oscilan entre 1000 y 4000 unidades de masa atómica. [9]
Para obtener una descripción general del enfoque actual para el análisis de software de imágenes de gel 2DE, consulte Berth et al. [10] o Bandow et al. [11]
^ O'Farrell, PH (1975). "Electroforesis bidimensional de proteínas de alta resolución". J. Biol. química . 250 (10): 4007–21. doi : 10.1016/S0021-9258(19)41496-8 . PMC 2874754 . PMID 236308.
^ Klose, J (1975). "Mapeo de proteínas mediante electroforesis y enfoque isoeléctrico combinados de tejidos de ratón. Un enfoque novedoso para probar mutaciones puntuales inducidas en mamíferos" . Humangenetik . 26 (3): 231–43. doi :10.1007/bf00281458. PMID 1093965. S2CID 30981877.
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^ Mikkelsen, Susan; Corton, Eduardo (2004). Química Bioanalítica . John Wiley & Sons, Inc. pág. 224.ISBN978-0-471-62386-1.
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^ ¿Qué son los valores faltantes y por qué son un problema?
^ Lepedda, Antonio J y Marilena Formato. "Aplicaciones de la tecnología de electroforesis bidimensional al estudio de la aterosclerosis". EJIFCC vol. 19,3 146–159. 20 de diciembre de 2008
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^ Bandow JE, Baker JD, Berth M, et al. (Agosto de 2008). "El flujo de trabajo de análisis de imágenes mejorado para geles 2D permite estudios proteómicos basados en geles 2D a gran escala: estudio de descubrimiento de biomarcadores de EPOC". Proteómica . 8 (15): 3030–41. doi :10.1002/pmic.200701184. PMID 18618493. S2CID 206361897.
