El nitrógeno asimilable por levadura o YAN es la combinación de nitrógeno amino libre (FAN), amoníaco (NH 3 ) y amonio (NH 4 + ) que está disponible para que una levadura, por ejemplo, la levadura de vino Saccharomyces cerevisiae , la utilice durante la fermentación . Aparte de los azúcares fermentables, la glucosa y la fructosa , el nitrógeno es el nutriente más importante necesario para llevar a cabo una fermentación exitosa que no termina antes del punto de sequedad previsto ni produce el desarrollo de malos olores y fallas relacionadas con el vino . En este sentido, los enólogos suelen complementar los recursos de YAN disponibles con aditivos de nitrógeno como el fosfato diamónico (DAP). [1]
Sin embargo, la adición de cantidades excesivas de nitrógeno también puede crear un peligro, ya que otros organismos, además de la levadura de vino beneficiosa, pueden utilizar los nutrientes. Entre ellos se incluyen organismos perjudiciales como Brettanomyces , Acetobacter y bacterias del ácido láctico de los géneros Lactobacillus y Pediococcus . Esta es la razón por la que muchas bodegas medirán el YAN después de la cosecha y la trituración utilizando uno de los varios métodos disponibles en la actualidad, incluido el ensayo de nitrógeno mediante o-ftaldialdehído (NOPA), que requiere el uso de un espectrómetro o el método de titulación con formol . Conocer el YAN en el mosto permite a los enólogos calcular la cantidad correcta de aditivo necesario para completar la fermentación, dejando sólo un "desierto de nutrientes" para los organismos de descomposición que se produzcan después. [2]
La cantidad de YAN que los enólogos verán en sus mostos de uva depende de una serie de componentes que incluyen la variedad de uva , el portainjerto , los suelos de los viñedos y las prácticas vitícolas (como el uso de fertilizantes y el manejo de la copa ), así como de las condiciones climáticas de cosechas particulares . [3]
YAN es una medida de las fuentes primarias de nitrógeno orgánicas (aminoácidos libres) e inorgánicas (amoniaco y amonio) que pueden ser asimiladas por S. cerevisiae . Hay varios compuestos nitrogenados que se encuentran en el mosto y el vino, incluidos péptidos , proteínas más grandes , amidas , aminas biogénicas , piridinas , purinas y ácidos nucleicos , pero la levadura no puede utilizarlos directamente para el metabolismo. En conjunto, el contenido total de nitrógeno del mosto de uva puede oscilar entre 60 y 2400 mg de nitrógeno por litro, aunque no todo este nitrógeno será asimilable. [1] La falta de enzimas proteasas , que descomponen los péptidos más grandes en componentes más pequeños, que pueden funcionar fuera de la célula, limita el tamaño de las moléculas que la levadura puede utilizar como fuente de nitrógeno. [3] [4]
La cantidad de YAN que los enólogos verán en sus mostos de uva depende de una serie de componentes que incluyen la variedad de uva, el portainjerto, los suelos de los viñedos y las prácticas vitícolas (como el uso de fertilizantes y el manejo de la cubierta vegetal), así como de las condiciones climáticas de cosechas particulares. Las infecciones por moho, como Botrytis cinerea (conocida como podredumbre noble cuando se desea) pueden reducir el contenido de aminoácidos del mosto de uva hasta en un 61%. [1] Algunas regiones se caracterizan por tener un YAN bajo, como el estado de Washington , que durante una cosecha típica tendrá el 90 % del mosto analizado por debajo de 400 mg N/L [5] y casi una cuarta parte estará por debajo de 150 mg N/L. [2]
En el viñedo, el nitrógeno es absorbido por la vid en forma de nitrato (NO 3 − ), amonio o urea que se reduce a amoníaco. Mediante reacciones adicionales, el nitrógeno se incorpora a la glutamina y al glutamato y, finalmente, se utiliza en la síntesis de otros aminoácidos y compuestos nitrogenados. [1] Después de la cosecha, la mayoría (alrededor del 80%) de los compuestos nitrogenados disponibles que se encuentran en las uvas se concentran en los hollejos y las semillas. Estos compuestos se liberan en el mosto durante el proceso de estrujado y durante la maceración /contacto hollejo. [4] Incluso después del prensado, hasta el 80% del contenido inicial de nitrógeno dentro de cada baya de uva quedará en el orujo . [3]
Del nitrógeno amino libre (FAN) que compone el YAN, los aminoácidos arginina , prolina y glutamina son los más abundantes, seguidos de alanina , treonina , serina y ácido aspártico en concentraciones mucho más pequeñas [1] , aunque son trazas de los aminoácidos más conocidos. se puede encontrar en el mosto de uva. [2] La prolina suele ser la más concentrada y puede representar hasta el 30% de la cantidad total de aminoácidos. [4] La cantidad exacta de FAN variará y puede oscilar entre 22 y 1242 mg de nitrógeno/litro de YAN derivado de aminoácidos libres. [5]
Mientras que la arginina, la glutamina y otros aminoácidos se consumen rápidamente, a menudo muy temprano en la fermentación, la levadura no consume prolina en absoluto durante las condiciones anaeróbicas normales de las fermentaciones. Esto se debe a que una de las enzimas requeridas para su uso es una oxidasa (que requiere oxígeno molecular) y la otra está reprimida por la presencia de amonio (otra fuente de nitrógeno asimilable que necesita la levadura) en el mosto. Sin embargo, los cultivos iniciadores bien aireados que contienen mosto al que no se le ha agregado fosfato diamónico generalmente verán cierta utilización de prolina antes de que se activen las condiciones anaeróbicas de la fermentación. [1] Cuando los enólogos miden FAN, deben estar conscientes si su análisis incluye prolina, ya que esto aumentará su medición de YAN. Chardonnay y Cabernet Sauvignon son dos variedades de Vitis vinifera que se sabe que tienen niveles muy altos de prolina, mientras que Riesling y Sauvignon blanc suelen tener niveles muy bajos. [4]
La levadura transporta aminoácidos y péptidos pequeños (menos de 5 residuos de aminoácidos ) al interior de la célula mediante un proceso de transporte activo que utiliza proteínas de membrana especializadas y la diferencia en el gradiente de pH de la solución ácida de vino (pH entre 3-4) y el cercano. pH neutro del citoplasma dentro de las células de levadura. Las proteínas simportadoras de protones en la membrana absorben el aminoácido junto con un ion de hidrógeno que luego es expulsado por la célula a través de una bomba de ion de hidrógeno . Este es un proceso dependiente de la energía que se vuelve más desfavorable desde el punto de vista energético para la célula de levadura a medida que avanza la fermentación y aumentan los niveles de etanol, creando una "fuga pasiva" de exceso de iones de hidrógeno hacia la célula. Las bombas de iones de hidrógeno de la célula tienen que trabajar aún más para mantener su pH interno, de modo que envíe una señal a las proteínas simportadoras para que dejen de transportar otros iones. Esta es una de las razones por las que las adiciones tardías de nitrógeno en la fermentación tienen poca o ninguna eficacia ya que se desactivan los mecanismos de transporte de nitrógeno al interior de la célula. [4]
Durante toda la fermentación, el amonio es la principal forma de nitrógeno asimilable disponible para la levadura. [1] Sin embargo, al triturar el jugo puede contener entre 0 y 150 mg/L de sales de amonio, dependiendo de la cantidad de nitrógeno que recibió la vid en el viñedo. [4]
En la célula, los iones inorgánicos de amoníaco y amonio se "fijan" mediante una serie de reacciones químicas que finalmente producen la fuente de nitrógeno orgánico glutamato. [2] El ion amonio también sirve como regulador alostérico para una de las enzimas utilizadas en la glucólisis y también puede tener un efecto sobre cómo la célula de levadura transporta glucosa y fructosa al interior de la célula. [4] Se ha demostrado que las proteínas utilizadas en el principal sistema de transporte de glucosa tienen una vida media de 12 horas. En los estudios que sometieron a las células de levadura a una "falta de amoníaco", todo el sistema se apagó después de 50 horas, lo que proporciona una fuerte evidencia de que la falta de amoníaco/amonio puede crear un mayor riesgo de tener una fermentación parada. [3]
El glutatión (GSH: L-gamma-glutamil-L-cisteinilglicina) está presente en altas concentraciones de hasta 10 mM en las células de levadura. Asume un papel fundamental en respuesta a la falta de azufre y nitrógeno. [6]
El amoníaco no es utilizado por bacterias como Acetobacter y las bacterias del ácido láctico utilizadas en la fermentación maloláctica . [2]
El nitrógeno asimilable es un nutriente esencial que necesita la levadura del vino para completar completamente la fermentación con una cantidad mínima de subproductos indeseables (como compuestos como el sulfuro de hidrógeno que pueden crear olores desagradables). En el transcurso de una fermentación, la levadura puede utilizar hasta 1000 mg/L de aminoácidos, aunque a menudo es mucho menos de la cantidad necesaria. [2] La levadura puede almacenar aminoácidos en vacuolas intracelulares y luego usarlos directamente, incorporándolos a proteínas, o descomponerlos y usar sus componentes de carbono y nitrógeno por separado. [4]
En ausencia de nitrógeno, la levadura comenzará a apagarse y morir. Algunas cepas comenzarán a descomponer aminoácidos que contienen azufre, como cisteína y metionina , liberando un átomo de azufre que puede combinarse con hidrógeno para producir sulfuro de hidrógeno ( H) .
2S ) que puede impartir olor a huevo podrido al vino. Sin embargo, no existe una correlación directa entre los niveles de YAN y la producción de sulfuro de hidrógeno, ya que la levadura puede producir H 2 S incluso en presencia de abundante nitrógeno, pero en cambio faltan otros nutrientes vitales (como la vitamina ácido pantoténico ). Incluso hay algunas cepas de S. cerevisiae que producen H 2 S como respuesta a tener demasiado nitrógeno disponible (particularmente demasiado ácido glutámico y alanina [3] ). Esta es la razón por la cual un enfoque profiláctico de agregar indiscriminadamente suplementos de nitrógeno a cada fermentación puede no tener los resultados deseados para prevenir el H 2 S. [2]
Los niveles de nitrógeno en el vino pueden influir en muchos aspectos sensoriales del vino resultante, incluida la síntesis de muchos compuestos aromáticos. Los alcoholes fusel se obtienen mediante la degradación de aminoácidos, aunque en presencia de altos niveles de amoníaco y urea su producción se reduce. Cuando el nitrógeno disponible es limitado, los niveles de glicerol y trehalosa , que pueden influir en la sensación en boca , son más altos. [3]
La cantidad de YAN necesaria dependerá de cuáles sean los objetivos del enólogo para la fermentación, particularmente si se desea o no una fermentación salvaje o si el vino se fermentará completamente hasta secarse. El estado de la uva y las condiciones de fermentación influirán en la cantidad de nitrógeno necesaria. Las frutas dañadas, mohosas o infectadas con botrytis generalmente tendrán más nitrógeno (así como otros recursos vitamínicos) cuando llegan del viñedo que las uvas limpias e intactas. Este agotamiento puede verse exacerbado aún más por una clarificación excesiva del mosto y un alto contenido de azúcar. Los vinos fermentados a temperaturas más altas tienden a progresar a un ritmo más rápido y requieren más nitrógeno que una fermentación más larga y fría. Además, la cantidad de exposición al oxígeno influirá en la tasa de absorción de nitrógeno por parte de la levadura con vino fermentado en condiciones anaeróbicas completas (como muchos vinos blancos en tanques de acero inoxidable) que requieren menos nitrógeno que los vinos fermentados en barricas o fermentadores abiertos. [7]
El rango sugerido por los enólogos varía de 150 mg/L YAN [8] a 400 mg de nitrógeno por litro. [9] Algunos estudios han demostrado que se pueden lograr tasas máximas de fermentación con YAN en el rango de 400 a 500 mg N/L. [10] Sin embargo, no todos los enólogos querrán tener una fermentación al máximo (en términos de biomasa de levadura, temperatura y velocidad) debido al impacto que puede tener en otros aspectos sensoriales del vino, como el desarrollo del aroma y la fruta. retención. [3]
Un estudio realizado por el Departamento de Viticultura y Enología de UC Davis encontró que las recomendaciones sobre los niveles óptimos de nitrógeno para completar una fermentación exitosa podrían basarse en el nivel Brix de cosecha que han sido adoptados por muchos fabricantes de levaduras y nutrientes. [11] [12]
Sin embargo, otros estudios han demostrado que se realiza una fermentación exitosa con niveles de YAN por debajo de estas recomendaciones, así como fermentaciones lentas o estancadas que ocurren incluso cuando los niveles de YAN están en línea con las recomendaciones. [1]
Al igual que las levaduras, las bacterias lácticas (BAL) utilizadas en la fermentación maloláctica (generalmente Oenococcus oeni ) requieren nitrógeno. Sin embargo, a diferencia de S. cerevisiae , las BAL no pueden utilizar amoníaco y adiciones como el fosfato diamónico (DAP) no ofrecen beneficios nutricionales. Los enólogos que inadvertidamente utilizan DAP como aditivo nutritivo para su inoculación de FML corren el riesgo de proporcionar nutrientes a organismos de descomposición como Brettanomyces . [2]
Si bien algunos enólogos inoculan sus BAL con nutrientes que incluyen nitrógeno, la mayoría de los nutrientes necesarios para la FML provienen de la descomposición (o autólisis ) de las células de levadura muertas. Además, la mayoría de las bacterias utilizadas en la FML tienen la capacidad de producir enzimas proteasas extracelulares que también pueden descomponer cadenas peptídicas más grandes en sus residuos de aminoácidos básicos que luego pueden usarse para el metabolismo. [4]
El ensayo de nitrógeno mediante o-ftaldialdehído (NOPA) se utiliza para medir los aminoácidos primarios disponibles en el jugo de uva utilizando un espectrofotómetro que puede medir longitudes de onda de 335 nm . Dado que el ensayo solo mide aminoácidos primarios, los resultados no incluirán concentraciones de prolina o amoníaco. [13] La prolina se puede medir por separado con un ensayo que utiliza ninhidrina para reaccionar con el aminoácido en presencia de ácido fórmico , produciendo un compuesto que puede absorberse a 517 nm. [1]
La valoración con formol , inventada por el químico danés SPL Sørensen en 1907, utiliza formaldehído en presencia de hidróxido de potasio o sodio para medir la concentración de aminoácidos y amoníaco con la ayuda de un medidor de pH . Los reactivos también reaccionarán con la prolina, lo que puede dar una medición de YAN ligeramente mayor que la de NOPA. [14] El método formal también tiene las desventajas de implicar el uso y eliminación de formaldehído, que es un carcinógeno conocido [15] y el reactivo altamente tóxico cloruro de bario . [1]
El amoníaco y el amonio se pueden medir utilizando una sonda de electrodo de iones selectivos y un medidor de pH. [1]
Los enólogos saben desde hace mucho tiempo que algunas fermentaciones eran más predecibles y "más saludables" si se añadía al lote orujo (las pieles sólidas, semillas y restos que quedan después del prensado ) de otro vino. Este es un método que todavía se utiliza hoy en día para elaborar el vino italiano Ripasso . En la Toscana del siglo XIV , la técnica de gobierno utilizada en algunos de los primeros Chiantis implicaba añadir uvas pasas al lote. [16] Si bien eso también agregó azúcar, ambos métodos proporcionaron nitrógeno adicional y otros nutrientes aún disponibles en la piel y las semillas. [17]
A medida que los enólogos comenzaron a comprender mejor la ciencia de la fermentación, el nitrógeno fue identificado como el principal nutriente y los enólogos ya en el siglo XX comenzaron a agregar sales de amonio a su mosto. [4] La urea también se utilizó como uno de los primeros suplementos de nitrógeno, pero la investigación que la vincula con el desarrollo del carbamato de etilo ha llevado a su prohibición en muchos países, incluido Estados Unidos, desde 1990. [2] [18] [19]
Hay muchos tipos de suplementos de nitrógeno disponibles para que los utilicen los enólogos. La mayoría de ellos son formulaciones complejas que incluyen nitrógeno (de aminoácidos o sales de amonio) junto con vitaminas, minerales y otros factores de crecimiento y se venden bajo marcas como Go-Ferm , Superfood , Fermaid K (las dos últimas también contienen algo de DAP). . [2] Los aminoácidos se pueden agregar directamente al mosto, aunque a partir de 2010 solo se permite agregar glicina al mosto en los Estados Unidos. [4]
Las cáscaras de levadura (o fantasmas de levadura) son los restos de las paredes celulares de levadura que quedan de la producción comercial de cepas de levadura que se utilizan para la inoculación. Además de proporcionar una fuente de nitrógeno asimilable a partir de aminoácidos, también proporcionan lípidos y esteroles que las células pueden utilizar para fortalecer su membrana plasmática, permitiendo la absorción de otras fuentes de nitrógeno. [2]
Los suplementos de nitrógeno, particularmente DAP, estimulan la reproducción de la levadura y pueden aumentar considerablemente la biomasa. Esto podría tener como consecuencia acelerar la velocidad de fermentación más rápido de lo que un enólogo podría desear y también aumentará la temperatura de fermentación debido al calor generado por la levadura. El exceso de biomasa también puede crear una escasez de otros nutrientes de la levadura, como vitaminas y esteroles, debido al aumento de la competencia y puede provocar la producción de malos olores (como el sulfuro de hidrógeno) e incluso fermentaciones estancadas. [1]
Los niveles excesivos del aminoácido arginina (más de 400 mg/L), especialmente cerca del final de la fermentación, pueden suponer un riesgo de aumentar la producción de carbamato de etilo. Esto se debe a que la arginina se descompone en urea, que puede ser reabsorbida y utilizada por la levadura o metabolizada en amoníaco. Sin embargo, la urea también reacciona con el etanol si no se metaboliza completamente, lo que, junto con la exposición prolongada (así como las altas temperaturas), puede conducir a la producción del éster carbamato de etilo. [1]
Sin embargo, el mayor riesgo de suplementar excesivamente un mosto es que el exceso de nitrógeno y otros nutrientes queden atrás una vez completada la fermentación. Esto puede crear inestabilidad microbiana ya que los organismos de descomposición pueden utilizar este exceso de nutrientes. [3]
En los Estados Unidos, la Oficina de Comercio e Impuestos sobre el Alcohol y el Tabaco (TTB) limita el uso de fosfato diamónico como aditivo de nitrógeno a 968 mg/L (8 lbs/1000 gal), lo que proporciona 203 mg N/L de YAN. En la Unión Europea , la mayoría de los países siguen las directrices de la Organización Internacional de la Viña y el Vino (OIV) que dicta un límite de 300 mg/L. En Australia , el límite se basa en el nivel de fosfato inorgánico con un límite máximo permitido de 400 mg/L de fosfato. [2]
Como la mayoría de los suplementos nutricionales alimentan a todos los microorganismos vivos en el mosto (ya sean deseables o no), los enólogos a menudo esperan para agregar los nutrientes hasta que estén listos para inocular el mosto con la cepa de S. cerevisiae deseada . Los productores que utilizan fermentos silvestres también pueden esperar hasta que las adiciones de dióxido de azufre hayan eliminado los microbios no deseados o se alimenten temprano porque les gustaría conocer la complejidad potencial que otros microbios podrían agregar al vino. Cuando se agrega, el nitrógeno suele estar en forma de aminoácidos, combinados con vitaminas y minerales para ayudar a iniciar la fermentación. [2]
Poco después de la inoculación, la levadura comienza a consumir rápidamente el nitrógeno asimilable disponible y hasta un 46% de YAN se consume por completo al inicio de la fermentación completa. [1] Debido a que el nitrógeno inorgánico, como las sales de amonio en DAP, son tóxicos para la levadura en niveles altos, nunca se agrega durante la inoculación cuando la biomasa de la levadura recién rehidratada es baja. Muchos enólogos dividen la dosis de DAP y la primera adición se realiza al final de la fase de latencia , cuando la levadura entra en su período de crecimiento exponencial y comienza la fermentación alcohólica. En la mayoría de los mostos, esto ocurre entre 48 y 72 horas después de la inoculación. Luego, a menudo se agrega una segunda dosis alrededor de un tercio del proceso de fermentación del azúcar y, a menudo, antes de que los niveles de azúcar alcancen 12-10 Brix (6,5 a 5,5 Baumé, 48,3 a 40,0 Oechsle) porque a medida que avanza la fermentación, las células de levadura ya no son capaces de llevar el nitrógeno a la célula debido a la creciente toxicidad del etanol que rodea las células. Esto deja el nitrógeno sin utilizar y disponible para los organismos de descomposición que puedan surgir después. [2] [3]
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