Proteómica de arriba hacia abajo

Proteómica de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba

La proteómica de arriba hacia abajo es un método de identificación de proteínas que utiliza un espectrómetro de masas con trampa de iones para almacenar un ion de proteína aislado para la medición de masa y el análisis de espectrometría de masas en tándem (MS/MS) ^{[1] [2]} u otros métodos de purificación de proteínas como la electroforesis en gel bidimensional junto con MS/MS. ^[3] La proteómica de arriba hacia abajo es capaz de identificar y cuantificar proteoformas únicas a través del análisis de proteínas intactas. ^[4] El nombre se deriva del enfoque similar a la secuenciación de ADN. ^[5] Durante la espectrometría de masas, las proteínas intactas normalmente se ionizan mediante ionización por electrospray y se atrapan en una resonancia ciclotrónica de iones de transformada de Fourier ( trampa de Penning ), ^[6] trampa de iones cuadrupolo (trampa de Paul) o espectrómetro de masas Orbitrap . La fragmentación para la espectrometría de masas en tándem se logra mediante disociación por captura de electrones o disociación por transferencia de electrones . El fraccionamiento eficaz es fundamental para el manejo de las muestras antes de la proteómica basada en espectrometría de masas. El análisis del proteoma implica rutinariamente la digestión de proteínas intactas seguida de la identificación de proteínas inferidas mediante espectrometría de masas (MS). ^[7] La ​​proteómica de MS de arriba hacia abajo (sin gel) interroga la estructura de las proteínas mediante la medición de una masa intacta seguida de la disociación iónica directa en la fase gaseosa. ^[8]

Ventajas

• Las principales ventajas del enfoque de arriba hacia abajo incluyen la capacidad de detectar productos de degradación, isoformas de proteínas , variantes de secuencia, combinaciones de modificaciones postraduccionales, así como procesos simplificados para la normalización y cuantificación de datos .
• La proteómica de arriba hacia abajo, cuando se acompaña de la electroforesis en gel de poliacrilamida, puede ayudar a complementar el enfoque proteómico de abajo hacia arriba. Los métodos proteómicos de arriba hacia abajo pueden ayudar a exponer grandes desviaciones de las predicciones y se han aplicado con mucho éxito combinando el fraccionamiento por elución en gel, la precipitación de proteínas y la HPLC de fase inversa con la ionización por electrospray y la espectrometría de masas/espectrometría de masas. ^[9]
• La caracterización de proteínas pequeñas representa un desafío significativo para la proteómica ascendente debido a la incapacidad de generar suficientes péptidos tripsídicos para el análisis. La proteómica descendente permite la detección de proteínas de baja masa, aumentando así el repertorio de proteínas conocidas. ^[10] Mientras que la proteómica ascendente integra productos escindidos de todas las proteoformas producidas por un gen en un único mapa peptídico del producto génico de longitud completa para tabular y cuantificar las proteínas expresadas, una de las principales fortalezas de la proteómica descendente es que permite a los investigadores rastrear cuantitativamente una o más proteoformas de múltiples muestras y escindir estas proteoformas para el análisis químico. ^[9]

Desventajas

• En el pasado reciente, el enfoque descendente se relegó al análisis de proteínas individuales o mezclas simples, mientras que las mezclas complejas y las proteínas se analizaron mediante métodos más establecidos, como la proteómica ascendente. Además, la identificación de proteínas y la caracterización de proteoformas en el enfoque TDP (proteómica descendente) pueden verse afectadas por un desafío de rango dinámico donde las mismas especies altamente abundantes se fragmentan repetidamente. ^[4]
• Aunque la proteómica de arriba hacia abajo se puede utilizar con un rendimiento relativamente alto para mapear con éxito la cobertura del proteoma a un gran nivel, la tasa de identificación de nuevas proteínas después de las rondas iniciales se reduce bastante drásticamente. ^[4]
• La interrogación proteómica de arriba hacia abajo puede superar los problemas de identificación de proteínas individuales, pero no se ha logrado a gran escala debido a la falta de métodos de fraccionamiento de proteínas intactas que estén integrados con la espectrometría de masas en tándem. ^[7]

Investigación y usos

Estudio uno: cuantificación e identificación de miles de proteoformas humanas por debajo de los 30 kDa

• Los investigadores realizaron un estudio de proteoformas humanas por debajo de 30 kDa y utilizaron fibroblastos humanos IMR90 primarios que contenían una construcción de función Ras que se cultivaron en un medio.
• Elegí utilizar la proteómica de arriba hacia abajo para caracterizar estas proteoformas porque actualmente es el mejor método para proteínas intactas; como comenté, la proteómica de abajo hacia arriba digiere la proteína y no hace un buen trabajo al proporcionar una imagen clara de proteoformas intactas distintas.
• La proteómica de arriba hacia abajo es capaz de identificar y cuantificar proteoformas únicas mediante el análisis de proteínas intactas. La cuantificación de arriba hacia abajo arrojó cambios en la abundancia de 1038 proteoformas citoplasmáticas. ^[4]

Estudio dos: combinación de espectrometría de masas MALDI-TOF de alto rendimiento y electroforesis en gel con enfoque isoeléctrico para la proteómica virtual 2D basada en gel

• Los investigadores utilizaron la proteómica de arriba hacia abajo porque podían identificar las proteoformas exactas de las proteínas intactas, en lugar del enfoque de abajo hacia arriba que proporciona iones fragmentados de péptidos.
• En este estudio se utilizó un gel 2D virtual junto con espectrometría de masas para separar mezclas de proteínas. MALDI es un software informático que genera las masas intactas de las proteínas en cada punto isoeléctrico. Comenzó con una imagen de una selección de gel IPG-IEF (enfoque isoeléctrico) que luego se analizó mediante MALDI. ^[9]
• La proteómica de arriba hacia abajo MALDI-TOF/TOF-MS es más tolerante a las impurezas, no requiere extracción, purificación ni separación de biomarcadores y se puede aplicar directamente a microorganismos intactos. ^[11]

Véase también

• Espectrometría de masas de proteínas
• Proteómica de abajo hacia arriba
• Proteómica de escopeta
• Espectrometría de masas en tándem (MS/MS)

Referencias

1. Sze SK, Ge Y, Oh H, McLafferty FW (2002). "Espectrometría de masas de arriba hacia abajo de una proteína de 29 kDa para la caracterización de cualquier modificación postraduccional dentro de un residuo". Proc. Natl. Sci. EE. UU . . 99 (4): 1774–9. Bibcode :2002PNAS...99.1774S. doi : 10.1073/pnas.251691898 . PMC  122269 . PMID  11842225.
2. Kelleher NL (2004). "Proteómica de arriba hacia abajo". Anal. Chem . 76 (11): 197A–203A. doi :10.1021/ac0415657. PMID  15190879.
3. Wright EP, Partridge MA, Padula MP, Gauci VJ, Malladi CS, Coorsen JR (2014). "Proteómica de arriba hacia abajo: mejora de la electroforesis en gel 2D desde el procesamiento de tejidos hasta la detección de proteínas de alta sensibilidad". Proteómica . 14 (7–8): 872–889. doi : 10.1002/pmic.201300424 . PMID  24452924. S2CID  29866065.
4. Durbin, Kenneth Robert; Fornelli, Luca; Fellers, Ryan T.; Doubleday, Peter F.; Narita, Masashi; Kelleher, Neil L. (2016). "Cuantificación e identificación de miles de proteoformas humanas por debajo de los 30 kDa". Revista de investigación del proteoma . 15 (3): 976–982. doi :10.1021/acs.jproteome.5b00997. PMC 4794255 . PMID  26795204. 
5. Smith CL, Cantor CR (1989). "Estrategias evolutivas para la elaboración de mapas físicos de cromosomas de mamíferos". Genoma . 31 (2): 1055–8. doi :10.1139/g89-181. PMID  2698822.
6. Bogdanov B, Smith RD (2005). "Proteómica mediante espectrometría de masas FTICR: de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba". Mass Spectrometry Reviews . 24 (2): 168–200. Bibcode :2005MSRv...24..168B. doi :10.1002/mas.20015. PMID  15389855.
7. Tran, John C.; Zamdborg, Leonid; Ahlf, Dorothy R.; Lee, Ji Eun; Catherman, Adam D.; Durbin, Kenneth R.; Tipton, Jeremiah D.; Vellaichamy, Adaikkalam; Kellie, John F. (8 de diciembre de 2011). "Mapeo de isoformas de proteínas intactas en modo de descubrimiento utilizando proteómica de arriba hacia abajo". Nature . 480 (7376): 254–258. Bibcode :2011Natur.480..254T. doi :10.1038/nature10575. ISSN  0028-0836. PMC 3237778 . PMID  22037311. 
8. Parks, Bryan A.; Jiang, Lihua; Thomas, Paul M.; Wenger, Craig D.; Roth, Michael J.; Boyne, Michael T.; Burke, Patricia V.; Kwast, Kurt E.; Kelleher, Neil L. (2007). "Proteómica de arriba hacia abajo en una escala de tiempo cromatográfica utilizando espectrómetros de masas híbridos con transformada de Fourier y trampa de iones lineal". Química analítica . 79 (21): 7984–7991. doi :10.1021/ac070553t. PMC 2361135 . PMID  17915963. 
9. Lohnes, Karen; Quebbemann, Neil R.; Liu, Kate; Kobzeff, Fred; Loo, Joseph A.; Ogorzalek Loo, Rachel R. (2016). "Combinación de espectrometría de masas MALDI-TOF de alto rendimiento y electroforesis en gel con enfoque isoeléctrico para proteómica virtual 2D basada en gel". Métodos . 104 : 163–169. doi :10.1016/j.ymeth.2016.01.013. PMC 4930893 . PMID  26826592. 
10. Lorenzatto, Karina R.; Kim, Kyunggon; Ntai, Ioanna; Paludo, Gabriela P.; Camargo de Lima, Jeferson; Thomas, Paul M.; Kelleher, Neil L.; Ferreira, Henrique B. (6 de noviembre de 2015). "La proteómica de arriba hacia abajo revela proteoformas maduras expresadas en fracciones subcelulares de la etapa preadulta de Echinococcus granulosus". Revista de investigación del proteoma . 14 (11): 4805–4814. doi :10.1021/acs.jproteome.5b00642. ISSN  1535-3907. PMC 4638118 . PMID  26465659. 
11. Demirev, Plamen A.; Feldman, Andrew B.; Kowalski, Paul; Lin, Jeffrey S. (2005). "Proteómica descendente para la identificación rápida de microorganismos intactos". Química analítica . 77 (22): 7455–7461. doi :10.1021/ac051419g. PMID  16285700.

Bibliografía

• Borchers CH, Thapar R, Petrotchenko EV, et al. (2006). "La proteómica combinada de arriba hacia abajo y de abajo hacia arriba identifica un sitio de fosforilación en proteínas de unión a tallo-bucle que contribuye a la unión de ARN de alta afinidad". Proc. Natl. Sci. EE. UU . . 103 (9): 3094–9. Bibcode :2006PNAS..103.3094B. doi : 10.1073/pnas.0511289103 . PMC  1413926 . PMID  16492733.
• Han X, Jin M, Breuker K, McLafferty FW (2006). "Extensión de la espectrometría de masas de arriba hacia abajo a proteínas con masas superiores a 200 kilodaltons". Science . 314 (5796): 109–12. Bibcode :2006Sci...314..109H. doi :10.1126/science.1128868. PMID  17023655. S2CID  39929757.
• Whitelegge J, Halgand F, Souda P, Zabrouskov V (2006). "Espectrometría de masas de arriba hacia abajo de proteínas integrales de membrana". Expert Review of Proteomics . 3 (6): 585–96. doi :10.1586/14789450.3.6.585. PMID  17181473. S2CID  21563381.