La microscopía electrónica de transmisión ( TEM ) es una técnica de microscopía en la que se transmite un haz de electrones a través de una muestra para formar una imagen. La muestra suele ser una sección ultrafina de menos de 100 nm de espesor o una suspensión en una rejilla. Se forma una imagen a partir de la interacción de los electrones con la muestra a medida que el haz se transmite a través de la muestra. Luego, la imagen se amplía y se enfoca en un dispositivo de imágenes, como una pantalla fluorescente , una capa de película fotográfica o un detector como un centelleador conectado a un dispositivo de carga acoplada o un detector de electrones directo.
Los microscopios electrónicos de transmisión son capaces de obtener imágenes con una resolución significativamente mayor que los microscopios ópticos , debido a la menor longitud de onda de De Broglie de los electrones. Esto permite que el instrumento capture detalles finos, incluso tan pequeños como una sola columna de átomos, que es miles de veces más pequeña que un objeto resoluble visto con un microscopio óptico. La microscopía electrónica de transmisión es un método analítico importante en las ciencias físicas, químicas y biológicas. Los TEM encuentran aplicación en la investigación del cáncer , la virología y la ciencia de materiales , así como en la investigación de la contaminación , la nanotecnología y los semiconductores , pero también en otros campos como la paleontología y la palinología .
Los instrumentos TEM tienen múltiples modos de funcionamiento que incluyen imágenes convencionales, imágenes TEM de escaneo (STEM), difracción, espectroscopia y combinaciones de estos. Incluso dentro de las imágenes convencionales, existen muchas formas fundamentalmente diferentes de producir contraste, llamadas "mecanismos de contraste de imagen". El contraste puede surgir de diferencias entre posiciones en el espesor o densidad ("contraste masa-espesor"), número atómico ("contraste Z", en referencia a la abreviatura común Z para número atómico), estructura u orientación cristalina ("contraste cristalográfico"). contraste" o "contraste de difracción"), los ligeros cambios de fase mecánico-cuánticos que los átomos individuales producen en los electrones que los atraviesan ("contraste de fases"), la energía perdida por los electrones al pasar a través de la muestra ("imagen del espectro") y más. Cada mecanismo proporciona al usuario un tipo diferente de información, dependiendo no sólo del mecanismo de contraste sino también de cómo se utiliza el microscopio: los ajustes de las lentes, las aperturas y los detectores. Lo que esto significa es que un TEM es capaz de devolver una extraordinaria variedad de información de resolución nanométrica y atómica, revelando en casos ideales no sólo dónde están todos los átomos sino también qué tipos de átomos son y cómo están unidos entre sí. Por esta razón, TEM se considera una herramienta esencial para la nanociencia tanto en el campo biológico como en el de materiales.
El primer TEM fue demostrado por Max Knoll y Ernst Ruska en 1931; este grupo desarrolló el primer TEM con resolución mayor que la de la luz en 1933 y el primer TEM comercial en 1939. En 1986, Ruska recibió el Premio Nobel de Física por El desarrollo de la microscopía electrónica de transmisión. [2]
En 1873, Ernst Abbe propuso que la capacidad de resolver detalles en un objeto estaba limitada aproximadamente por la longitud de onda de la luz utilizada en la obtención de imágenes o unos pocos cientos de nanómetros para los microscopios de luz visible. Los avances en microscopios ultravioleta (UV), liderados por Köhler y Rohr , aumentaron el poder de resolución en un factor de dos. [3] Sin embargo, esto requería costosas ópticas de cuarzo, debido a la absorción de rayos UV por el vidrio. Se creía que no era posible obtener una imagen con información submicrométrica debido a esta limitación de longitud de onda. [4]
En 1858, Plücker observó la desviación de los "rayos catódicos" ( electrones ) mediante campos magnéticos. [5] Este efecto fue utilizado por Ferdinand Braun en 1897 para construir dispositivos de medición simples de osciloscopio de rayos catódicos (CRO). [6] En 1891, Eduard Riecke notó que los rayos catódicos podían enfocarse mediante campos magnéticos, lo que permitía diseños de lentes electromagnéticos simples. En 1926, Hans Busch publicó un trabajo que ampliaba esta teoría y demostró que la ecuación del fabricante de lentes podía, con las suposiciones apropiadas, aplicarse a los electrones. [2]
En 1928, en la Universidad Técnica de Berlín , Adolf Matthias, profesor de Tecnología de Alto Voltaje e Instalaciones Eléctricas, nombró a Max Knoll para liderar un equipo de investigadores para avanzar en el diseño de CRO. El equipo estaba formado por varios estudiantes de doctorado, entre ellos Ernst Ruska y Bodo von Borries . El equipo de investigación trabajó en el diseño de lentes y la colocación de columnas CRO, para optimizar los parámetros para construir mejores CRO y fabricar componentes ópticos electrónicos para generar imágenes de bajo aumento (casi 1:1). En 1931, el grupo generó con éxito imágenes ampliadas de rejillas de malla colocadas sobre la apertura del ánodo. El dispositivo utilizó dos lentes magnéticas para lograr mayores aumentos, posiblemente creando el primer microscopio electrónico . Ese mismo año, Reinhold Rudenberg , director científico de la empresa Siemens , patentó un microscopio electrónico con lentes electrostáticas . [4] [7]
En aquella época, se entendía que los electrones eran partículas cargadas de materia; La naturaleza ondulatoria de los electrones no se comprendió plenamente hasta la tesis doctoral de Louis de Broglie en 1924. [8] El grupo de investigación de Knoll desconocía esta publicación hasta 1932, cuando se dieron cuenta de que la longitud de onda de los electrones de De Broglie era muchos órdenes de magnitud más pequeña. que el de la luz, lo que teóricamente permite obtener imágenes a escalas atómicas. (Incluso para electrones con una energía cinética de sólo 1 electronvoltio , la longitud de onda ya es tan corta como 1,18 nm ). En abril de 1932, Ruska sugirió la construcción de un nuevo microscopio electrónico para obtener imágenes directas de las muestras insertadas en el microscopio, en lugar de una simple malla. cuadrículas o imágenes de aperturas. Con este dispositivo se logró una difracción exitosa y una imagen normal de una lámina de aluminio. Sin embargo, el aumento que se pudo lograr fue menor que con la microscopía óptica. En septiembre de 1933 se lograron aumentos superiores a los disponibles con un microscopio óptico con imágenes de fibras de algodón adquiridas rápidamente antes de ser dañadas por el haz de electrones. [4]
En esta época, el interés por el microscopio electrónico había aumentado, con otros grupos, como el de Paul Anderson y Kenneth Fitzsimmons de la Universidad Estatal de Washington [9] y el de Albert Prebus y James Hillier de la Universidad de Toronto , quienes construyeron el primer microscopio electrónico. TEM en América del Norte en 1935 y 1938, respectivamente, [10] avanzan continuamente en el diseño de TEM.
La investigación continuó con el microscopio electrónico en Siemens en 1936, donde el objetivo de la investigación era el desarrollo y mejora de las propiedades de las imágenes TEM, particularmente con respecto a muestras biológicas. En ese momento se fabricaban microscopios electrónicos para grupos específicos, como el dispositivo "EM1" utilizado en el Laboratorio Nacional de Física del Reino Unido. [11] En 1939 se instaló el primer microscopio electrónico comercial (en la foto) en el departamento de Física de IG Farben -Werke. Los trabajos posteriores con el microscopio electrónico se vieron obstaculizados por la destrucción de un nuevo laboratorio construido en Siemens por un ataque aéreo , así como por la muerte de dos de los investigadores, Heinz Müller y Friedrick Krause, durante la Segunda Guerra Mundial . [12]
Después de la Segunda Guerra Mundial, Ruska reanudó su trabajo en Siemens, donde continuó desarrollando el microscopio electrónico, produciendo el primer microscopio con un aumento de 100k. [12] La estructura fundamental de este diseño de microscopio, con óptica de preparación del haz de múltiples etapas, todavía se utiliza en los microscopios modernos. La comunidad mundial de microscopía electrónica avanzó con microscopios electrónicos fabricados en Manchester, Reino Unido, EE. UU. (RCA), Alemania (Siemens) y Japón (JEOL). La primera conferencia internacional sobre microscopía electrónica se celebró en Delft en 1949 y contó con más de cien asistentes. [11] Las conferencias posteriores incluyeron la "Primera" conferencia internacional en París, 1950 y luego en Londres en 1954.
Con el desarrollo de TEM, la técnica asociada de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) se volvió a investigar y permaneció sin desarrollarse hasta la década de 1970, cuando Albert Crewe, de la Universidad de Chicago, desarrolló el cañón de emisión de campo [13] y añadió un objetivo de alta calidad. lente para crear el STEM moderno. Utilizando este diseño, Crewe demostró la capacidad de obtener imágenes de átomos mediante imágenes anulares de campo oscuro . Crewe y sus compañeros de la Universidad de Chicago desarrollaron la fuente de emisión de electrones de campo frío y construyeron un STEM capaz de visualizar átomos pesados individuales sobre sustratos de carbono delgados. [14]
Teóricamente, la resolución máxima, d , que se puede obtener con un microscopio óptico está limitada por la longitud de onda de los fotones (λ) y la apertura numérica NA del sistema. [15]
donde n es el índice de refracción del medio en el que trabaja la lente y α es el semiángulo máximo del cono de luz que puede entrar en la lente (ver apertura numérica ). [16] Los científicos de principios del siglo XX teorizaron formas de sortear las limitaciones de la longitud de onda relativamente grande de la luz visible (longitudes de onda de 400 a 700 nanómetros ) mediante el uso de electrones. Como toda la materia, los electrones tienen propiedades tanto de onda como de partícula ( onda de materia ), y sus propiedades ondulatorias significan que un haz de electrones puede enfocarse y difractarse de manera muy similar a como lo hace la luz. La longitud de onda de los electrones está relacionada con su energía cinética mediante la ecuación de De Broglie, que dice que la longitud de onda es inversamente proporcional al momento. Teniendo en cuenta los efectos relativistas (como en un TEM la velocidad de un electrón es una fracción sustancial de la velocidad de la luz, c [17] ), la longitud de onda es
donde h es la constante de Planck , m 0 es la masa en reposo de un electrón y E es la energía cinética del electrón acelerado.
De arriba hacia abajo, el TEM consta de una fuente de emisión o cátodo, que puede ser un filamento de tungsteno , un monocristal de hexaboruro de lantano ( LaB 6 ) o un cañón de emisión de campo . [18] La pistola está conectada a una fuente de alto voltaje (típicamente ~100–300 kV) y emite electrones mediante emisión termoiónica o de electrones de campo al vacío. En el caso de una fuente termoiónica, la fuente de electrones se monta en un cilindro Wehnelt para proporcionar un enfoque preliminar de los electrones emitidos en un haz y al mismo tiempo estabilizar la corriente mediante un circuito de retroalimentación pasiva. En cambio, una fuente de emisión de campo utiliza electrodos electrostáticos llamados extractor, supresor y lente de pistola, con diferentes voltajes en cada uno, para controlar la forma y la intensidad del campo eléctrico cerca de la punta afilada. La combinación del cátodo y estos primeros elementos de lente electrostática se denomina colectivamente "cañón de electrones". Después de salir de la pistola, el haz normalmente se acelera hasta que alcanza su voltaje final y entra en la siguiente parte del microscopio: el sistema de lentes del condensador. Estas lentes superiores del TEM luego enfocan aún más el haz de electrones al tamaño y ubicación deseados en la muestra. [19]
La manipulación del haz de electrones se realiza mediante dos efectos físicos. La interacción de los electrones con un campo magnético hará que los electrones se muevan según la regla de la mano izquierda , permitiendo así que los electroimanes manipulen el haz de electrones. Además, los campos electrostáticos pueden hacer que los electrones se desvíen en un ángulo constante. El acoplamiento de dos desviaciones en direcciones opuestas con un pequeño espacio intermedio permite la formación de un desplazamiento en la trayectoria del haz, lo que permite el desplazamiento del haz.
Las lentes de un TEM son lo que le da flexibilidad en los modos de funcionamiento y la capacidad de enfocar haces a escala atómica y ampliarlos para obtener una imagen. Una lente suele estar hecha de una bobina de solenoide casi rodeada por materiales ferromagnéticos diseñados para concentrar el campo magnético de la bobina en una forma precisa y confinada. Cuando un electrón entra y sale de este campo magnético, gira en espiral alrededor de las líneas curvas del campo magnético de una manera que actúa de manera muy similar a como lo hace una lente de vidrio común con la luz: es una lente convergente. Pero, a diferencia de una lente de vidrio, una lente magnética puede cambiar muy fácilmente su poder de enfoque ajustando la corriente que pasa a través de las bobinas.
Igualmente importantes para las lentes son las aperturas. Son agujeros circulares en finas tiras de metal pesado. Algunos tienen un tamaño y una posición fijos y desempeñan un papel importante a la hora de limitar la generación de rayos X y mejorar el rendimiento del vacío. Otros se pueden cambiar libremente entre varios tamaños diferentes y ajustar sus posiciones. Las aperturas variables después de la muestra permiten al usuario seleccionar el rango de posiciones espaciales o ángulos de dispersión de electrones que se utilizarán en la formación de una imagen o un patrón de difracción.
El sistema electrón-óptico también incluye deflectores y estigmadores, normalmente formados por pequeños electroimanes. Los deflectores permiten controlar de forma independiente la posición y el ángulo del haz en la posición de la muestra y también garantizan que los haces permanezcan cerca de los centros de baja aberración de cada lente en las pilas de lentes. Los estigmadores compensan las ligeras imperfecciones y aberraciones que causan el astigmatismo: una lente que tiene una intensidad focal diferente en diferentes direcciones.
Normalmente, un TEM consta de tres etapas de lentes. Las etapas son las lentes del condensador, las lentes del objetivo y las lentes del proyector. Las lentes del condensador son responsables de la formación del haz primario, mientras que las lentes del objetivo enfocan el haz que pasa a través de la muestra (en el modo de escaneo STEM, también hay lentes de objetivo encima de la muestra para hacer que el haz de electrones incidente sea convergente). Las lentes del proyector se utilizan para expandir el haz sobre la pantalla de fósforo u otro dispositivo de imágenes, como una película. El aumento del TEM se debe a la relación de las distancias entre la muestra y el plano de imagen de la lente del objetivo. [20] Las configuraciones ópticas de TEM difieren significativamente con la implementación, y los fabricantes utilizan configuraciones de lentes personalizadas, como en instrumentos con corrección de aberración esférica , [19] o TEM que utilizan filtrado de energía para corregir la aberración cromática electrónica .
El teorema de reciprocidad óptica, o principio de reciprocidad de Helmholtz , generalmente es válido para electrones dispersados elásticamente , como suele ser el caso en condiciones operativas estándar de TEM. [21] [22] El teorema establece que la amplitud de la onda en algún punto B como resultado de una fuente puntual de electrones A sería la misma que la amplitud en A debido a una fuente puntual equivalente colocada en B. [22] En pocas palabras, la función de onda de los electrones enfocados a través de cualquier serie de componentes ópticos que incluya sólo campos escalares (es decir, no magnéticos) será exactamente equivalente si la fuente de electrones y el punto de observación se invierten. R
La reciprocidad se utiliza para comprender la microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) en el contexto familiar de TEM y para obtener e interpretar imágenes utilizando STEM.
Los factores clave al considerar la detección de electrones incluyen la eficiencia cuántica de detección (DQE) , la función de dispersión de puntos (PSF) , la función de transferencia de modulación (MTF) , el tamaño de píxel y el tamaño de la matriz, el ruido, la velocidad de lectura de datos y la dureza de la radiación. [23]
Los sistemas de imágenes en un TEM constan de una pantalla de fósforo, que puede estar hecha de partículas finas (10 a 100 μm) de sulfuro de zinc , para la observación directa por parte del operador, y un sistema de registro de imágenes, como una película fotográfica , [24] pantalla YAG dopada. CCD acoplados, [25] u otro detector digital. [23] Normalmente, estos dispositivos se pueden quitar o insertar en la trayectoria del haz según sea necesario. (La película fotográfica ya no se utiliza.) El primer informe sobre el uso de un detector de dispositivo de carga acoplada (CCD) para TEM fue en 1982, [26] pero la tecnología no encontró un uso generalizado hasta finales de los años 1990 y principios de los 2000. [27] También se utilizaron sensores monolíticos de píxeles activos (MAPS) en TEM. [28] Los detectores CMOS , que son más rápidos y más resistentes al daño por radiación que los CCD, se han utilizado para TEM desde 2005. [29] [30] A principios de la década de 2010, un mayor desarrollo de la tecnología CMOS permitió la detección de recuentos de electrones individuales. ("modo de conteo"). [31] [32] Estos detectores de electrones directos están disponibles en Gatan , FEI , Quantum Detectors y Direct Electron. [28]
Un TEM se compone de varios componentes, que incluyen un sistema de vacío en el que viajan los electrones, una fuente de emisión de electrones para la generación del flujo de electrones, una serie de lentes electromagnéticas y placas electrostáticas. Los dos últimos permiten al operador guiar y manipular la viga según sea necesario. También se requiere un dispositivo que permita la inserción, el movimiento y la extracción de muestras de la trayectoria del haz. Posteriormente se utilizan dispositivos de imágenes para crear una imagen a partir de los electrones que salen del sistema.
Para aumentar el camino libre medio de la interacción electrón-gas, se evacua un TEM estándar a presiones bajas, normalmente del orden de 10 −4 Pa . [33] La necesidad de esto es doble: en primer lugar, tener en cuenta la diferencia de voltaje entre el cátodo y el suelo sin generar un arco, y en segundo lugar, reducir la frecuencia de colisión de los electrones con los átomos del gas a niveles insignificantes; este efecto se caracteriza por la camino libre medio . Los componentes de TEM, como los portamuestras y los cartuchos de película, deben insertarse o reemplazarse de forma rutinaria, lo que requiere un sistema con la capacidad de reevacuar periódicamente. Como tal, los TEM están equipados con múltiples sistemas de bombeo y esclusas de aire y no están sellados al vacío permanentemente.
El sistema de vacío para evacuar un TEM a un nivel de presión de funcionamiento consta de varias etapas. Inicialmente, se logra un vacío bajo o aproximado con una bomba de paletas rotativas o bombas de diafragma que establecen una presión suficientemente baja para permitir el funcionamiento de una bomba turbomolecular o de difusión que establece el alto nivel de vacío necesario para las operaciones. Para permitir que la bomba de bajo vacío no requiera un funcionamiento continuo, mientras funcionan continuamente las bombas turbomoleculares, el lado de vacío de una bomba de baja presión puede conectarse a cámaras que acomodan los gases de escape de la bomba turbomolecular. [34] Las secciones del TEM pueden aislarse mediante el uso de aberturas limitadoras de presión para permitir diferentes niveles de vacío en áreas específicas, como un vacío más alto de 10 −4 a 10 −7 Pa o más en el cañón de electrones en alta temperatura. TEM de resolución o de emisión de campo.
Los TEM de alto voltaje requieren vacíos ultra altos en el rango de 10 −7 a 10 −9 Pa para evitar la generación de un arco eléctrico, particularmente en el cátodo del TEM. [35] Como tal, para TEM de voltaje más alto, puede funcionar un tercer sistema de vacío, con la pistola aislada de la cámara principal, ya sea mediante válvulas de compuerta o una abertura de bombeo diferencial, un pequeño orificio que evita la difusión de moléculas de gas hacia el área de la pistola de vacío superior. más rápido de lo que pueden ser bombeados. Para estas presiones tan bajas, se utiliza una bomba de iones o un material absorbente .
Un vacío deficiente en un TEM puede causar varios problemas que van desde la deposición de gas dentro del TEM sobre la muestra mientras se observa en un proceso conocido como deposición inducida por haz de electrones hasta daños más graves al cátodo causados por una descarga eléctrica. [35] El uso de una trampa fría para adsorber gases sublimados en las proximidades de la muestra elimina en gran medida los problemas de vacío causados por la sublimación de la muestra . [34]
Los diseños de platinas para muestras TEM incluyen esclusas de aire para permitir la inserción del portamuestras en el vacío con una pérdida mínima de vacío en otras áreas del microscopio. Los portamuestras sostienen una rejilla de muestra de tamaño estándar o una muestra autoportante. Los tamaños de rejilla TEM estándar tienen un diámetro de 3,05 mm, con un espesor y un tamaño de malla que oscilan entre unos pocos y 100 μm. La muestra se coloca sobre el área de malla que tiene un diámetro de aproximadamente 2,5 mm. Los materiales habituales de las rejillas son cobre, molibdeno, oro o platino. Esta rejilla se coloca en el portamuestras, que está emparejado con la platina de muestras. Existe una amplia variedad de diseños de etapas y soportes, según el tipo de experimento que se realice. Además de las rejillas de 3,05 mm, a veces, aunque raramente, se utilizan rejillas de 2,3 mm. Estas rejillas se utilizaron especialmente en las ciencias minerales, donde puede ser necesario un gran grado de inclinación y donde el material de muestra puede ser extremadamente raro. Las muestras transparentes a los electrones tienen un espesor normalmente inferior a 100 nm, pero este valor depende del voltaje de aceleración.
Una vez insertada en un TEM, la muestra debe manipularse para ubicar la región de interés para el haz, como en la difracción de grano único , en una orientación específica. Para adaptarse a esto, la plataforma TEM permite el movimiento de la muestra en el plano XY, el ajuste de altura Z y, comúnmente, una única dirección de inclinación paralela al eje de los soportes de entrada lateral. La rotación de muestras puede estar disponible en soportes y etapas de difracción especializados. Algunos TEM modernos brindan la capacidad de dos ángulos de movimiento de inclinación ortogonal con diseños de soporte especializados llamados soportes de muestras de doble inclinación. Es posible que algunos diseños de platina, como las platinas de entrada superior o de inserción vertical que alguna vez fueron comunes para estudios TEM de alta resolución, simplemente solo tengan traducción XY disponible. Los criterios de diseño de las etapas TEM son complejos, debido a los requisitos simultáneos de restricciones mecánicas y electrón-ópticas, y hay modelos especializados disponibles para diferentes métodos.
Se requiere una etapa TEM para tener la capacidad de sostener una muestra y ser manipulada para llevar la región de interés a la trayectoria del haz de electrones. Como el TEM puede funcionar con una amplia gama de aumentos, la platina debe ser simultáneamente altamente resistente a la deriva mecánica, con requisitos de deriva tan bajos como unos pocos nm/minuto y al mismo tiempo ser capaz de moverse varios μm/minuto, con una precisión de reposicionamiento del orden de nanómetros. [36] Los diseños anteriores de TEM lograron esto con un complejo conjunto de dispositivos mecánicos de descenso, lo que permitía al operador controlar con precisión el movimiento del escenario mediante varias varillas giratorias. Los dispositivos modernos pueden utilizar diseños de escenarios eléctricos, utilizando engranajes de tornillo junto con motores paso a paso , proporcionando al operador una entrada de escenario basada en computadora, como un joystick o trackball .
Existen dos diseños principales de etapas en un TEM, la versión de entrada lateral y la de entrada superior. [25] Cada diseño debe acomodar el soporte correspondiente para permitir la inserción de la muestra sin dañar la delicada óptica TEM ni permitir la entrada de gas en los sistemas TEM bajo vacío.
El más común es el soporte de entrada lateral, donde la muestra se coloca cerca de la punta de una varilla larga de metal (latón o acero inoxidable), con la muestra colocada plana en un orificio pequeño. A lo largo de la varilla hay varios anillos de vacío de polímero para permitir la formación de un sello de vacío de calidad suficiente cuando se inserta en la platina. Por lo tanto, la platina está diseñada para acomodar la varilla, colocando la muestra entre o cerca de la lente del objetivo, dependiendo del diseño del objetivo. Cuando se inserta en el escenario, el soporte de entrada lateral tiene su punta contenida dentro del vacío TEM y la base se presenta a la atmósfera, la esclusa de aire formada por los anillos de vacío.
Los procedimientos de inserción para soportes de TEM de entrada lateral generalmente implican la rotación de la muestra para activar microinterruptores que inician la evacuación de la esclusa de aire antes de que la muestra se inserte en la columna de TEM.
El segundo diseño es el soporte de entrada superior que consta de un cartucho de varios cm de largo con un orificio perforado a lo largo del eje del cartucho. La muestra se carga en el orificio, posiblemente utilizando un pequeño anillo roscado para mantener la muestra en su lugar. Este cartucho se inserta en una esclusa de aire con el orificio perpendicular al eje óptico TEM. Cuando está sellada, la esclusa de aire se manipula para empujar el cartucho de modo que el cartucho caiga en su lugar, donde el orificio se alinea con el eje del haz, de modo que el haz desciende por el orificio del cartucho y entra en la muestra. Por lo general, estos diseños no se pueden inclinar sin bloquear la trayectoria del haz o interferir con la lente del objetivo. [25]
El cañón de electrones está formado por varios componentes: el filamento, un circuito de polarización, una tapa Wehnelt y un ánodo de extracción. Al conectar el filamento a la fuente de alimentación del componente negativo, se pueden "bombear" electrones desde el cañón de electrones a la placa del ánodo y a la columna TEM, completando así el circuito. El cañón está diseñado para crear un haz de electrones que salen del conjunto en un ángulo determinado, conocido como semiángulo de divergencia del cañón, α. Al construir el cilindro Wehnelt de manera que tenga una carga negativa más alta que el propio filamento, los electrones que salen del filamento de manera divergente son, bajo operación adecuada, forzados a adoptar un patrón convergente cuyo tamaño mínimo es el diámetro de cruce de la pistola.
La densidad de corriente de emisión termoiónica, J , se puede relacionar con la función de trabajo del material emisor mediante la ley de Richardson.
donde A es la constante de Richardson , Φ es la función de trabajo y T es la temperatura del material. [25]
Esta ecuación muestra que para lograr una densidad de corriente suficiente es necesario calentar el emisor, teniendo cuidado de no causar daños por aplicación de calor excesivo. Por esta razón , para el filamento de la pistola se necesitan materiales con un punto de fusión alto, como el tungsteno, o con una función de trabajo baja (LaB 6 ). [37] Además, tanto las fuentes termoiónicas de hexaboruro de lantano como las de tungsteno deben calentarse para lograr la emisión termoiónica; esto se puede lograr mediante el uso de una pequeña tira resistiva. Para evitar el choque térmico, a menudo se impone un retraso en la aplicación de corriente a la punta; para evitar que los gradientes térmicos dañen el filamento, el retraso suele ser de unos segundos para LaB 6 y significativamente menor para el tungsteno [ cita requerida ] .
Las lentes electrónicas están diseñadas para actuar de manera emuladora de una lente óptica, enfocando electrones paralelos a una distancia focal constante. Las lentes electrónicas pueden funcionar de forma electrostática o magnética. La mayoría de las lentes electrónicas para TEM utilizan bobinas electromagnéticas para generar una lente convexa . El campo producido para la lente debe ser radialmente simétrico, ya que la desviación de la simetría radial de la lente magnética provoca aberraciones como el astigmatismo y empeora la aberración esférica y cromática . Las lentes electrónicas se fabrican a partir de aleaciones de hierro, hierro-cobalto o níquel-cobalto, [38] como la aleación permanente . Estos se seleccionan por sus propiedades magnéticas, como saturación magnética , histéresis y permeabilidad .
Los componentes incluyen el yugo, la bobina magnética, los polos, la pieza polar y el circuito de control externo. La pieza polar debe fabricarse de forma muy simétrica, ya que así se crean las condiciones límite para el campo magnético que forma la lente. Las imperfecciones en la fabricación de la pieza polar pueden inducir distorsiones severas en la simetría del campo magnético, lo que induce distorsiones que en última instancia limitarán la capacidad de las lentes para reproducir el plano del objeto. Las dimensiones exactas del espacio, el diámetro interno de la pieza polar y la conicidad, así como el diseño general de la lente, a menudo se realizan mediante un análisis de elementos finitos del campo magnético, considerando al mismo tiempo las limitaciones térmicas y eléctricas del diseño. [38]
Las bobinas que producen el campo magnético están ubicadas dentro del yugo de la lente. Las bobinas pueden contener una corriente variable, pero normalmente utilizan voltajes altos y, por lo tanto, requieren un aislamiento significativo para evitar cortocircuitos en los componentes de la lente. Se colocan distribuidores térmicos para asegurar la extracción del calor generado por la energía perdida por la resistencia de los devanados de la bobina. Los devanados pueden enfriarse con agua, utilizando un suministro de agua fría para facilitar la eliminación del alto rendimiento térmico.
Las aberturas son placas metálicas anulares a través de las cuales se pueden excluir los electrones que se encuentran a una distancia mayor que una distancia fija del eje óptico . Consisten en un pequeño disco metálico que es lo suficientemente grueso como para evitar que los electrones pasen a través del disco, al tiempo que permite electrones axiales. Esta autorización de los electrones centrales en un TEM provoca dos efectos simultáneamente: en primer lugar, las aperturas disminuyen la intensidad del haz a medida que los electrones se filtran del haz, lo que puede ser deseable en el caso de muestras sensibles al haz. En segundo lugar, este filtrado elimina los electrones que se dispersan en ángulos elevados, lo que puede deberse a procesos no deseados como la aberración esférica o cromática, o a la difracción de la interacción dentro de la muestra. [39]
Las aberturas son una abertura fija dentro de la columna, tal como en la lente del condensador, o son una abertura móvil, que puede insertarse o retirarse de la trayectoria del haz, o moverse en el plano perpendicular a la trayectoria del haz. Los conjuntos de apertura son dispositivos mecánicos que permiten la selección de diferentes tamaños de apertura, que el operador puede utilizar para compensar la intensidad y el efecto de filtrado de la apertura. Los conjuntos de apertura suelen estar equipados con micrómetros para mover la apertura, necesarios durante la calibración óptica.
Los métodos de obtención de imágenes en TEM utilizan la información contenida en las ondas de electrones que salen de la muestra para formar una imagen. Las lentes del proyector permiten el posicionamiento correcto de esta distribución de ondas de electrones en el sistema de visualización. La intensidad observada, I , de la imagen, asumiendo una calidad suficientemente alta del dispositivo de imagen, puede aproximarse como proporcional al valor absoluto al cuadrado promediado en el tiempo de la amplitud de las funciones de onda de los electrones, donde la onda que forma el haz de salida se denota por Ψ. [40]
Por lo tanto, diferentes métodos de obtención de imágenes intentan modificar las ondas de electrones que salen de la muestra de manera que proporcionen información sobre la muestra o el propio haz. De la ecuación anterior se puede deducir que la imagen observada depende no sólo de la amplitud del haz, sino también de la fase de los electrones, [ se necesita aclaración ] aunque los efectos de fase a menudo pueden ignorarse con aumentos más bajos. Las imágenes de mayor resolución requieren muestras más delgadas y energías más altas de los electrones incidentes, lo que significa que ya no se puede considerar que la muestra esté absorbiendo electrones (es decir, a través del efecto de la ley de Beer). En cambio, la muestra se puede modelar como un objeto que no cambia la amplitud de la función de onda del electrón entrante, sino que modifica la fase de la onda entrante; En este modelo, la muestra se conoce como objeto de fase pura. Para muestras suficientemente delgadas, los efectos de fase dominan la imagen, lo que complica el análisis de las intensidades observadas. [40] Para mejorar el contraste en la imagen, el TEM puede operarse con un ligero desenfoque para mejorar el contraste, debido a la convolución por la función de transferencia de contraste del TEM, [41] que normalmente disminuiría el contraste si la muestra no fuera una Objeto de fase débil.
La figura de la derecha muestra los dos modos de funcionamiento básicos de TEM: modos de imagen y difracción. En ambos casos la muestra se ilumina con el haz paralelo, formado por la conformación del haz de electrones con el sistema de lentes condensadoras y apertura del condensador. Después de la interacción con la muestra, en la superficie de salida de la muestra existen dos tipos de electrones: no dispersos (que corresponderán al haz central brillante en el patrón de difracción) y electrones dispersos (que cambian sus trayectorias debido a la interacción con el material).
En el modo de imagen, la apertura del objetivo se inserta en un plano focal posterior (BFP) de la lente del objetivo (donde se forman los puntos de difracción). Si se utiliza la apertura del objetivo para seleccionar solo el haz central, los electrones transmitidos pasan a través de la apertura mientras todos los demás quedan bloqueados y se obtiene una imagen de campo brillante (imagen BF). Si permitimos que la señal provenga de un haz difractado, se recibe una imagen de campo oscuro (imagen DF). La señal seleccionada se magnifica y se proyecta en una pantalla (o en una cámara) con la ayuda de lentes intermedias y de proyector. Se obtiene así una imagen de la muestra.
En el modo Difracción, se puede utilizar una apertura de área seleccionada para determinar con mayor precisión el área de la muestra desde la cual se mostrará la señal. Al cambiar la intensidad de la corriente a la lente intermedia, el patrón de difracción se proyecta en una pantalla. La difracción es una herramienta muy poderosa para realizar la reconstrucción celular y determinar la orientación de los cristales.
El contraste entre dos áreas adyacentes en una imagen TEM se puede definir como la diferencia en las densidades de electrones en el plano de la imagen. Debido a la dispersión del haz incidente por la muestra, la amplitud y la fase de la onda del electrón cambian, lo que da como resultado un contraste de amplitud y un contraste de fase , respectivamente. La mayoría de las imágenes tienen ambos componentes de contraste.
La amplitud-contraste se obtiene debido a la eliminación de algunos electrones antes del plano de la imagen. Durante su interacción con la muestra, algunos electrones se perderán debido a la absorción o a la dispersión en ángulos muy altos más allá de la limitación física del microscopio o quedarán bloqueados por la apertura del objetivo. Si bien las dos primeras pérdidas se deben a la construcción de la muestra y del microscopio, el operador puede utilizar la apertura del objetivo para mejorar el contraste.
La figura de la derecha muestra una imagen TEM (a) y el patrón de difracción correspondiente (b) de una película policristalina de Pt tomada sin apertura objetiva. Para mejorar el contraste en la imagen TEM, se debe reducir el número de haces dispersos visibles en el patrón de difracción. Esto se puede hacer seleccionando un área determinada en el plano focal posterior, como solo el haz central o un haz difractado específico (ángulo), o combinaciones de dichos haces. Al seleccionar intencionalmente una apertura del objetivo que solo permite que el haz no difractado pase más allá del plano focal posterior (y hacia el plano de la imagen): se crea una imagen de campo brillante (BF) (c), mientras que si la apertura central, no el haz difractado está bloqueado: se pueden obtener imágenes de campo oscuro (DF) como las que se muestran en (de). Las imágenes DF (de) se obtuvieron seleccionando los haces difractados indicados en el patrón de difracción con círculos (b) usando una apertura en el plano focal posterior. Los granos desde los cuales se dispersan los electrones en estos puntos de difracción parecen más brillantes. Más detalles sobre la formación del contraste de difracción se proporcionan más adelante.
Hay dos tipos de contraste de amplitud: masa-espesor y contraste de difracción. Primero, consideremos el contraste masa-espesor . Cuando el haz ilumina dos áreas vecinas con baja masa (o espesor) y alta masa (o espesor), la región más pesada dispersa los electrones en ángulos mayores. Estos electrones fuertemente dispersos son bloqueados en el modo BF TEM por la apertura del objetivo. Como resultado, las regiones más pesadas aparecen más oscuras en las imágenes BF (tienen baja intensidad). El contraste masa-espesor es más importante para materiales amorfos no cristalinos.
El contraste de difracción se produce debido a una orientación cristalográfica específica de un grano. En tal caso, el cristal está orientado de tal manera que existe una alta probabilidad de difracción. El contraste de difracción proporciona información sobre la orientación de los cristales en una muestra policristalina, así como otra información como defectos. Tenga en cuenta que, en caso de que exista contraste de difracción, el contraste no puede interpretarse como debido a variaciones de masa o espesor.
Las muestras pueden exhibir contraste de difracción, mediante el cual el haz de electrones sufre difracción que, en el caso de una muestra cristalina, dispersa los electrones en ubicaciones discretas en el plano focal posterior . Mediante la colocación de aperturas en el plano focal posterior, es decir, la apertura del objetivo, se pueden seleccionar (o excluir) los vectores reticulares recíprocos deseados, por lo que solo partes de la muestra que están causando que los electrones se dispersen hacia las reflexiones seleccionadas terminarán proyectadas. en el aparato de imágenes.
Si los reflejos seleccionados no incluyen el haz no disperso (que aparecerá en el punto focal de la lente), entonces la imagen aparecerá oscura dondequiera que no haya muestra dispersa hacia el pico seleccionado, como una región sin muestra. aparecerá oscuro. Esto se conoce como imagen de campo oscuro.
Los TEM modernos suelen estar equipados con portamuestras que permiten al usuario inclinar la muestra en una variedad de ángulos para obtener condiciones de difracción específicas, y las aberturas colocadas sobre la muestra le permiten al usuario seleccionar electrones que de otro modo se difractarían en una dirección particular. de entrar en la muestra.
Las aplicaciones de este método incluyen la identificación de defectos reticulares en cristales. Seleccionando cuidadosamente la orientación de la muestra, es posible no sólo determinar la posición de los defectos sino también determinar el tipo de defecto presente. Si la muestra se orienta de manera que un plano particular esté ligeramente inclinado lejos del ángulo de difracción más fuerte (conocido como ángulo de Bragg ), cualquier distorsión del plano del cristal que incline localmente el plano hacia el ángulo de Bragg producirá variaciones de contraste particularmente fuertes. Sin embargo, los defectos que producen sólo desplazamientos de átomos que no inclinan el cristal hacia el ángulo de Bragg (es decir, desplazamientos paralelos al plano del cristal) producirán un contraste más débil. [42]
La estructura cristalina también se puede investigar mediante microscopía electrónica de transmisión de alta resolución (HRTEM), también conocida como contraste de fases . Cuando se utiliza una fuente de emisión de campo y una muestra de espesor uniforme, las imágenes se forman debido a las diferencias en la fase de las ondas de electrones, que es causada por la interacción de la muestra. [41] La formación de imágenes está dada por el módulo complejo de los haces de electrones entrantes. Como tal, la imagen no sólo depende del número de electrones que llegan a la pantalla, lo que hace que la interpretación directa de las imágenes de contraste de fase sea un poco más compleja. Sin embargo, este efecto se puede utilizar con ventaja, ya que se puede manipular para proporcionar más información sobre la muestra, como en técnicas complejas de recuperación de fase .
Como se indicó anteriormente, ajustando las lentes magnéticas de manera que el plano focal posterior de la lente en lugar del plano de formación de imágenes se coloque sobre el aparato de formación de imágenes, se puede generar un patrón de difracción . Para muestras cristalinas delgadas, esto produce una imagen que consiste en un patrón de puntos en el caso de un solo cristal, o una serie de anillos en el caso de un material sólido policristalino o amorfo . Para el caso del monocristal, el patrón de difracción depende de la orientación de la muestra y de la estructura de la muestra iluminada por el haz de electrones. Esta imagen proporciona al investigador información sobre las simetrías de los grupos espaciales en el cristal y la orientación del cristal con respecto a la trayectoria del haz. Por lo general, esto se hace sin utilizar ninguna información excepto la posición en la que aparecen los puntos de difracción y las simetrías de la imagen observadas.
Los patrones de difracción pueden tener un amplio rango dinámico y, en el caso de muestras cristalinas, pueden tener intensidades mayores que las que pueden registrarse mediante CCD. Como tal, los TEM aún pueden estar equipados con cartuchos de película con el fin de obtener estas imágenes, ya que la película es un detector de un solo uso.
El análisis de los patrones de difracción más allá de la posición del punto puede ser complejo, ya que la imagen es sensible a una serie de factores como el espesor y la orientación de la muestra, el desenfoque de la lente del objetivo y la aberración esférica y cromática. Aunque es posible una interpretación cuantitativa del contraste mostrado en las imágenes reticulares, es intrínsecamente complicada y puede requerir una simulación y un análisis por computadora extensos, como el análisis multicorte de electrones . [43]
También es posible un comportamiento más complejo en el plano de difracción, con fenómenos como las líneas de Kikuchi que surgen de la difracción múltiple dentro de la red cristalina. En la difracción de electrones de haz convergente (CBED), donde se produce un frente de onda de electrones no paralelo, es decir, convergente, concentrando el haz de electrones en una sonda fina en la superficie de la muestra, la interacción del haz convergente puede proporcionar información más allá de los datos estructurales, como la muestra. espesor.
Usando la técnica avanzada de espectroscopía de pérdida de energía electrónica (EELS), para TEM apropiadamente equipados, los electrones se pueden separar en un espectro basado en su velocidad (que está estrechamente relacionada con su energía cinética y, por lo tanto, con la pérdida de energía del haz), usando Dispositivos basados en sectores magnéticos conocidos como espectrómetros EEL. Estos dispositivos permiten la selección de valores de energía particulares, que pueden asociarse con la forma en que el electrón ha interactuado con la muestra. Por ejemplo, diferentes elementos en una muestra dan como resultado diferentes energías de electrones en el haz después de la muestra. Esto normalmente da como resultado una aberración cromática; sin embargo, este efecto puede usarse, por ejemplo, para generar una imagen que proporcione información sobre la composición elemental, basada en la transición atómica durante la interacción electrón-electrón. [44]
Los espectrómetros EELS a menudo pueden funcionar tanto en modo espectroscópico como en modo de obtención de imágenes, lo que permite aislar o rechazar haces elásticamente dispersos . Como en muchas imágenes la dispersión inelástica incluirá información que puede no ser de interés para el investigador, reduciendo así las señales observables de interés, las imágenes EELS se pueden utilizar para mejorar el contraste en las imágenes observadas, incluido el campo brillante y la difracción, al rechazar componentes no deseados.
Como los portamuestras TEM normalmente permiten la rotación de una muestra en un ángulo deseado, se pueden obtener múltiples vistas de la misma muestra girando el ángulo de la muestra a lo largo de un eje perpendicular al haz. Al tomar múltiples imágenes de una sola muestra de TEM en diferentes ángulos, generalmente en incrementos de 1°, se puede recopilar un conjunto de imágenes conocido como "serie de inclinación". Esta metodología fue propuesta en la década de 1970 por Walter Hoppe . En condiciones de contraste puramente de absorción, este conjunto de imágenes se puede utilizar para construir una representación tridimensional de la muestra. [46]
La reconstrucción se logra mediante un proceso de dos pasos: primero las imágenes se alinean para tener en cuenta los errores en la colocación de una muestra; Estos errores pueden ocurrir debido a vibraciones o derivas mecánicas. [47] Los métodos de alineación utilizan algoritmos de registro de imágenes , como métodos de autocorrelación, para corregir estos errores. En segundo lugar, utilizando un algoritmo de reconstrucción, como la retroproyección filtrada , los cortes de imagen alineados se pueden transformar de un conjunto de imágenes bidimensionales, I j ( x , y ), a una única imagen tridimensional, I ' j ( x , y , z ). Esta imagen tridimensional es de particular interés cuando se requiere información morfológica; se pueden realizar más estudios utilizando algoritmos informáticos, como isosuperficies y corte de datos para analizar los datos.
Como las muestras TEM normalmente no se pueden ver con una rotación completa de 180°, las imágenes observadas generalmente adolecen de una "cuña faltante" de datos, que cuando se utilizan métodos de retroproyección basados en Fourier disminuye el rango de frecuencias resolubles en la reconstrucción tridimensional. [46] Refinamientos mecánicos, como la inclinación de múltiples ejes (dos series de inclinación de la misma muestra realizadas en direcciones ortogonales) y la tomografía cónica (donde la muestra primero se inclina a un ángulo fijo determinado y luego se obtienen imágenes con incrementos de rotación angulares iguales a través de una rotación completa en el plano de la cuadrícula de la muestra) se puede utilizar para limitar el impacto de los datos faltantes en la morfología de la muestra observada. Utilizando el fresado con haz de iones enfocado , se ha propuesto una nueva técnica [48] que utiliza una muestra en forma de pilar y un soporte de tomografía en eje dedicado para realizar una rotación de 180° de la muestra dentro de la pieza polar de la lente objetivo en TEM. Utilizando tales disposiciones, es posible la tomografía electrónica cuantitativa sin la cuña que falta. [49] Además, existen técnicas numéricas que pueden mejorar los datos recopilados.
Todos los métodos mencionados anteriormente implican registrar series de inclinación de un campo de muestra determinado. Esto inevitablemente resulta en la suma de una alta dosis de electrones reactivos a través de la muestra y la consiguiente destrucción de los detalles finos durante la grabación. Por lo tanto, la técnica de imágenes de dosis baja (dosis mínima) se aplica periódicamente para mitigar este efecto. La obtención de imágenes de dosis bajas se realiza desviando la iluminación y las regiones de imágenes simultáneamente lejos del eje óptico para obtener imágenes de una región adyacente al área que se va a registrar (la región de dosis alta). Esta área se mantiene centrada durante la inclinación y se reenfoca antes de grabar. Durante la grabación, las desviaciones se eliminan de modo que el área de interés quede expuesta al haz de electrones solo durante el tiempo necesario para la obtención de imágenes. Una mejora de esta técnica (para objetos que descansan sobre una película de sustrato inclinada) es tener dos regiones simétricas fuera del eje para enfocar y luego establecer el enfoque en el promedio de los dos valores de enfoque de dosis alta antes de registrar el área de interés de dosis baja. .
Las variantes no tomográficas de este método, conocidas como análisis de partícula única , utilizan imágenes de múltiples (con suerte) objetos idénticos en diferentes orientaciones para producir los datos de imagen necesarios para la reconstrucción tridimensional. Si los objetos no tienen orientaciones preferidas significativas, este método no sufre la falta de cuña (o cono) de datos que acompaña a los métodos tomográficos ni incurre en una dosis excesiva de radiación; sin embargo, supone que los diferentes objetos fotografiados pueden tratarse como si Los datos 3D generados a partir de ellos surgieron de un único objeto estable.
La preparación de muestras en TEM puede ser un procedimiento complejo. [50] Las muestras de TEM deben tener menos de 100 nanómetros de espesor para un TEM convencional. A diferencia de la radiación de neutrones o rayos X, los electrones del haz interactúan fácilmente con la muestra, un efecto que aumenta aproximadamente con el número atómico al cuadrado (Z 2 ). [15] Las muestras de alta calidad tendrán un espesor comparable al camino libre medio de los electrones que viajan a través de las muestras, que puede ser de sólo unas pocas decenas de nanómetros. La preparación de muestras TEM es específica del material bajo análisis y del tipo de información que se obtendrá de la muestra.
Los materiales que tienen dimensiones lo suficientemente pequeñas como para ser transparentes a los electrones, como sustancias en polvo, pequeños organismos, virus o nanotubos, se pueden preparar rápidamente depositando una muestra diluida que contenga la muestra sobre películas sobre rejillas de soporte. Las muestras biológicas se pueden incrustar en resina para resistir el alto vacío en la cámara de muestras y permitir cortar el tejido en secciones delgadas transparentes a los electrones. La muestra biológica se puede teñir utilizando un material de tinción negativo como acetato de uranilo para bacterias y virus o, en el caso de secciones incrustadas, la muestra se puede teñir con metales pesados, incluido el tetróxido de osmio . Alternativamente, las muestras se pueden mantener a temperaturas de nitrógeno líquido después de incrustarlas en hielo vítreo. [51] En la ciencia de los materiales y la metalurgia, las muestras generalmente pueden resistir el alto vacío, pero aún así deben prepararse como una lámina delgada o grabarse para que una parte de la muestra sea lo suficientemente delgada como para que el haz penetre. Las restricciones sobre el espesor del material pueden estar limitadas por la sección transversal de dispersión de los átomos que componen el material.
Antes de seccionar, el tejido biológico a menudo se incrusta en un bloque de resina epoxi y primero se recorta con una hoja de afeitar hasta formar una cara de bloque trapezoidal. Luego se cortan secciones gruesas de la cara del bloque. Las secciones gruesas se tiñen crudamente con azul de toluidina y se examinan para determinar la orientación de la muestra y del bloque antes de realizar la sección delgada. [52] Luego, el tejido biológico se adelgaza a menos de 100 nm en un ultramicrótomo . El bloque de resina se fractura al pasar sobre el filo de un cuchillo de vidrio o diamante. [53] Este método se utiliza para obtener muestras delgadas y mínimamente deformadas que permiten la observación de la ultraestructura del tejido. Las muestras inorgánicas, como el aluminio, también pueden incrustarse en resinas y cortarse en secciones ultrafinas de esta manera, utilizando vidrio revestido, zafiro o cuchillas de diamante de ángulo más grande. [54] Para evitar la acumulación de carga en la superficie de la muestra cuando se visualiza en el TEM, las muestras de tejido deben recubrirse con una capa delgada de material conductor, como el carbono.
Las muestras TEM de tejidos biológicos necesitan tinciones de alto número atómico para mejorar el contraste. La mancha absorbe los electrones del haz o dispersa parte del haz de electrones que, de otro modo, se proyecta sobre el sistema de imágenes. Se pueden usar compuestos de metales pesados como osmio , plomo , uranio u oro (en el marcaje con inmunooro ) antes de la observación TEM para depositar selectivamente átomos densos en electrones dentro o sobre la muestra en la región celular o proteica deseada. Este proceso requiere una comprensión de cómo los metales pesados se unen a tejidos biológicos y estructuras celulares específicos. [55]
Otra forma de tinción de muestras es la tinción negativa , en la que se aplica una mayor cantidad de tinte de metales pesados a la muestra. [56] El resultado es una muestra con un fondo oscuro y la superficie topológica de la muestra que parece más clara. La microscopía electrónica de tinción negativa puede ser ideal para visualizar o formar reconstrucciones topológicas en 3D de proteínas grandes o complejos macromoleculares (>150 kDa). Para proteínas más pequeñas, la tinción negativa se puede utilizar como paso de detección para encontrar la concentración de muestra ideal para microscopía electrónica criogénica . [56]
El pulido mecánico también se utiliza para preparar muestras para obtener imágenes en el TEM. El pulido debe realizarse con alta calidad para garantizar un espesor de muestra constante en toda la región de interés. Se puede utilizar un compuesto de pulido de diamante o nitruro de boro cúbico en las etapas finales del pulido para eliminar cualquier rayado que pueda causar fluctuaciones de contraste debido a la variación del espesor de la muestra. Incluso después de un cuidadoso fresado mecánico, es posible que se requieran métodos finos adicionales, como el grabado iónico, para realizar la etapa final de adelgazamiento.
Ciertas muestras pueden prepararse mediante grabado químico, particularmente muestras metálicas. Estas muestras se diluyen utilizando un grabador químico, como un ácido, para preparar la muestra para la observación TEM. Los dispositivos para controlar el proceso de adelgazamiento pueden permitir al operador controlar el voltaje o la corriente que pasa a través de la muestra, y pueden incluir sistemas para detectar cuándo la muestra se ha diluido a un nivel suficiente de transparencia óptica.
El grabado iónico es un proceso de pulverización catódica que puede eliminar cantidades muy finas de material. Se utiliza para realizar un pulido final de muestras pulidas por otros medios. El grabado iónico utiliza un gas inerte que pasa a través de un campo eléctrico para generar una corriente de plasma que se dirige a la superficie de la muestra. Las energías de aceleración de gases como el argón suelen ser de unos pocos kilovoltios. La muestra se puede girar para promover un pulido uniforme de la superficie de la muestra. La velocidad de pulverización de tales métodos es del orden de decenas de micrómetros por hora, lo que limita el método a un pulido extremadamente fino.
Recientemente se ha demostrado que el grabado de iones con gas argón es capaz de limar estructuras de pila MTJ hasta una capa específica que luego se resuelve atómicamente. Las imágenes TEM tomadas en vista en planta en lugar de en sección transversal revelan que la capa de MgO dentro de los MTJ contiene una gran cantidad de límites de grano que pueden estar disminuyendo las propiedades de los dispositivos. [57]
Más recientemente se han utilizado métodos de haz de iones enfocados para preparar muestras. FIB es una técnica relativamente nueva para preparar muestras delgadas para el examen TEM a partir de muestras más grandes. Debido a que FIB se puede utilizar para micromecanizar muestras con mucha precisión, es posible fresar membranas muy delgadas de un área específica de interés en una muestra, como un semiconductor o un metal. A diferencia de la pulverización catódica de iones de gas inerte, FIB utiliza iones de galio significativamente más energéticos y puede alterar la composición o estructura del material mediante la implantación de galio. [58]
Para una introducción mínima de tensión y flexión en muestras de microscopía electrónica de transmisión (TEM) ( laminillas , películas delgadas y otras muestras sensibles mecánicamente y al haz), cuando se transfieren dentro de un haz de iones enfocado (FIB), se pueden unir nanocables metálicos flexibles a un Micromanipulador típicamente rígido .
Las principales ventajas de este método incluyen una reducción significativa del tiempo de preparación de la muestra (soldadura rápida y corte de nanocables con una corriente de haz baja) y la minimización de la flexión inducida por tensión, la contaminación con Pt y el daño del haz de iones. [59] Esta técnica es particularmente adecuada para la preparación de muestras de microscopía electrónica in situ .
Las muestras también se pueden replicar usando una película de acetato de celulosa , la película posteriormente se recubre con un metal pesado como el platino, la película original se disuelve y la réplica se reproduce en el TEM. Se utilizan variaciones de la técnica de réplica tanto para materiales como para muestras biológicas. En la ciencia de materiales, un uso común es examinar la superficie de fractura reciente de aleaciones metálicas.
Las capacidades del TEM pueden ampliarse aún más mediante etapas y detectores adicionales, a veces incorporados en el mismo microscopio.
Un TEM se puede transformar en un microscopio electrónico de transmisión de barrido (STEM) mediante la adición de un sistema que traza un haz convergente a través de la muestra para formar la imagen, cuando se combina con detectores adecuados. Se utilizan bobinas de escaneo para desviar el haz, por ejemplo mediante un desplazamiento electrostático del haz, donde luego el haz se recoge utilizando un detector de corriente como una copa de Faraday , que actúa como un contador directo de electrones. Al correlacionar el recuento de electrones con la posición del haz de exploración (conocido como "sonda"), se puede medir el componente transmitido del haz. Los componentes no transmitidos pueden obtenerse mediante inclinación del haz o mediante el uso de detectores anulares de campo oscuro .
Fundamentalmente, TEM y STEM están vinculados mediante la reciprocidad de Helmholtz . Un STEM es un TEM en el que la fuente de electrones y el punto de observación se han cambiado en relación con la dirección de viaje del haz de electrones. Vea los diagramas de rayos en la figura de la derecha. El instrumento STEM efectivamente se basa en la misma configuración óptica que un TEM, pero opera invirtiendo la dirección de viaje de los electrones (o invirtiendo el tiempo) durante el funcionamiento de un TEM. En lugar de utilizar una apertura para controlar los electrones detectados, como en TEM, un STEM utiliza varios detectores con ángulos de recolección que pueden ajustarse según los electrones que el usuario desee capturar.
Un microscopio electrónico de bajo voltaje (LVEM) funciona con un voltaje de aceleración de electrones relativamente bajo, entre 5 y 25 kV. Algunos de ellos pueden ser una combinación de SEM, TEM y STEM en un único instrumento compacto. El bajo voltaje aumenta el contraste de la imagen, lo cual es especialmente importante para muestras biológicas. Este aumento del contraste reduce significativamente, o incluso elimina, la necesidad de teñir. Son posibles resoluciones de unos pocos nm en los modos TEM, SEM y STEM. La baja energía del haz de electrones permite utilizar imanes permanentes como lentes y, por tanto, una columna en miniatura que no requiere refrigeración. [60] [61]
La microscopía electrónica de transmisión criogénica (Cryo-TEM) utiliza un TEM con un portamuestras capaz de mantener la muestra a temperaturas de nitrógeno líquido o helio líquido . Esto permite obtener imágenes de muestras preparadas en hielo vítreo , la técnica de preparación preferida para obtener imágenes de moléculas individuales o conjuntos macromoleculares , [62] obtener imágenes de interfaces vitrificadas de electrolito sólido, [63] y obtener imágenes de materiales que son volátiles en alto vacío a temperatura ambiente, como como azufre. [64]
También se pueden realizar experimentos in situ en TEM utilizando cámaras de muestras con bombeo diferencial o soportes especializados. [65] Los tipos de experimentos in situ incluyen el estudio de nanomateriales, [66] muestras biológicas, reacciones químicas de moléculas, [67] microscopía electrónica en fase líquida , [68] [69] y pruebas de deformación de materiales. [70]
Durante el calentamiento se producen muchas transformaciones de fase. Además, el engrosamiento y el crecimiento del grano, junto con otros procesos relacionados con la difusión, ocurren más rápidamente a temperaturas elevadas, donde se mejora la cinética, lo que permite la observación de fenómenos relacionados bajo microscopía electrónica de transmisión en escalas de tiempo razonables. Esto también permite la observación de fenómenos que ocurren a temperaturas elevadas y desaparecen o no se conservan uniformemente en muestras ex situ.
El TEM de alta temperatura introduce varios desafíos adicionales que deben abordarse en la mecánica de los soportes de alta temperatura, incluidos, entre otros, la corrección de la deriva, la medición de temperatura y la disminución de la resolución espacial a expensas de soportes más complejos. [71] [72]
La deriva de la muestra en el TEM es linealmente proporcional al diferencial de temperatura entre la habitación y el soporte. Con temperaturas de hasta 1500 °C en los soportes modernos, las muestras pueden experimentar una deriva significativa y un desplazamiento vertical (abultamiento), lo que requiere ajustes continuos de enfoque o etapa, lo que induce una pérdida de resolución y una deriva mecánica. [73] [74] Laboratorios y fabricantes individuales han desarrollado software junto con sistemas de enfriamiento avanzados para corregir la deriva térmica en función de la temperatura prevista en la cámara de muestra [71] [74] [75] Estos sistemas suelen tardar entre 30 minutos y muchas horas para que los cambios de muestra se estabilicen. Si bien se han logrado avances significativos, no se ha creado ningún accesorio TEM universal para tener en cuenta la deriva a temperaturas elevadas. [72] [73] [75]
Un desafío adicional para muchos de estos poseedores especializados es conocer la temperatura local de la muestra. Muchos soportes de alta temperatura utilizan un filamento de tungsteno para calentar localmente la muestra. [71] [74] La ambigüedad en la temperatura en los calentadores de hornos (cable W) con termopares surge del contacto térmico entre el horno y la rejilla TEM; complicado por gradientes de temperatura a lo largo de la muestra causados por la variación de la conductividad térmica con diferentes muestras y materiales de rejilla. [72] Con diferentes soportes, tanto comerciales como fabricados en laboratorio, se encuentran disponibles diferentes métodos para crear la calibración de temperatura. Fabricantes como Gatan utilizan pirometría IR para medir los gradientes de temperatura en toda su muestra. Un método aún mejor para calibrar es la espectroscopia Raman, que mide la temperatura local del polvo de Si en ventanas transparentes a los electrones y calibra cuantitativamente la pirometría IR. Estas mediciones tienen una precisión garantizada dentro del 5%. Los laboratorios de investigación también han realizado sus propias calibraciones en soportes comerciales. Los investigadores del NIST utilizaron espectroscopía Raman para mapear el perfil de temperatura de una muestra en una cuadrícula TEM y lograr mediciones muy precisas para mejorar su investigación. [76] De manera similar, un grupo de investigación en Alemania utilizó la difracción de rayos X para medir ligeros cambios en el espaciado de la red causados por cambios en la temperatura para calcular la temperatura exacta en el soporte. Este proceso requirió una calibración cuidadosa y una óptica TEM exacta. [77] Otros ejemplos incluyen el uso de EELS para medir la temperatura local mediante cambios en la densidad del gas, [78] y cambios de resistividad. [72]
La resolución óptima en un TEM se logra cuando las aberraciones esféricas se corrigen con lentes objetivos. Sin embargo, debido a la geometría de la mayoría de los TEM, la inserción de grandes soportes in situ requiere que el usuario comprometa la lente del objetivo y soporte aberraciones esféricas. Por lo tanto, existe un compromiso entre el ancho del espacio de la pieza polar y la resolución espacial por debajo de 0,1 nm. Grupos de investigación de varias instituciones han intentado superar las aberraciones esféricas mediante el uso de monocromadores para lograr una resolución de 0,05 nm con una separación entre piezas polares de 5 mm. [79]
La alta resolución de TEM permite monitorear la muestra en cuestión en una escala de longitud que va desde cientos de nanómetros hasta varios angstroms. Esto permite la visualización de deformaciones elásticas y plásticas a través de campos de deformación, así como el movimiento de defectos cristalográficos , como distorsiones de la red y movimientos de dislocación . Al observar simultáneamente los fenómenos de deformación y medir la respuesta mecánica in situ, es posible conectar la información de las pruebas nanomecánicas con modelos que describen tanto la sutileza como la complejidad de cómo los materiales responden al estrés y la deformación. [80] Las propiedades del material y la precisión de los datos obtenidos de tales pruebas nanomecánicas están determinadas en gran medida por el soporte de tensión mecánico que se utiliza. Los soportes de deformación actuales tienen la capacidad de realizar ensayos de tracción , nanoindentación , ensayos de compresión, ensayos de corte y ensayos de flexión de materiales. [81]
Uno de los pioneros de los soportes clásicos fue Heinz GF Wilsdorf, quien realizó una prueba de tracción dentro de un TEM en 1958. [82] En un experimento típico, se cortan muestras de TEM transparentes a los electrones para darles forma y se pegan a una rejilla deformable. Los avances en micromanipuladores también han permitido realizar pruebas de tracción de nanocables y películas delgadas . La rejilla deformable se fija al soporte de tracción clásico que estira la muestra mediante un eje largo y rígido unido a una caja de engranajes helicoidales accionada por un motor eléctrico ubicado en una carcasa fuera del TEM. Normalmente, las velocidades de deformación oscilan entre 10 nm/s y 10 μm/s. [83] Los soportes hechos a medida que amplían la actuación de deformación simple han permitido realizar pruebas de flexión utilizando un soporte de flexión [84] y pruebas de corte utilizando un soporte de muestra de corte. [85] Las propiedades típicas de la muestra medidas en estos experimentos son el límite elástico , el módulo elástico , el módulo de corte , la resistencia a la tracción , la resistencia a la flexión y la resistencia al corte . Para estudiar las propiedades mecánicas dependientes de la temperatura de las muestras TEM, el soporte se puede enfriar mediante un dedo frío conectado a un depósito de nitrógeno líquido. Para experimentos de alta temperatura, la muestra TEM también se puede calentar a través de un horno miniaturizado o un láser que normalmente puede alcanzar los 1000 °C. [86]
Los soportes de nanoindentación realizan una prueba de dureza en el material en cuestión presionando una punta dura en una superficie plana pulida y midiendo la fuerza aplicada y el desplazamiento resultante en la muestra TEM a través de un cambio en la capacitancia entre una referencia y una placa electrostática móvil adjunta. hasta la punta. [87] Las propiedades típicas de las muestras medidas son la dureza y el módulo de elasticidad . Aunque la nanoindentación era posible desde principios de la década de 1980, su investigación utilizando un TEM se informó por primera vez en 2001, cuando se investigó una muestra de aluminio depositada sobre una cuña de silicio. [88] Para los experimentos de nanoindentación, las muestras TEM generalmente tienen forma de cuñas usando un pulidor de trípode, una ventana de barra en H o un micronanopilar usando un haz de iones enfocado para crear suficiente espacio para presionar una punta en la ubicación transparente de electrones deseada. Las puntas del penetrador suelen ser de tipo punzón plano, piramidales o en forma de cuña alargadas en la dirección z. [89] Las puntas piramidales ofrecen una alta precisión del orden de 10 nm pero sufren deslizamiento de la muestra, mientras que los penetradores de cuña tienen un mayor contrato para evitar el deslizamiento pero requieren un análisis de elementos finitos para modelar la tensión transmitida ya que la alta área de contacto con la muestra TEM hace que esto Casi una prueba de compresión. [90]
Los soportes basados en sistemas microelectromecánicos (MEM) proporcionan una plataforma económica y personalizable para realizar pruebas mecánicas en muestras que antes eran difíciles de trabajar, como micropilares, nanocables y películas delgadas. [91] Los MEM pasivos se utilizan como dispositivos simples de empujar para tirar para pruebas mecánicas in situ. Normalmente, se utiliza un soporte de nanoindentación para aplicar una fuerza de empuje en el sitio de la indentación. Usando una geometría de brazos, esta fuerza de empuje se traduce en una fuerza de tracción sobre un par de almohadillas de tracción a las que se une la muestra. Por lo tanto, una compresión aplicada en el exterior de los MEM se traduce en una tensión en el espacio central donde se encuentra la muestra de TEM. La curva de fuerza-desplazamiento resultante debe corregirse realizando la misma prueba en MEM vacíos sin la muestra de TEM para tener en cuenta la rigidez de los MEM vacíos. Las dimensiones y rigidez de los MEM se pueden modificar para realizar pruebas de tracción en muestras de diferentes tamaños con diferentes cargas. Para facilitar el proceso de actuación, se han desarrollado MEM activos con actuadores y sensores integrados . Estos dispositivos funcionan aplicando tensión utilizando energía eléctrica y midiendo la tensión mediante variaciones de capacitancia . [92] También se han desarrollado MEM accionados electrostáticamente para adaptarse a fuerzas aplicadas muy bajas en el rango de 1-100 nN. [93]
Gran parte de la investigación actual se centra en el desarrollo de soportes de muestras que puedan realizar pruebas mecánicas y al mismo tiempo crear un estímulo ambiental, como cambios de temperatura, velocidades de deformación variables y diferentes entornos de gases. Además, la aparición de detectores de alta resolución está permitiendo monitorear el movimiento de las dislocaciones y las interacciones con otros defectos y superando los límites de las mediciones de deformación subnanométrica. Las mediciones de TEM mecánicas in situ se combinan de forma rutinaria con otras mediciones de TEM estándar, como EELS y XEDS , para alcanzar una comprensión integral de la estructura y las propiedades de la muestra. [94]
Los TEM de investigación modernos pueden incluir correctores de aberración [19] para reducir la cantidad de distorsión en la imagen. También se pueden utilizar monocromadores de haz incidente que reducen la dispersión de energía del haz de electrones incidente a menos de 0,15 eV . [19] Los principales fabricantes de TEM con corrección de aberraciones incluyen JEOL , Hitachi High-technologies, FEI Company y NION.
Es posible alcanzar una resolución temporal mucho mayor que la velocidad de lectura de los detectores de electrones con el uso de electrones pulsados . Los pulsos se pueden producir modificando la fuente de electrones para permitir la fotoemisión activada por láser [95] o instalando un supresor de haz ultrarrápido. [96] Este enfoque se denomina microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida cuando se utiliza iluminación estroboscópica de sonda de bomba : una imagen se forma mediante la acumulación de muchos pulsos de electrones ultracortos (típicamente de cientos de femtosegundos) con un retraso de tiempo fijo entre la llegada del electrón pulso y la excitación de la muestra. Por otro lado, el uso de una secuencia única o corta de pulsos de electrones con un número suficiente de electrones para formar una imagen a partir de cada pulso se denomina microscopía electrónica de transmisión dinámica. En TEM ultrarrápido es posible una resolución temporal de hasta cientos de femtosegundos y una resolución espacial comparable a la disponible con una fuente de emisión de campo Schottky . [97] Utilizando el enfoque de activación de fotones, [98] la resolución temporal en el microscopio electrónico ultrarrápido alcanza los 30 fs, lo que permite obtener imágenes de la dinámica atómica y electrónica ultrarrápida de la materia. [99] Sin embargo, la técnica sólo puede visualizar procesos reversibles que pueden activarse de forma reproducible millones de veces. El TEM dinámico puede resolver procesos irreversibles de hasta decenas de nanosegundos y decenas de nanómetros. [100]
La técnica fue pionera a principios de la década de 2000 en laboratorios de Alemania ( Universidad Técnica de Berlín [95] ) y de EE. UU. ( Caltech [101] [102] y Laboratorio Nacional Lawrence Livermore [103] [104] ). TEM ultrarrápido y TEM dinámico han hecho posible la investigación en tiempo real de numerosos fenómenos físicos y químicos a nanoescala.
Una variante interesante de la técnica de microscopía electrónica de transmisión ultrarrápida es la microscopía electrónica de campo cercano inducida por fotones (PINEM). Este último se basa en el acoplamiento inelástico entre electrones y fotones en presencia de una superficie o nanoestructura. [105] Este método permite investigar campos electromagnéticos a nanoescala que varían en el tiempo en un microscopio electrónico, así como dar forma dinámicamente a las propiedades ondulatorias del haz de electrones.
La técnica TEM tiene varios inconvenientes. Muchos materiales requieren una preparación exhaustiva de la muestra para producir una muestra lo suficientemente delgada como para ser transparente a los electrones, lo que hace que el análisis TEM sea un proceso relativamente lento con un bajo rendimiento de muestras. La estructura de la muestra también puede cambiarse durante el proceso de preparación. Además, el campo de visión es relativamente pequeño, lo que plantea la posibilidad de que la región analizada no sea característica de toda la muestra. Existe la posibilidad de que el haz de electrones dañe la muestra, especialmente en el caso de materiales biológicos.
El límite de resolución que se puede obtener en un TEM se puede describir de varias maneras y normalmente se lo denomina límite de información del microscopio. Un valor comúnmente utilizado [ cita necesaria ] es un valor de corte de la función de transferencia de contraste , una función que generalmente se cita en el dominio de la frecuencia para definir la reproducción de frecuencias espaciales de objetos en el plano del objeto mediante la óptica del microscopio. Una frecuencia de corte, q máx , para la función de transferencia se puede aproximar con la siguiente ecuación, donde C s es el coeficiente de aberración esférica y λ es la longitud de onda del electrón: [39]
Para un microscopio de 200 kV, con aberraciones esféricas parcialmente corregidas ("de tercer orden") y un valor C s de 1 µm, [107] un valor de corte teórico podría ser 1/ q max = 42 pm . [39] El mismo microscopio sin corrector tendría C s = 0,5 mm y, por lo tanto, un límite de 200 pm. [107] Las aberraciones esféricas se suprimen hasta el tercer o quinto orden en los microscopios " con corrección de aberraciones ". Sin embargo, su resolución está limitada por la geometría de la fuente de electrones y el brillo y las aberraciones cromáticas en el sistema de lentes del objetivo. [19] [108]
La representación en el dominio de la frecuencia de la función de transferencia de contraste a menudo puede tener una naturaleza oscilatoria, [109] que puede sintonizarse ajustando el valor focal de la lente del objetivo. Esta naturaleza oscilatoria implica que el microscopio reproduce fielmente algunas frecuencias espaciales, mientras que otras se suprimen. Al combinar múltiples imágenes con diferentes frecuencias espaciales, el uso de técnicas como la reconstrucción de series focales se puede utilizar para mejorar la resolución del TEM de manera limitada. [39] La función de transferencia de contraste puede, hasta cierto punto, aproximarse experimentalmente mediante técnicas como la transformación de imágenes de Fourier de material amorfo, como el carbono amorfo .
Más recientemente, los avances en el diseño de correctores de aberraciones han permitido reducir las aberraciones esféricas [110] y lograr una resolución inferior a 0,5 Ångströms (50 pm) [108] con aumentos superiores a 50 millones de veces. [111] La resolución mejorada permite obtener imágenes de átomos más ligeros que dispersan los electrones de manera menos eficiente, como los átomos de litio en los materiales de las baterías de litio. [112] La capacidad de determinar la posición de los átomos dentro de los materiales ha convertido al HRTEM en una herramienta indispensable para la investigación y el desarrollo de nanotecnología en muchos campos, incluida la catálisis heterogénea y el desarrollo de dispositivos semiconductores para electrónica y fotónica. [113]
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