Un reloj circadiano , u oscilador circadiano , también conocido como reloj despertador interno , es un oscilador bioquímico que funciona con una fase estable y está sincronizado con el tiempo solar .
El período in vivo de un reloj de este tipo es necesariamente casi exactamente de 24 horas ( el día solar actual de la Tierra ). En la mayoría de los organismos vivos, los relojes circadianos sincronizados internamente permiten al organismo anticipar los cambios ambientales diarios correspondientes al ciclo día-noche y ajustar su biología y comportamiento en consecuencia.
El término circadiano deriva del latín circa (aproximadamente) dies (un día), ya que, cuando se eliminan las señales externas (como la luz ambiental), no funcionan exactamente durante 24 horas. Los relojes de los humanos en un laboratorio con poca luz constante, por ejemplo, tendrán un promedio de aproximadamente 24,2 horas por día, en lugar de 24 horas exactas. [1]
El reloj biológico normal oscila con un período endógeno de exactamente 24 horas, se sincroniza cuando recibe suficientes señales correctivas diarias del entorno, principalmente la luz del día y la oscuridad. Los relojes circadianos son los mecanismos centrales que impulsan los ritmos circadianos . Constan de tres componentes principales:
El reloj se reinicia cuando un organismo detecta señales ambientales de tiempo, de las cuales la principal es la luz. Los osciladores circadianos son omnipresentes en los tejidos del cuerpo, donde se sincronizan mediante señales endógenas y externas para regular la actividad transcripcional a lo largo del día de una manera específica para cada tejido. [2] El reloj circadiano está entrelazado con la mayoría de los procesos metabólicos celulares y se ve afectado por el envejecimiento del organismo. [3] Los mecanismos moleculares básicos del reloj biológico se han definido en especies de vertebrados , Drosophila melanogaster , plantas , hongos , bacterias , [4] [5] y presumiblemente también en Archaea . [6] [7] [8]
En 2017, el Premio Nobel de Fisiología o Medicina fue otorgado a Jeffrey C. Hall , Michael Rosbash y Michael W. Young "por sus descubrimientos de los mecanismos moleculares que controlan el ritmo circadiano" en las moscas de la fruta. [9]
En los vertebrados, el reloj circadiano maestro está contenido dentro del núcleo supraquiasmático (NSQ), un grupo de nervios bilaterales de aproximadamente 20.000 neuronas. [10] [11] El NSQ está ubicado en el hipotálamo , una pequeña región del cerebro situada directamente sobre el quiasma óptico , donde recibe información de células ganglionares fotosensibles especializadas en la retina a través del tracto retinohipotalámico .
El SCN mantiene el control en todo el cuerpo sincronizando "osciladores esclavos", que exhiben sus propios ritmos de casi 24 horas y controlan los fenómenos circadianos en el tejido local. [12] A través de mecanismos de señalización intercelular como el péptido intestinal vasoactivo , el SCN envía señales a otros núcleos hipotalámicos y a la glándula pineal para modular la temperatura corporal y la producción de hormonas como el cortisol y la melatonina ; estas hormonas ingresan al sistema circulatorio e inducen efectos impulsados por el reloj en todo el organismo.
Sin embargo, no está claro exactamente qué señal (o señales) activan el principal mecanismo de sincronización de los numerosos relojes bioquímicos presentes en los tejidos de todo el cuerpo. Para más detalles, véase la sección "Regulación de los osciladores circadianos" más adelante.
La evidencia de una base genética de los ritmos circadianos en eucariotas superiores comenzó con el descubrimiento del locus del período ( per ) en Drosophila melanogaster a partir de exámenes genéticos avanzados completados por Ron Konopka y Seymour Benzer en 1971. [13] A través del análisis de mutantes per circadianos y mutaciones adicionales en los genes del reloj de Drosophila , se ha propuesto un modelo que abarca bucles de retroalimentación autorreguladores positivos y negativos de transcripción y traducción . Los genes centrales del "reloj" circadiano se definen como genes cuyos productos proteicos son componentes necesarios para la generación y regulación de los ritmos circadianos. Se han sugerido modelos similares en mamíferos y otros organismos. [14] [15]
Sin embargo, los estudios en cianobacterias cambiaron nuestra visión del mecanismo del reloj, ya que Kondo y sus colegas descubrieron que estos organismos unicelulares podían mantener un tiempo preciso de 24 horas en ausencia de transcripción, es decir, no había necesidad de un circuito de retroalimentación autorregulador de transcripción-traducción para los ritmos. [16] Además, este reloj se reconstruyó en un tubo de ensayo (es decir, en ausencia de cualquier componente celular), lo que demuestra que se pueden formar relojes precisos de 24 horas sin la necesidad de circuitos de retroalimentación genética. [17] Sin embargo, este mecanismo solo era aplicable a las cianobacterias y no genérico.
En 2011, un gran avance en la comprensión provino del laboratorio Reddy de la Universidad de Cambridge . Este grupo descubrió ritmos circadianos en proteínas redox ( peroxirredoxinas ) en células que carecían de núcleo: glóbulos rojos humanos. [18] En estas células, no había transcripción ni circuitos genéticos y, por lo tanto, no había bucle de retroalimentación. Se hicieron observaciones similares en un alga marina [19] y posteriormente en glóbulos rojos de ratón. [20] Más importante aún, las oscilaciones redox demostradas por los ritmos de peroxirredoxina ahora se han visto en múltiples reinos distantes de la vida (eucariotas, bacterias y arqueas), que cubren el árbol evolutivo. [6] [21] Por lo tanto, los relojes redox parecen ser el reloj del abuelo , y los circuitos de retroalimentación genética los principales mecanismos de salida para controlar la fisiología y el comportamiento de las células y los tejidos. [22] [23]
Por lo tanto, el modelo del reloj debe considerarse como un producto de una interacción entre circuitos transcripcionales y elementos no transcripcionales como las oscilaciones redox y los ciclos de fosforilación de proteínas. [24] [25]
La eliminación selectiva de genes de componentes conocidos del reloj circadiano humano demuestra que se utilizan tanto mecanismos compensatorios activos como redundancia para mantener la función del reloj. [26] [27] [28] [29] Se han identificado y caracterizado varios genes del reloj de mamíferos a través de experimentos en animales que albergan mutaciones de eliminación natural, inducida químicamente y dirigida, y varios enfoques genómicos comparativos. [26]
La mayoría de los componentes del reloj identificados son activadores o represores transcripcionales que modulan la estabilidad de las proteínas y la translocación nuclear y crean dos bucles de retroalimentación entrelazados . [30] En el bucle de retroalimentación primario, los miembros de la familia de factores de transcripción hélice-bucle-hélice básica (bHLH)-PAS (Period-Arnt-Single-minded), CLOCK y BMAL1 , se heterodimerizan en el citoplasma para formar un complejo que, después de la translocación al núcleo , inicia la transcripción de genes diana como los genes del reloj central "genes del período" ( PER1 , PER2 y PER3 ) y dos genes criptocromo ( CRY1 y CRY2 ). La retroalimentación negativa se logra mediante heterodímeros PER:CRY que se translocan de nuevo al núcleo para reprimir su propia transcripción inhibiendo la actividad de los complejos CLOCK:BMAL1. [5] Otro bucle regulador se induce cuando los heterodímeros CLOCK:BMAL1 activan la transcripción de Rev-ErbA y Rora, dos receptores nucleares huérfanos relacionados con el ácido retinoico. REV-ERBa y RORa compiten posteriormente para unirse al elemento de respuesta al receptor huérfano relacionado con el ácido retinoico (RORE) presente en el promotor Bmal1. A través de la unión posterior de los RORE, los miembros de ROR y REV-ERB pueden regular Bmal1 . Mientras que los ROR activan la transcripción de Bmal1 , los REV-ERB reprimen el mismo proceso de transcripción. Por lo tanto, la oscilación circadiana de Bmal1 está regulada tanto positiva como negativamente por los ROR y los REV-ERB. [30]
En D. melanogaster , el gen CLOCK-CYC es el ortólogo de BMAL1 en mamíferos. Por lo tanto, los dímeros CLOCK-CYC activan la transcripción de genes circadianos. El gen timeless (TIM) es el ortólogo de los CRY de mamíferos como inhibidor; en cambio, el CRY de D. melanogaster funciona como un fotorreceptor. En las moscas, CLK-CYC se une a los promotores de genes regulados circadianos solo en el momento de la transcripción. También existe un bucle estabilizador donde el gen vrille (VRI) inhibe mientras que la proteína PAR-dominio 1 (PDP1) activa la transcripción Clock. [31]
En el hongo filamentoso N. crassa , el mecanismo del reloj es análogo, pero no ortólogo, al de los mamíferos y las moscas. [32]
El reloj circadiano de las plantas tiene componentes completamente diferentes a los de los relojes de los animales, los hongos o las bacterias. El reloj de las plantas tiene una similitud conceptual con el reloj animal en el sentido de que consta de una serie de bucles de retroalimentación transcripcional entrelazados . Los genes implicados en el reloj muestran su expresión máxima en un momento fijo del día. Los primeros genes identificados en el reloj de las plantas fueron TOC1 , CCA1 y LHY . La expresión máxima de los genes CCA1 y LHY se produce al amanecer, y la expresión máxima del gen TOC1 se produce aproximadamente al anochecer. Las proteínas CCA1/LHY y TOC1 reprimen la expresión de los genes de cada una. El resultado es que, a medida que los niveles de proteína CCA1/LHY comienzan a reducirse después del amanecer, se libera la represión del gen TOC1, lo que permite que la expresión de TOC1 y los niveles de proteína TOC1 aumenten. A medida que aumentan los niveles de proteína TOC1, suprime aún más la expresión de los genes CCA1 y LHY. Lo opuesto de esta secuencia ocurre durante la noche para restablecer la expresión máxima de los genes CCA1 y LHY al amanecer. El reloj tiene una complejidad mucho mayor, con múltiples bucles que involucran los genes PRR, el complejo vespertino y las proteínas GIGANTIA y ZEITLUPE sensibles a la luz.
En los ritmos circadianos bacterianos , las oscilaciones de la fosforilación de la proteína Kai C de las cianobacterias se reconstituyeron en un sistema libre de células (un reloj in vitro ) incubando KaiC con KaiA , KaiB y ATP . [17]
Durante mucho tiempo se creyó que los ciclos de activación/represión transcripcional impulsados por los reguladores transcripcionales que constituyen el reloj circadiano eran la principal fuerza impulsora de la expresión génica circadiana en mamíferos. Sin embargo, más recientemente se informó que solo el 22% de los genes que ciclan el ARN mensajero son impulsados por la transcripción de novo. [33] Más tarde se informaron mecanismos postranscripcionales a nivel de ARN que impulsan la expresión rítmica de proteínas, como la dinámica de poliadenilación del ARNm. [34]
Fustin [ ¿quién? ] y sus colaboradores identificaron la metilación de las adenosinas internas (m 6 A) dentro del ARNm (en particular, de las propias transcripciones del reloj) como un regulador clave del período circadiano. La inhibición de la metilación de m 6 A a través de la inhibición farmacológica de las metilaciones celulares o, más específicamente, mediante el silenciamiento mediado por ARNi de la metilasa m 6 A Mettl3 condujo a la elongación dramática del período circadiano. En contraste, la sobreexpresión de Mettl3 in vitro condujo a un período más corto. Estas observaciones demostraron claramente la importancia de la regulación postranscripcional a nivel de ARN del reloj circadiano y, al mismo tiempo, establecieron el papel fisiológico de la metilación del ARN (m 6 A). [35]
Los bucles de retroalimentación autorregulatoria en los relojes tardan aproximadamente 24 horas en completar un ciclo y constituyen un reloj molecular circadiano. Esta generación del reloj molecular de ~24 horas está gobernada por modificaciones postraduccionales como la fosforilación , sumoilación , acetilación y metilación de histonas y ubiquitinación . [31] La fosforilación reversible regula procesos importantes como la entrada nuclear, la formación de complejos proteicos y la degradación de proteínas . Cada uno de estos procesos contribuye significativamente a mantener el período en ~24 horas y brinda la precisión de un reloj circadiano al afectar la estabilidad de las proteínas del reloj central mencionadas anteriormente. Por lo tanto, mientras que la regulación transcripcional genera niveles rítmicos de ARN, las modificaciones postraduccionales reguladas controlan la abundancia de proteínas, la localización subcelular y la actividad represora de PER y CRY. [30]
Las proteínas responsables de la modificación postraduccional de los genes del reloj incluyen miembros de la familia de las caseínas quinasas ( caseína quinasa 1 delta (CSNK1D) y caseína quinasa 1 épsilon (CSNK1E) y la proteína de repetición rica en leucina F-box 3 (FBXL3). [31] En los mamíferos, CSNK1E y CSNK1D son factores críticos que regulan el recambio proteico circadiano central. [30] La manipulación experimental de cualquiera de estas proteínas produce efectos dramáticos en los periodos circadianos, como actividades alteradas de las quinasas y causa periodos circadianos más cortos, y demuestra además la importancia de la regulación postraduccional dentro del mecanismo central del reloj circadiano. [30] Estas mutaciones se han vuelto de particular interés en los humanos, ya que están implicadas en el trastorno avanzado de la fase del sueño . [31] También se ha propuesto una pequeña modificación de la proteína modificadora relacionada con la ubiquitina de BMAL1 como otro nivel de regulación postraduccional. [30]
Los osciladores circadianos son simplemente osciladores con un período de aproximadamente 24 horas. En respuesta al estímulo de la luz, el cuerpo se corresponde con un sistema y una red de vías que trabajan juntas para determinar el día y la noche biológicos. Las redes reguladoras involucradas en mantener el reloj preciso abarcan una gama de mecanismos de regulación postraduccional. Los osciladores circadianos pueden ser regulados por fosforilación , sumoilación, ubiquitinación y acetilación y desacetilación de histonas , la modificación covalente de la cola de la histona que controla el nivel de estructuras de la cromatina haciendo que el gen se exprese más fácilmente. La metilación de una estructura de proteína agrega un grupo metilo y regula la función de la proteína o la expresión génica y en la metilación de histonas la expresión génica se suprime o se activa cambiando la secuencia de ADN. Las histonas pasan por un proceso de acetilación, metilación y fosforilación, pero los principales cambios estructurales y químicos ocurren cuando las enzimas histona acetiltransferasas (HAT) e histona desacetilasas (HDAC) añaden o eliminan grupos acetilo de la histona, lo que provoca un cambio importante en la expresión del ADN. Al cambiar la expresión del ADN, la acetilación y la metilación de las histonas regulan el funcionamiento del oscilador circadiano. Fustin y sus colaboradores aportaron una nueva capa de complejidad a la regulación del oscilador circadiano en los mamíferos al demostrar que la metilación del ARN era necesaria para la exportación eficiente del ARNm maduro fuera del núcleo: la inhibición de la metilación del ARN provocó la retención nuclear de las transcripciones de los genes del reloj, lo que dio lugar a un período circadiano más largo. [35]
Una característica clave de los relojes es su capacidad de sincronizarse con estímulos externos. La presencia de osciladores autónomos en casi todas las células del cuerpo plantea la cuestión de cómo se coordinan temporalmente estos osciladores. La búsqueda de señales de sincronización universales para los relojes periféricos en los mamíferos ha producido señales de sincronización principales como la alimentación, la temperatura y el oxígeno. Se ha demostrado que tanto los ritmos de alimentación como los ciclos de temperatura sincronizan los relojes periféricos e incluso los desacoplan del reloj maestro en el cerebro (por ejemplo, la alimentación restringida durante el día). También se ha descubierto que los ritmos de oxígeno sincronizan los relojes en células cultivadas. [36]
Los enfoques experimentales modernos que utilizan la biología de sistemas han identificado muchos componentes nuevos en los relojes biológicos que sugieren una visión integradora sobre cómo los organismos mantienen la oscilación circadiana. [27] [28]
Recientemente, Baggs et al. desarrollaron una nueva estrategia denominada "Análisis de red de dosis génica" (GDNA, por sus siglas en inglés) para describir las características de la red en el reloj circadiano humano que contribuyen a la robustez de un organismo frente a perturbaciones genéticas. [28] En su estudio, los autores utilizaron ARN interferente pequeño (siRNA, por sus siglas en inglés) para inducir cambios dependientes de la dosis en la expresión génica de los componentes del reloj dentro de células U2OS de osteosarcoma humano inmortalizadas con el fin de construir redes de asociación génica consistentes con las limitaciones bioquímicas conocidas en el reloj circadiano de los mamíferos. El empleo de múltiples dosis de siRNA impulsó su PCR cuantitativa para descubrir varias características de la red del reloj circadiano, incluidas las respuestas proporcionales de la expresión génica, la propagación de señales a través de módulos interactuantes y la compensación a través de cambios en la expresión génica.
Las respuestas proporcionales en la expresión génica posterior a la perturbación inducida por ARNi revelaron niveles de expresión que se alteraron activamente con respecto al gen que se estaba eliminando. Por ejemplo, cuando se eliminó Bmal1 de manera dependiente de la dosis, se demostró que los niveles de ARNm de Rev-ErbA alfa y Rev-ErbA beta disminuyeron de manera lineal y proporcional. Esto respaldó los hallazgos previos de que Bmal1 activa directamente los genes Rev-erb y sugiere además que Bmal1 contribuye en gran medida a la expresión de Rev-erb.
Además, el método GDNA proporcionó un marco para estudiar los mecanismos de retransmisión biológica en redes circadianas a través de los cuales los módulos comunican cambios en la expresión genética. [28] Los autores observaron la propagación de señales a través de interacciones entre activadores y represores, y descubrieron una compensación paralógica unidireccional entre varios represores de genes del reloj; por ejemplo, cuando se agota PER1 , hay un aumento en Rev-erbs, que a su vez propaga una señal para disminuir la expresión en BMAL1 , el objetivo de los represores Rev-erb.
Al examinar la eliminación de varios represores transcripcionales, el GDNA también reveló una compensación de parálogos, en la que los parálogos de genes se regulaban positivamente a través de un mecanismo activo por el cual la función del gen se reemplaza después de la eliminación de una manera no redundante, es decir, un componente es suficiente para mantener la función. Estos resultados sugirieron además que una red de reloj utiliza mecanismos compensatorios activos en lugar de una simple redundancia para conferir robustez y mantener la función. En esencia, los autores propusieron que las características de red observadas actúan en conjunto como un sistema de amortiguación genética para mantener la función del reloj frente a la perturbación genética y ambiental. [28] Siguiendo esta lógica, podemos utilizar la genómica para explorar las características de red en el oscilador circadiano.
Otro estudio realizado por Zhang et al. también empleó una pantalla de ARN interferente pequeño de todo el genoma en la línea celular U2OS para identificar genes de reloj adicionales y modificadores utilizando la expresión del gen reportero de luciferasa. [27] La eliminación de casi 1000 genes redujo la amplitud del ritmo. Los autores encontraron y confirmaron cientos de efectos potentes en la duración del período o el aumento de la amplitud en pantallas secundarias. La caracterización de un subconjunto de estos genes demostró un efecto dependiente de la dosis en la función del oscilador . El análisis de la red de interacción de proteínas mostró que docenas de productos genéticos estaban asociados directa o indirectamente con componentes conocidos del reloj. El análisis de la vía reveló que estos genes están sobrerrepresentados para los componentes de la vía de señalización de la insulina y hedgehog , el ciclo celular y el metabolismo del folato. Junto con los datos que demuestran que muchas de estas vías están reguladas por el reloj, Zhang et al. postularon que el reloj está interconectado con muchos aspectos de la función celular.
Un enfoque de biología de sistemas puede relacionar los ritmos circadianos con fenómenos celulares que originalmente no se consideraban reguladores de la oscilación circadiana. Por ejemplo, en un taller de 2014 [37] en el NHLBI se evaluaron los hallazgos genómicos circadianos más recientes y se analizó la interfaz entre el reloj biológico y muchos procesos celulares diferentes.
Aunque muchos organismos tienen un reloj circadiano preciso de 24 horas, no es universal. Los organismos que viven en el alto Ártico o en la alta Antártida no experimentan el tiempo solar en todas las estaciones, aunque se cree que la mayoría mantiene un ritmo circadiano cercano a las 24 horas, como los osos durante el letargo. [38] Gran parte de la biomasa de la Tierra reside en la biosfera oscura y, aunque estos organismos pueden exhibir una fisiología rítmica, es poco probable que para ellos el ritmo dominante sea circadiano. [39] Para los organismos migratorios de este a oeste, y especialmente aquellos organismos que circunnavegan el globo, la fase absoluta de 24 horas puede desviarse a lo largo de meses, estaciones o años.
Algunas arañas presentan relojes circadianos inusualmente largos o cortos. Algunas arañas tejedoras de orbes , por ejemplo, tienen relojes circadianos de 18,5 horas, pero aún pueden sincronizarse con un ciclo de 24 horas. Esta adaptación puede ayudar a las arañas a evitar a los depredadores al permitirles estar más activas antes del amanecer. [40] Los relojes de las viudas negras son arrítmicos, tal vez debido a su preferencia por los ambientes oscuros. [41]