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Metilación del ADN

Representación de una molécula de ADN que se encuentra metilada. Las dos esferas blancas representan grupos metilo . Están unidos a dos moléculas de nucleótidos de citosina que forman la secuencia de ADN.

La metilación del ADN es un proceso biológico por el cual se añaden grupos metilo a la molécula de ADN . La metilación puede cambiar la actividad de un segmento de ADN sin cambiar la secuencia. Cuando se encuentra en un promotor de genes , la metilación del ADN normalmente actúa para reprimir la transcripción de genes . En los mamíferos, la metilación del ADN es esencial para el desarrollo normal y está asociada con una serie de procesos clave, entre ellos la impronta genómica , la inactivación del cromosoma X , la represión de elementos transponibles , el envejecimiento y la carcinogénesis .

A partir de 2016 se han encontrado dos nucleobases en las que se produce la metilación enzimática natural del ADN: la adenina y la citosina . Las bases modificadas son la N 6 -metiladenina, [1] la 5-metilcitosina [2] y la N 4 -metilcitosina. [3]

La metilación de citosina está muy extendida tanto en eucariotas como en procariotas , aunque la tasa de metilación del ADN de la citosina puede diferir en gran medida entre especies: el 14% de las citosinas están metiladas en Arabidopsis thaliana , del 4% al 8% en Physarum , [4] el 7,6% en Mus musculus , el 2,3% en Escherichia coli , el 0,03% en Drosophila ; la metilación es esencialmente indetectable en Dictyostelium ; [5] [6] y prácticamente ausente (del 0,0002 al 0,0003%) en Caenorhabditis [7] o en hongos como Saccharomyces cerevisiae y S. pombe (pero no en N. crassa ). [8] [9] : 3699  La metilación de adenina se ha observado en ADN bacteriano, vegetal y recientemente en ADN de mamíferos, [10] [11] pero ha recibido considerablemente menos atención.

La metilación de la citosina para formar 5-metilcitosina ocurre en la misma posición 5 en el anillo de pirimidina donde se encuentra el grupo metilo de la base de ADN timina ; la misma posición distingue a la timina de la base de ARN análoga uracilo , que no tiene grupo metilo. La desaminación espontánea de la 5-metilcitosina la convierte en timina. Esto da como resultado un desajuste T:G. Los mecanismos de reparación luego lo corrigen de nuevo al par C:G original; alternativamente, pueden sustituir A por G, convirtiendo el par C:G original en un par T:A, cambiando efectivamente una base e introduciendo una mutación. Esta base mal incorporada no se corregirá durante la replicación del ADN ya que la timina es una base de ADN. Si el desajuste no se repara y la célula entra en el ciclo celular, la hebra que lleva la T se complementará con una A en una de las células hijas, de modo que la mutación se vuelve permanente. El uso casi universal de timina exclusivamente en el ADN y de uracilo exclusivamente en el ARN puede haber evolucionado como un mecanismo de control de errores, para facilitar la eliminación de uracilos generados por la desaminación espontánea de la citosina. [12] Se ha pensado que la metilación del ADN, así como muchas de sus metiltransferasas de ADN contemporáneas, evolucionaron a partir de la actividad de metilación del ARN primitivo del mundo temprano y está respaldada por varias líneas de evidencia. [13]

En plantas y otros organismos, la metilación del ADN se encuentra en tres contextos de secuencia diferentes: CG (o CpG ), CHG o CHH (donde H corresponde a A, T o C). Sin embargo, en los mamíferos, la metilación del ADN se encuentra casi exclusivamente en dinucleótidos CpG, y las citosinas de ambas cadenas suelen estar metiladas. Sin embargo, la metilación no CpG se puede observar en células madre embrionarias , [14] [15] [16] y también se ha indicado en el desarrollo neuronal . [17] Además, la metilación no CpG también se ha observado en células progenitoras hematopoyéticas , y se produjo principalmente en un contexto de secuencia CpApC. [18]

Función conservada de la metilación del ADN

Panorama típico de la metilación del ADN en mamíferos

El panorama de metilación del ADN de los vertebrados es muy particular en comparación con otros organismos. En los mamíferos, alrededor del 75% de los dinucleótidos CpG están metilados en las células somáticas [19] y la metilación del ADN aparece como un estado predeterminado que debe excluirse específicamente de ubicaciones definidas [16] [20] Por el contrario, el genoma de la mayoría de las plantas, invertebrados, hongos o protistos muestra patrones de metilación en "mosaico", donde solo se seleccionan elementos genómicos específicos, y se caracterizan por la alternancia de dominios metilados y no metilados [21] [22]

Metilación de citosina y luego desaminación a timina.

La alta metilación de CpG en los genomas de mamíferos tiene un costo evolutivo porque aumenta la frecuencia de mutaciones espontáneas. La pérdida de grupos amino ocurre con una alta frecuencia en las citosinas, con diferentes consecuencias según su metilación. Los residuos C metilados se desaminan espontáneamente para formar residuos T con el tiempo; por lo tanto, los dinucleótidos CpG se desaminan constantemente para formar dinucleótidos TpG, lo que se evidencia por la subrepresentación de dinucleótidos CpG en el genoma humano (ocurren solo en el 21% de la frecuencia esperada) [23] . (Por otro lado, la desaminación espontánea de residuos C no metilados da lugar a residuos U, un cambio que es rápidamente reconocido y reparado por la célula).

Islas CpG

En los mamíferos, la única excepción para esta disminución global de CpG reside en una categoría específica de secuencias ricas en GC y CpG denominadas islas CpG que generalmente no están metiladas y, por lo tanto, conservan el contenido esperado de CpG. [24] Las islas CpG generalmente se definen como regiones con: 1) una longitud mayor a 200 pb, 2) un contenido de G+C mayor al 50%, 3) una relación de CpG observado a esperado mayor a 0,6, aunque a veces se utilizan otras definiciones. [25] Excluyendo secuencias repetidas, hay alrededor de 25.000 islas CpG en el genoma humano, el 75% de las cuales tienen menos de 850 pb de longitud. [23] Son unidades reguladoras importantes y alrededor del 50% de las islas CpG se encuentran en regiones promotoras de genes, mientras que otro 25% se encuentra en cuerpos de genes, que a menudo sirven como promotores alternativos. Recíprocamente, alrededor del 60-70% de los genes humanos tienen una isla CpG en su región promotora. [26] [27] La ​​mayoría de las islas CpG no están metiladas de manera constitutiva y están enriquecidas para la modificación permisiva de la cromatina , como la metilación de H3K4 . En los tejidos somáticos, solo el 10% de las islas CpG están metiladas, y la mayoría de ellas se encuentran en regiones intergénicas e intragénicas. [ cita requerida ]

Represión de promotores densos en CpG

La metilación del ADN probablemente estuvo presente en algún grado en los ancestros eucariotas más tempranos. En prácticamente todos los organismos analizados, la metilación en las regiones promotoras se correlaciona negativamente con la expresión génica. [21] [28] Los promotores densos en CpG de genes transcritos activamente nunca están metilados, pero, recíprocamente, los genes transcripcionalmente silenciosos no necesariamente llevan un promotor metilado. En ratones y humanos, alrededor del 60-70% de los genes tienen una isla CpG en su región promotora y la mayoría de estas islas CpG permanecen sin metilar independientemente de la actividad transcripcional del gen, tanto en tipos de células diferenciadas como indiferenciadas. [29] [30] Cabe destacar que, mientras que la metilación del ADN de las islas CpG está inequívocamente vinculada con la represión transcripcional, la función de la metilación del ADN en promotores pobres en CG sigue sin estar clara; aunque hay poca evidencia de que podría ser funcionalmente relevante. [31]

La metilación del ADN puede afectar la transcripción de genes de dos maneras. En primer lugar, la metilación del ADN en sí puede impedir físicamente la unión de las proteínas transcripcionales al gen [32] y, en segundo lugar, y probablemente más importante, el ADN metilado puede estar unido por proteínas conocidas como proteínas del dominio de unión a metil-CpG (MBD). Las proteínas MBD luego reclutan proteínas adicionales al locus, como histonas desacetilasas y otras proteínas de remodelación de la cromatina que pueden modificar las histonas , formando así una cromatina compacta e inactiva, denominada heterocromatina . Este vínculo entre la metilación del ADN y la estructura de la cromatina es muy importante. En particular, la pérdida de la proteína 2 de unión a metil-CpG (MeCP2) se ha implicado en el síndrome de Rett ; y la proteína 2 del dominio de unión a metil-CpG (MBD2) media el silenciamiento transcripcional de genes hipermetilados en el "cáncer". [ cita requerida ]

Represión de elementos transponibles

La metilación del ADN es un potente represor transcripcional, al menos en contextos densos de CpG. La represión transcripcional de genes codificadores de proteínas parece limitada esencialmente a clases muy específicas de genes que necesitan ser silenciados permanentemente y en casi todos los tejidos. Si bien la metilación del ADN no tiene la flexibilidad requerida para el ajuste fino de la regulación génica, su estabilidad es perfecta para asegurar el silenciamiento permanente de los elementos transponibles . [33] El control de transposones es una de las funciones más antiguas de la metilación del ADN que comparten animales, plantas y múltiples protistos. [34] Incluso se sugiere que la metilación del ADN evolucionó precisamente para este propósito. [35]

Expansión del genoma

Se sabe que la metilación de elementos transponibles en el ADN está relacionada con la expansión del genoma. Sin embargo, el factor evolutivo que impulsa la expansión del genoma sigue siendo desconocido. Existe una clara correlación entre el tamaño del genoma y el CpG, lo que sugiere que la metilación de elementos transponibles en el ADN condujo a un aumento notable de la masa del ADN. [36]

Metilación del cuerpo génico de genes altamente transcritos

Una función que parece incluso más conservada que el silenciamiento de transposones se correlaciona positivamente con la expresión génica. En casi todas las especies donde hay metilación del ADN, la metilación del ADN está especialmente enriquecida en el cuerpo de genes altamente transcritos. [21] [28] La función de la metilación del cuerpo del gen no se entiende bien. Un conjunto de evidencias sugiere que podría regular el empalme [37] y suprimir la actividad de las unidades transcripcionales intragénicas (promotores crípticos o elementos transponibles). [38] La metilación del cuerpo del gen parece estar estrechamente vinculada a la metilación de H3K36. En levaduras y mamíferos, la metilación de H3K36 está altamente enriquecida en el cuerpo de genes altamente transcritos. Al menos en levaduras, H3K36me3 recluta enzimas como las histonas desacetilasas para condensar la cromatina y prevenir la activación de los sitios de inicio crípticos. [39] En los mamíferos, el dominio PWWP de DNMT3a y DNMT3b se une a H3K36me3 y las dos enzimas se reclutan al cuerpo de genes transcritos activamente. [ cita requerida ]

En los mamíferos

Dinámica de la metilación del ADN durante el desarrollo embrionario del ratón. E3,5-E6, etc., se refieren a los días posteriores a la fecundación. CGP: células germinales primordiales.

Durante el desarrollo embrionario

Los patrones de metilación del ADN se borran en gran medida y luego se restablecen entre generaciones en los mamíferos. Casi todas las metilaciones de los padres se borran, primero durante la gametogénesis y nuevamente en la embriogénesis temprana , con desmetilación y remetilación ocurriendo cada vez. La desmetilación en la embriogénesis temprana ocurre en el período de preimplantación en dos etapas: inicialmente en el cigoto , luego durante los primeros ciclos de replicación embrionaria de mórula y blástula . Luego tiene lugar una ola de metilación durante la etapa de implantación del embrión, con islas CpG protegidas de la metilación. Esto da como resultado una represión global y permite que los genes de mantenimiento se expresen en todas las células. En la etapa posterior a la implantación, los patrones de metilación son específicos de la etapa y el tejido, con cambios que definirían cada tipo de célula individual que duran de manera estable durante un largo período. [40] Los estudios sobre yemas de las extremidades de ratas durante la embriogénesis han ilustrado aún más la naturaleza dinámica de la metilación del ADN en el desarrollo. En este contexto, se observaron variaciones en la metilación global del ADN en diferentes etapas de desarrollo y condiciones de cultivo, lo que destaca la intrincada regulación de la metilación durante la organogénesis y sus posibles implicaciones para las estrategias de medicina regenerativa. [41]

Si bien la metilación del ADN no es necesaria per se para el silenciamiento transcripcional, se cree que representa un estado "bloqueado" que definitivamente inactiva la transcripción. En particular, la metilación del ADN parece crítica para el mantenimiento del silenciamiento monoalélico en el contexto de la impronta genómica y la inactivación del cromosoma X. [42] [43] En estos casos, los alelos expresados ​​y silenciosos difieren por su estado de metilación, y la pérdida de la metilación del ADN da como resultado la pérdida de la impronta y la reexpresión de Xist en las células somáticas. Durante el desarrollo embrionario, pocos genes cambian su estado de metilación, con la importante excepción de muchos genes expresados ​​específicamente en la línea germinal. [44] La metilación del ADN parece absolutamente necesaria en las células diferenciadas , ya que la inactivación de cualquiera de las tres metiltransferasas de ADN competentes da como resultado letalidad embrionaria o posparto. En cambio, la metilación del ADN es prescindible en tipos celulares indiferenciados, como la masa celular interna del blastocisto, las células germinales primordiales o las células madre embrionarias. Dado que la metilación del ADN parece regular directamente sólo un número limitado de genes, sigue siendo una incógnita cómo la ausencia de metilación del ADN causa con precisión la muerte de células diferenciadas.

Debido al fenómeno de la impronta genómica , los genomas maternos y paternos están marcados de forma diferencial y deben reprogramarse adecuadamente cada vez que pasan por la línea germinal. Por lo tanto, durante la gametogénesis , las células germinales primordiales deben tener sus patrones de metilación de ADN biparental originales borrados y restablecidos en función del sexo del progenitor transmisor. Después de la fertilización, los genomas paterno y materno se desmetilan y remetilan una vez más (excepto las regiones metiladas de forma diferencial asociadas con los genes impresos). Esta reprogramación es probablemente necesaria para la totipotencia del embrión recién formado y el borrado de los cambios epigenéticos adquiridos. [45]

En el cáncer

En muchos procesos patológicos, como el cáncer , las islas CpG promotoras de genes adquieren una hipermetilación anormal, lo que da como resultado un silenciamiento transcripcional que puede ser heredado por las células hijas después de la división celular. [46] Las alteraciones de la metilación del ADN se han reconocido como un componente importante del desarrollo del cáncer. La hipometilación, en general, surge antes y está vinculada a la inestabilidad cromosómica y la pérdida de la impronta, mientras que la hipermetilación está asociada con los promotores y puede surgir de forma secundaria al silenciamiento de genes (supresores de oncogenes), pero podría ser un objetivo para la terapia epigenética . [47] En contextos de desarrollo, los cambios dinámicos en los patrones de metilación del ADN también tienen implicaciones significativas. Por ejemplo, en los brotes de las extremidades de ratas, los cambios en el estado de metilación se asociaron con diferentes etapas de la condrogénesis, lo que sugiere un vínculo potencial entre la metilación del ADN y la progresión de ciertos procesos de desarrollo. [41]

La hipometilación global también se ha visto implicada en el desarrollo y progresión del cáncer a través de diferentes mecanismos. [48] Normalmente, hay hipermetilación de genes supresores de tumores e hipometilación de oncogenes . [49]

En general, durante la progresión hacia el cáncer, cientos de genes se silencian o se activan . Aunque el silenciamiento de algunos genes en los cánceres ocurre por mutación, una gran proporción del silenciamiento de genes cancerígenos es resultado de una metilación alterada del ADN (ver Metilación del ADN en el cáncer ). La metilación del ADN que causa el silenciamiento en el cáncer ocurre típicamente en múltiples sitios CpG en las islas CpG que están presentes en los promotores de los genes codificadores de proteínas. [ cita requerida ]

Las expresiones alteradas de microARN también silencian o activan muchos genes en la progresión hacia el cáncer (ver microARN en el cáncer ). La expresión alterada de microARN ocurre a través de la hiper/hipometilación de sitios CpG en islas CpG en promotores que controlan la transcripción de los microARN .

El silenciamiento de los genes de reparación del ADN a través de la metilación de las islas CpG en sus promotores parece ser especialmente importante en la progresión hacia el cáncer (véase metilación de los genes de reparación del ADN en el cáncer ). [ cita requerida ]

En la aterosclerosis

Las modificaciones epigenéticas, como la metilación del ADN, se han relacionado con enfermedades cardiovasculares, incluida la aterosclerosis . En modelos animales de aterosclerosis, el tejido vascular, así como las células sanguíneas, como las células sanguíneas mononucleares, presentan una hipometilación global con áreas de hipermetilación específicas de genes. Los polimorfismos de metilación del ADN pueden utilizarse como un biomarcador temprano de la aterosclerosis, ya que están presentes antes de que se observen las lesiones, lo que puede proporcionar una herramienta temprana para la detección y la prevención de riesgos. [50]

Dos de los tipos de células objetivo de los polimorfismos de metilación del ADN son los monocitos y los linfocitos, que experimentan una hipometilación general. Un mecanismo propuesto detrás de esta hipometilación global son los niveles elevados de homocisteína que causan hiperhomocisteinemia , un factor de riesgo conocido para la enfermedad cardiovascular. Los niveles plasmáticos altos de homocisteína inhiben las metiltransferasas del ADN, lo que causa hipometilación. La hipometilación del ADN afecta a los genes que alteran la proliferación de células musculares lisas, causan disfunción de las células endoteliales y aumentan los mediadores inflamatorios, todos los cuales son críticos en la formación de lesiones ateroscleróticas. [51] Los niveles altos de homocisteína también resultan en la hipermetilación de las islas CpG en la región promotora del gen del receptor de estrógeno alfa (ERα), causando su regulación negativa. [52] ERα protege contra la aterosclerosis debido a su acción como supresor del crecimiento, haciendo que las células musculares lisas permanezcan en un estado inactivo. [53] La hipermetilación del promotor ERα permite que las células musculares lisas íntimas proliferen excesivamente y contribuyan al desarrollo de la lesión aterosclerótica. [54]

Otro gen que experimenta un cambio en el estado de metilación en la aterosclerosis es el transportador de monocarboxilato (MCT3), que produce una proteína responsable del transporte de lactato y otros cuerpos cetónicos fuera de muchos tipos de células, incluidas las células musculares lisas vasculares. En pacientes con aterosclerosis, hay un aumento en la metilación de las islas CpG en el exón 2, lo que disminuye la expresión de la proteína MCT3. La regulación negativa de MCT3 altera el transporte de lactato y aumenta significativamente la proliferación de células musculares lisas, lo que contribuye aún más a la lesión aterosclerótica. Se demostró que un experimento ex vivo utilizando el agente desmetilante Decitabina (5-aza-2-desoxicitidina) inducía la expresión de MCT3 de una manera dependiente de la dosis, ya que todos los sitios hipermetilados en la isla CpG del exón 2 se desmetilaron después del tratamiento. Esto puede servir como un nuevo agente terapéutico para tratar la aterosclerosis, aunque hasta ahora no se han realizado estudios en humanos. [55]

En caso de insuficiencia cardíaca

Además de la aterosclerosis descrita anteriormente, se han identificado cambios epigenéticos específicos en el corazón humano con insuficiencia cardíaca. Esto puede variar según la etiología de la enfermedad. Por ejemplo, en la insuficiencia cardíaca isquémica, los cambios en la metilación del ADN se han relacionado con cambios en la expresión génica que pueden dirigir la expresión génica asociada con los cambios en el metabolismo cardíaco que se sabe que ocurren. [56] Se deben explorar otras formas de insuficiencia cardíaca (por ejemplo, miocardiopatía diabética) y comorbilidades (por ejemplo, obesidad) para ver cuán comunes son estos mecanismos. Lo más sorprendente es que en el corazón humano con insuficiencia cardíaca estos cambios en la metilación del ADN están asociados con el estado racial y socioeconómico, que afectan aún más la forma en que se altera la expresión génica, [57] y pueden influir en cómo se debe tratar la insuficiencia cardíaca del individuo.

En el envejecimiento

En los seres humanos y otros mamíferos, los niveles de metilación del ADN se pueden utilizar para estimar con precisión la edad de los tejidos y los tipos de células, formando un reloj epigenético preciso . [58]

Un estudio longitudinal de niños gemelos mostró que, entre los 5 y los 10 años, hubo divergencia de los patrones de metilación debido a influencias ambientales más que genéticas. [59] Hay una pérdida global de metilación del ADN durante el envejecimiento. [49]

En un estudio que analizó los metilomas completos del ADN de las células T CD4 + en un recién nacido, un individuo de 26 años y un individuo de 103 años se observó que la pérdida de metilación es proporcional a la edad. [60] Los CpG hipometilados observados en los ADN de los centenarios en comparación con los neonatos cubrieron todos los compartimentos genómicos (promotores, regiones intergénicas , intrónicas y exónicas ). [60] Sin embargo, algunos genes se hipermetilan con la edad, incluidos los genes para el receptor de estrógeno , p16 , factor de crecimiento similar a la insulina 2 , [49] ELOVL2 [61] y FHL2 [62]

En ejercicio

Se ha demostrado que el ejercicio de alta intensidad produce una reducción de la metilación del ADN en el músculo esquelético. [63] La metilación del promotor PGC-1α y PDK4 se redujo inmediatamente después del ejercicio de alta intensidad, mientras que la metilación de PPAR-γ no se redujo hasta tres horas después del ejercicio. [63] Al mismo tiempo, seis meses de ejercicio en hombres de mediana edad previamente sedentarios dieron como resultado un aumento de la metilación en el tejido adiposo . [64] Un estudio mostró un posible aumento de la metilación del ADN genómico global de los glóbulos blancos con más actividad física en no hispanos. [65]

En la diferenciación de células B

Un estudio que investigó el metiloma de las células B a lo largo de su ciclo de diferenciación, utilizando la secuenciación de bisulfito de todo el genoma (WGBS), mostró que existe una hipometilación desde las etapas más tempranas hasta las etapas más diferenciadas. La mayor diferencia de metilación se da entre las etapas de las células B del centro germinal y las células B de memoria. Además, este estudio mostró que existe una similitud entre los tumores de células B y las células B de larga vida en sus firmas de metilación del ADN. [18]

En el cerebro

Dos revisiones resumen la evidencia de que las alteraciones de la metilación del ADN en las neuronas cerebrales son importantes en el aprendizaje y la memoria. [66] [67] El condicionamiento del miedo contextual (una forma de aprendizaje asociativo) en animales, como ratones y ratas, es rápido y es extremadamente robusto en la creación de recuerdos. [68] En ratones [69] y en ratas [70] el condicionamiento del miedo contextual, dentro de 1-24 horas, se asocia con metilaciones alteradas de varios miles de citosinas del ADN en genes de neuronas del hipocampo . Veinticuatro horas después del condicionamiento del miedo contextual, el 9,2% de los genes en las neuronas del hipocampo de la rata están metilados diferencialmente. [70] En ratones [69] , cuando se examinó a las cuatro semanas después del condicionamiento, las metilaciones y desmetilaciones del hipocampo se habían restablecido a las condiciones ingenuas originales. El hipocampo es necesario para formar recuerdos, pero los recuerdos no se almacenan allí. En el caso de estos ratones, cuatro semanas después del condicionamiento contextual del miedo, se produjeron metilaciones y desmetilaciones de CpG diferenciales sustanciales en las neuronas corticales durante el mantenimiento de la memoria, y había 1223 genes metilados diferencialmente en su corteza cingulada anterior. [69] En 2022 se resumieron los mecanismos que guían las nuevas metilaciones y desmetilaciones de ADN en el hipocampo durante el establecimiento de la memoria. [71] Esa revisión también indicó los mecanismos por los cuales los nuevos patrones de metilación dieron lugar a nuevos patrones de expresión de ARN mensajero . Estos nuevos ARN mensajeros fueron luego transportados por partículas RNP (gránulos neuronales) a las sinapsis de las neuronas, donde podrían traducirse en proteínas. [71] Los cambios activos en la metilación y desmetilación del ADN neuronal parecen actuar como controladores del escalamiento sináptico y el tráfico de receptores de glutamato en el aprendizaje y la formación de la memoria . [66]

Metiltransferasas de ADN (en mamíferos)

Posibles vías de metilación y desmetilación de la citosina. Abreviaturas: S-adenosil-L-homocisteína ( SAH ), S-adenosil-L-metionina ( SAM ), ADN metiltransferasa ( ADN MTasa ), Uracilo-ADN glicosilasa ( UNG )

En las células de mamíferos, la metilación del ADN ocurre principalmente en la posición C5 de los dinucleótidos CpG y se lleva a cabo mediante dos clases generales de actividades enzimáticas: metilación de mantenimiento y metilación de novo . [72]

La actividad de metilación de mantenimiento es necesaria para preservar la metilación del ADN después de cada ciclo de replicación del ADN celular. Sin la metiltransferasa del ADN (DNMT), la maquinaria de replicación en sí misma produciría cadenas hijas que no están metiladas y, con el tiempo, conducirían a una desmetilación pasiva. La DNMT1 es la metiltransferasa de mantenimiento propuesta que es responsable de copiar los patrones de metilación del ADN en las cadenas hijas durante la replicación del ADN. Los modelos de ratón con ambas copias de DNMT1 eliminadas son letales embrionariamente aproximadamente en el día 9, debido al requisito de la actividad de DNMT1 para el desarrollo en células de mamíferos. [ cita requerida ]

Se cree que DNMT3a y DNMT3b son las metiltransferasas de novo que establecen los patrones de metilación del ADN en las primeras etapas del desarrollo. DNMT3L es una proteína homóloga a las otras DNMT3 pero que no tiene actividad catalítica. En cambio, DNMT3L ayuda a las metiltransferasas de novo aumentando su capacidad de unirse al ADN y estimulando su actividad. Los ratones y las ratas tienen una tercera enzima metiltransferasa de novo funcional llamada DNMT3C, que evolucionó como un parálogo de Dnmt3b por duplicación en tándem en el ancestro común de los roedores Muroidea. DNMT3C cataliza la metilación de los promotores de elementos transponibles durante la espermatogénesis temprana, una actividad que se ha demostrado que es esencial para su represión epigenética y la fertilidad masculina. [73] [74] Aún no está claro si en otros mamíferos que no tienen DNMT3C (como los humanos) dependen de DNMT3B o DNMT3A para la metilación de novo de elementos transponibles en la línea germinal. Finalmente, DNMT2 (TRDMT1) ha sido identificada como un homólogo de la metiltransferasa de ADN, que contiene los 10 motivos de secuencia comunes a todas las metiltransferasas de ADN; sin embargo, DNMT2 (TRDMT1) no metila el ADN sino que metila la citosina-38 en el bucle anticodón del ARN de transferencia de ácido aspártico. [75]

Dado que muchos genes supresores de tumores son silenciados por la metilación del ADN durante la carcinogénesis , ha habido intentos de reexpresar estos genes inhibiendo los DNMT. La 5-aza-2'-desoxicitidina ( decitabina ) es un análogo de nucleósido que inhibe los DNMT atrapándolos en un complejo covalente en el ADN al evitar el paso de eliminación β de la catálisis, lo que resulta en la degradación de las enzimas. Sin embargo, para que la decitabina sea activa, debe incorporarse al genoma de la célula, lo que puede causar mutaciones en las células hijas si la célula no muere. Además, la decitabina es tóxica para la médula ósea, lo que limita el tamaño de su ventana terapéutica. Estos escollos han llevado al desarrollo de terapias de ARN antisentido que se dirigen a los DNMT degradando sus ARNm y evitando su traducción . Sin embargo, actualmente no está claro si la diana DNMT1 por sí sola es suficiente para reactivar los genes supresores de tumores silenciados por la metilación del ADN. [ cita requerida ]

En las plantas

Se han logrado avances significativos en la comprensión de la metilación del ADN en la planta modelo Arabidopsis thaliana . La metilación del ADN en plantas difiere de la de los mamíferos: mientras que la metilación del ADN en mamíferos ocurre principalmente en el nucleótido citosina en un sitio CpG , en plantas la citosina puede metilarse en sitios CpG, CpHpG y CpHpH, donde H representa cualquier nucleótido pero no guanina. [76] En general, el ADN de Arabidopsis está altamente metilado, el análisis de espectrometría de masas estimó que el 14% de las citosinas están modificadas. [9] : resumen  Más tarde, los datos de secuenciación de bisulfito estimaron que alrededor del 25% de los sitios CG de Arabidopsis están metilados, pero estos niveles varían según la ubicación geográfica de las accesiones de Arabidopsis (las plantas en el norte están más metiladas que las accesiones del sur). [77]

Las principales enzimas metiltransferasas de ADN de Arabidopsis , que transfieren y unen covalentemente grupos metilo al ADN, son DRM2, MET1 y CMT3. Tanto las proteínas DRM2 como MET1 comparten una homología significativa con las metiltransferasas de mamíferos DNMT3 y DNMT1, respectivamente, mientras que la proteína CMT3 es exclusiva del reino vegetal. Actualmente existen dos clases de metiltransferasas de ADN: 1) la clase de novo o enzimas que crean nuevas marcas de metilación en el ADN; 2) una clase de mantenimiento que reconoce las marcas de metilación en la cadena parental de ADN y transfiere nueva metilación a las cadenas hijas después de la replicación del ADN. DRM2 es la única enzima que se ha implicado como una metiltransferasa de ADN de novo . También se ha demostrado que DRM2, junto con MET1 y CMT3, está involucrada en el mantenimiento de las marcas de metilación a través de la replicación del ADN. [78] Otras metiltransferasas de ADN se expresan en plantas pero no tienen una función conocida (véase la base de datos de cromatina).

Los niveles de metilación del ADN en todo el genoma varían ampliamente entre especies de plantas, y las citosinas de Arabidopsis tienden a estar menos densamente metiladas que las de otras plantas. Por ejemplo, aproximadamente el 92,5 % de las citosinas CpG están metiladas en Beta vulgaris . [79] Los patrones de metilación también difieren entre contextos de secuencias de citosinas; universalmente, la metilación de CpG es mayor que la de CHG y CHH, y la metilación de CpG se puede encontrar tanto en genes activos como en elementos transponibles, mientras que CHG y CHH suelen relegarse a elementos transponibles silenciados. [80] [76]

No está claro cómo la célula determina las ubicaciones de la metilación de ADN de novo , pero la evidencia sugiere que para muchas (aunque no todas) ubicaciones, está involucrada la metilación de ADN dirigida por ARN (RdDM). En RdDM, se producen transcripciones de ARN específicas a partir de una plantilla de ADN genómico, y este ARN forma estructuras secundarias llamadas moléculas de ARN bicatenario. [81] Los ARN bicatenarios, a través de las vías de ARN interferente pequeño ( siRNA ) o microARN ( miRNA ), dirigen la metilación de ADN de novo de la ubicación genómica original que produjo el ARN. [81] Se cree que este tipo de mecanismo es importante en la defensa celular contra virus de ARN y/o transposones , los cuales a menudo forman un ARN bicatenario que puede ser mutagénico para el genoma del huésped. Al metilar sus ubicaciones genómicas, a través de un mecanismo aún poco comprendido, se desactivan y ya no están activos en la célula, protegiendo al genoma de su efecto mutagénico. Recientemente, se ha descrito que la metilación del ADN es el principal determinante de la formación de cultivos embriogénicos a partir de explantos en plantas leñosas y se considera el principal mecanismo que explica la pobre respuesta de los explantos maduros a la embriogénesis somática en las plantas (Isah 2016). [ cita requerida ]

En los insectos

Diversos órdenes de insectos muestran patrones variados de metilación del ADN, desde niveles casi indetectables en moscas hasta niveles bajos en mariposas y más altos en chinches verdaderas y algunas cucarachas (hasta el 14% de todos los sitios CG en Blattella asahinai ). [82]

Se ha descubierto la metilación funcional del ADN en las abejas melíferas. [83] [84] Las marcas de metilación del ADN se encuentran principalmente en el cuerpo del gen, y las opiniones actuales sobre la función de la metilación del ADN son la regulación genética a través del empalme alternativo [85].

Los niveles de metilación del ADN en Drosophila melanogaster son casi indetectables. [86] Los métodos sensibles aplicados al ADN de Drosophila sugieren niveles en el rango de 0,1-0,3% de la citosina total. [87] Un estudio de 2014 encontró que el bajo nivel de metilación en moscas de la fruta apareció "en motivos cortos específicos y es independiente de la actividad de DNMT2". [88] Además, los enfoques de espectrometría de masas altamente sensibles, [89] ahora han demostrado la presencia de niveles bajos (0,07%) pero significativos de metilación de adenina durante las primeras etapas de la embriogénesis de Drosophila.

En hongos

Muchos hongos tienen niveles bajos (0,1 a 0,5%) de metilación de citosina, mientras que otros hongos tienen hasta un 5% del genoma metilado. [90] Este valor parece variar tanto entre especies como entre aislados de la misma especie. [91] También hay evidencia de que la metilación del ADN puede estar involucrada en el control específico del estado de la expresión génica en hongos. [ cita requerida ] Sin embargo, en un límite de detección de 250 attomoles mediante espectrometría de masas de ultra alta sensibilidad , la metilación del ADN no se confirmó en especies de levaduras unicelulares como Saccharomyces cerevisiae o Schizosaccharomyces pombe , lo que indica que las levaduras no poseen esta modificación del ADN. [9] : resumen 

Aunque la levadura cervecera ( Saccharomyces ), la levadura de fisión ( Schizosaccharomyces ) y el Aspergillus flavus [92] no tienen metilación de ADN detectable, el hongo filamentoso modelo Neurospora crassa tiene un sistema de metilación bien caracterizado. [93] Varios genes controlan la metilación en Neurospora y la mutación de la metiltransferasa de ADN, dim-2 , elimina toda la metilación de ADN pero no afecta el crecimiento ni la reproducción sexual. Si bien el genoma de Neurospora tiene muy poco ADN repetido, la mitad de la metilación ocurre en el ADN repetido, incluidas las reliquias de transposones y el ADN centromérico. La capacidad de evaluar otros fenómenos importantes en un contexto genético deficiente en metilasa de ADN hace de Neurospora un sistema importante en el que estudiar la metilación de ADN. [ cita requerida ]

En otros eucariotas

La metilación del ADN está prácticamente ausente en Dictyostelium discoidium [94], donde parece ocurrir en aproximadamente el 0,006 % de las citosinas. [6] Por el contrario, la metilación del ADN está ampliamente distribuida en Physarum polycephalum [95] , donde la 5-metilcitosina representa hasta el 8 % de la citosina total [4].

En bacterias

Todas las metilaciones en un procariota . En algunos organismos procariotas, están representados los tres tipos de metilación del ADN previamente conocidos (N4-metilcitosina: m4C, 5-metilcitosina: m5C y N6-metiladenina: m6A). Aquí se muestran seis ejemplos, dos de los cuales pertenecen al dominio Archaea y cuatro de los cuales pertenecen al dominio Bacteria. La información proviene de Blow et al. (2016). [96] En la columna de la izquierda están los nombres de las especies de los organismos, a la derecha hay ejemplos de motivos de ADN metilados. Los nombres completos de las arqueas y cepas bacterianas son según la taxonomía del NCBI: "Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661", "Methanocorpusculum labreanum Z", "Clostridium perfringens ATCC 13127", "Geopsychrobacter electrodiphilus DSM 16401", "Rhodopseudomonas palustris CGA009" y "Salmonella enterica subsp. enterica serovar Paratyphi A str. ATCC 9150".

La metilación de la adenina o la citosina está mediada por sistemas de modificación de restricción de muchas bacterias , en los que secuencias específicas de ADN se metilan periódicamente a lo largo del genoma. [97] Una metilasa es la enzima que reconoce una secuencia específica y metila una de las bases en o cerca de esa secuencia. Los ADN extraños (que no se metilan de esta manera) que se introducen en la célula son degradados por enzimas de restricción específicas de la secuencia y escindidos. El ADN genómico bacteriano no es reconocido por estas enzimas de restricción. La metilación del ADN nativo actúa como una especie de sistema inmunológico primitivo, permitiendo a las bacterias protegerse de la infección por bacteriófagos . [ cita requerida ]

La adenina metiltransferasa de ADN de E. coli (Dam) es una enzima de ~32 kDa que no pertenece a un sistema de restricción/modificación. La secuencia de reconocimiento diana para Dam de E. coli es GATC, ya que la metilación ocurre en la posición N6 de la adenina en esta secuencia (G meATC). Los tres pares de bases que flanquean cada lado de este sitio también influyen en la unión entre el ADN y Dam. Dam desempeña varias funciones clave en los procesos bacterianos, incluida la reparación de errores de apareamiento, el momento de la replicación del ADN y la expresión génica. Como resultado de la replicación del ADN, el estado de los sitios GATC en el genoma de E. coli cambia de completamente metilado a hemimetilado. Esto se debe a que la adenina introducida en la nueva cadena de ADN no está metilada. La remetilación ocurre en un plazo de dos a cuatro segundos, tiempo durante el cual se reparan los errores de replicación en la nueva cadena. La metilación, o su ausencia, es el marcador que permite al aparato de reparación de la célula diferenciar entre la plantilla y las cadenas nacientes. Se ha demostrado que la alteración de la actividad de Dam en las bacterias da como resultado un aumento de la tasa de mutación espontánea. La viabilidad bacteriana se ve comprometida en mutantes de Dam que también carecen de otras enzimas reparadoras del ADN, lo que proporciona más evidencia del papel de Dam en la reparación del ADN.

Una región del ADN que mantiene su estado hemimetilado durante más tiempo es el origen de replicación , que tiene una gran cantidad de sitios GATC. Esto es fundamental para el mecanismo bacteriano de cronometrar la replicación del ADN. SeqA se une al origen de replicación, secuestrándolo y evitando así la metilación. Debido a que los orígenes de replicación hemimetilados son inactivos, este mecanismo limita la replicación del ADN a una vez por ciclo celular.

La expresión de ciertos genes, por ejemplo, los que codifican la expresión de pilus en E. coli , está regulada por la metilación de los sitios GATC en la región promotora del operón del gen. Las condiciones ambientales de las células justo después de la replicación del ADN determinan si se bloquea la metilación de Dam en una región proximal o distal a la región promotora. Una vez que se ha creado el patrón de metilación, la transcripción del gen pilus se bloquea en la posición activada o desactivada hasta que el ADN se vuelve a replicar. En E. coli , estos operones pili tienen papeles importantes en la virulencia en las infecciones del tracto urinario. Se ha propuesto [¿ por quién? ] que los inhibidores de Dam pueden funcionar como antibióticos.

Por otra parte, la metilasa de citosina de ADN se dirige a los sitios CCAGG y CCTGG para metilar la citosina en la posición C5 (C meC(A/T) GG). La otra enzima metilasa, EcoKI, provoca la metilación de adeninas en las secuencias AAC(N 6 )GTGC y GCAC(N 6 )GTT.

En Clostridioides difficile , se ha demostrado que la metilación del ADN en el motivo objetivo CAAAAA afecta la esporulación , un paso clave en la transmisión de la enfermedad, así como la longitud celular, la formación de biopelículas y la colonización del huésped. [98]

Clonación molecular

La mayoría de las cepas utilizadas por los biólogos moleculares son derivadas de E. coli K-12 y poseen tanto Dam como Dcm, pero existen cepas disponibles comercialmente que son dam-/dcm- (falta de actividad de cualquiera de las dos metilasas). De hecho, es posible desmetilar el ADN extraído de cepas dam+/dcm+ transformándolo en cepas dam-/dcm-. Esto ayudaría a digerir secuencias que no están siendo reconocidas por enzimas de restricción sensibles a la metilación. [99] [100]

La enzima de restricción DpnI puede reconocer los sitios 5'-GmeATC-3' y digerir el ADN metilado. Al ser un motivo tan corto, aparece con frecuencia en secuencias por casualidad y, como tal, su uso principal para los investigadores es degradar el ADN molde después de las PCR (los productos de PCR carecen de metilación, ya que no hay metilasas presentes en la reacción). De manera similar, algunas enzimas de restricción disponibles comercialmente son sensibles a la metilación en sus sitios de restricción afines y, como se mencionó anteriormente, deben usarse en el ADN que pasa a través de una cepa dam-/dcm- para permitir el corte. [ cita requerida ]

Detección

La metilación del ADN se puede detectar mediante los siguientes ensayos que se utilizan actualmente en la investigación científica: [101]

Regiones metiladas diferencialmente (DMR)

Las regiones metiladas diferencialmente , que son regiones genómicas con diferentes estados de metilación entre múltiples muestras (tejidos, células, individuos u otros), se consideran posibles regiones funcionales involucradas en la regulación transcripcional de genes. La identificación de DMR entre múltiples tejidos (T-DMR) proporciona un estudio integral de las diferencias epigenéticas entre los tejidos humanos. [113] Por ejemplo, estas regiones metiladas que son exclusivas de un tejido en particular permiten a los individuos diferenciar entre el tipo de tejido, como el semen y el fluido vaginal. La investigación actual realizada por Lee et al., mostró que DACT1 y USP49 identificaron positivamente el semen al examinar las T-DMR. [114] El uso de T-DMR ha demostrado ser útil en la identificación de varios fluidos corporales encontrados en escenas del crimen. Los investigadores en el campo forense actualmente están buscando nuevos T-DMR en genes para usar como marcadores en el análisis de ADN forense. Las DMR entre muestras de cáncer y normales (C-DMR) demuestran la metilación aberrante en los cánceres. [115] Es bien sabido que la metilación del ADN está asociada con la diferenciación y proliferación celular. [116] Se han encontrado muchos DMR en las etapas de desarrollo (D-DMR) [117] y en el progreso reprogramado (R-DMR). [118] Además, existen DMR intraindividuales (Intra-DMR) con cambios longitudinales en la metilación global del ADN junto con el aumento de la edad en un individuo determinado. [119] También existen DMR interindividuales (Inter-DMR) con diferentes patrones de metilación entre múltiples individuos. [120]

La QDMR (Quantitative Differentially Methylated Regions) es un enfoque cuantitativo para cuantificar la diferencia de metilación e identificar DMR a partir de perfiles de metilación de todo el genoma mediante la adaptación de la entropía de Shannon. [121] La naturaleza libre de plataforma y de especie de la QDMR la hace potencialmente aplicable a varios datos de metilación. Este enfoque proporciona una herramienta eficaz para la identificación de alto rendimiento de las regiones funcionales involucradas en la regulación epigenética. La QDMR se puede utilizar como una herramienta eficaz para la cuantificación de la diferencia de metilación y la identificación de DMR en múltiples muestras. [122]

Se ha demostrado que el análisis de conjuntos de genes (también conocido como análisis de vías; herramientas que se utilizan habitualmente como DAVID, GoSeq o GSEA) está gravemente sesgado cuando se aplica a datos de metilación de alto rendimiento (por ejemplo, MeDIP-seq, MeDIP-ChIP, HELP-seq, etc.), y una amplia gama de estudios han informado erróneamente sobre la hipermetilación de genes relacionados con el desarrollo y la diferenciación; se ha sugerido que esto se puede corregir utilizando permutaciones de etiquetas de muestra o utilizando un modelo estadístico para controlar las diferencias en el número de sondas CpG/sitios CpG que se dirigen a cada gen. [123]

Marcas de metilación del ADN

Las marcas de metilación del ADN (regiones genómicas con patrones de metilación específicos en un estado biológico específico, como un tejido, un tipo de célula o un individuo) se consideran posibles regiones funcionales implicadas en la regulación de la transcripción génica. Aunque varios tipos de células humanas pueden tener el mismo genoma, estas células tienen diferentes metilomas. La identificación y caracterización sistemática de las marcas de metilación en los distintos tipos de células es crucial para comprender la compleja red reguladora de la determinación del destino celular. Hongbo Liu et al. propusieron un marco basado en la entropía denominado SMART para integrar los metilomas de secuenciación de bisulfito del genoma completo en 42 tejidos/células humanas e identificaron 757.887 segmentos del genoma. [124] Casi el 75 % de los segmentos mostraron una metilación uniforme en todos los tipos de células. Del 25 % restante de los segmentos, identificaron marcas de hipo/hipermetilación específicas del tipo de célula que estaban específicamente hipo/hipermetiladas en una minoría de tipos de células utilizando un enfoque estadístico y presentaron un atlas de las marcas de metilación humanas. Un análisis posterior reveló que las marcas de hipometilación específicas del tipo celular se enriquecieron a través de H3K27ac y los sitios de unión de factores de transcripción de una manera específica del tipo celular. En particular, observaron que las marcas de hipometilación específicas del tipo celular están asociadas con los superpotenciadores específicos del tipo celular que impulsan la expresión de genes de identidad celular. Este marco proporciona una anotación funcional complementaria del genoma humano y ayuda a dilucidar las características y funciones críticas de la hipometilación específica del tipo celular. [ cita requerida ]

La herramienta de análisis y generación de informes de metilación específica basada en la entropía, denominada "SMART", se centra en la integración de una gran cantidad de metilomas de ADN para la identificación de novo de marcas de metilación específicas del tipo celular. La última versión de SMART se centra en tres funciones principales, que incluyen la identificación de novo de regiones metiladas diferencialmente (DMR) mediante la segmentación del genoma, la identificación de DMR a partir de regiones de interés predefinidas y la identificación de sitios CpG metilados diferencialmente. [125]

En la identificación y detección de fluidos corporales

La metilación del ADN permite analizar varios tejidos en un solo ensayo, así como identificar pequeñas cantidades de fluido corporal con el uso de ADN extraído. Por lo general, los dos enfoques de la metilación del ADN son las enzimas de restricción sensibles a la metilación o el tratamiento con bisulfito de sodio. [126] Las enzimas de restricción sensibles a la metilación funcionan escindiendo CpG específicos, citosina y guanina separados por un solo grupo fosfato, sitios de reconocimiento cuando el CpG está metilado. Por el contrario, las citosinas no metiladas se transforman en uracilo y, en el proceso, las citosinas metiladas permanecen metiladas. En particular, los perfiles de metilación pueden proporcionar información sobre cuándo o cómo se dejaron fluidos corporales en las escenas del crimen, identificar el tipo de fluido corporal y aproximar la edad, el sexo y las características fenotípicas de los perpetradores. [127] Las investigaciones indican varios marcadores que se pueden utilizar para la metilación del ADN. Decidir qué marcador utilizar para un ensayo es uno de los primeros pasos de la identificación de fluidos corporales. En general, los marcadores se seleccionan examinando investigaciones previas realizadas. Los marcadores de identificación que se eligen deben dar un resultado positivo para un tipo de célula. Una porción del cromosoma que es un área de enfoque cuando se lleva a cabo la metilación del ADN son las regiones diferencialmente metiladas específicas del tejido, T-DMR. El grado de metilación de las T-DMR varía según el fluido corporal. [127] Un equipo de investigación desarrolló un sistema de marcadores que es doble. El primer marcador está metilado solo en el fluido objetivo, mientras que el segundo está metilado en el resto de los fluidos. [110] Por ejemplo, si el marcador de sangre venosa A no está metilado y el marcador de sangre venosa B está metilado en un fluido, indica la presencia de solo sangre venosa. Por el contrario, si el marcador de sangre venosa A está metilado y el marcador de sangre venosa B no está metilado en algún fluido, entonces eso indica que la sangre venosa está en una mezcla de fluidos. Algunos ejemplos de marcadores de metilación del ADN son Mens1 (sangre menstrual), Spei1 (saliva) y Sperm2 (líquido seminal).

La metilación del ADN proporciona un método relativamente bueno de sensibilidad para identificar y detectar fluidos corporales. En un estudio, sólo se necesitaron diez nanogramos de una muestra para determinar resultados satisfactorios. [128] La metilación del ADN proporciona un buen discernimiento de muestras mixtas, ya que implica marcadores que dan señales de "activación o desactivación". La metilación del ADN no es inmune a las condiciones externas. Incluso en condiciones degradadas utilizando las técnicas de metilación del ADN, los marcadores son lo suficientemente estables como para que todavía haya diferencias notables entre las muestras degradadas y las muestras de control. Específicamente, en un estudio, se encontró que no hubo cambios notables en los patrones de metilación durante un período extenso de tiempo. [127]

La detección de la metilación del ADN en el ADN libre de células y otros fluidos corporales se ha convertido recientemente en uno de los principales enfoques de la biopsia líquida . [129] En particular, la identificación de patrones específicos de tejido y de enfermedad permite la detección y el seguimiento no invasivos de enfermedades como el cáncer. [130] Si se compara con los enfoques estrictamente genómicos de la biopsia líquida, el perfil de metilación del ADN ofrece un mayor número de sitios CpG metilados diferencialmente y regiones metiladas diferencialmente (DMRS), lo que mejora potencialmente su sensibilidad. Los algoritmos de deconvolución de señales basados ​​en la metilación del ADN se han aplicado con éxito al ADN libre de células y pueden nominar el tejido de origen de los cánceres de origen primario desconocido, el rechazo del aloinjerto y la resistencia a la terapia hormonal. [131]

Predicción computacional

La metilación del ADN también se puede detectar mediante modelos computacionales a través de algoritmos y métodos sofisticados. Los modelos computacionales pueden facilitar el perfil global de la metilación del ADN en los cromosomas y, a menudo, estos modelos son más rápidos y más económicos de realizar que los ensayos biológicos. Estos modelos computacionales actualizados incluyen Bhasin, et al. , [132] Bock, et al ., [133] y Zheng, et al . [134] [135] Junto con el ensayo biológico, estos métodos facilitan enormemente el análisis de la metilación del ADN.

Véase también

Referencias

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Lectura adicional

Enlaces externos

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