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Microscopía

Imagen de polen (colores falsos) mediante microscopio electrónico de barrido
Examen microscópico en un laboratorio bioquímico.

La microscopía es el campo técnico que utiliza microscopios para observar objetos y áreas de objetos que no se pueden ver a simple vista (objetos que no están dentro del rango de resolución del ojo normal). [1] Hay tres ramas bien conocidas de la microscopía: la microscopía óptica , la electrónica y la microscopía de sonda de barrido , junto con el campo emergente de la microscopía de rayos X. [ cita necesaria ]

La microscopía óptica y la microscopía electrónica implican la difracción , reflexión o refracción de radiación electromagnética /haces de electrones que interactúan con la muestra y la recolección de la radiación dispersa u otra señal para crear una imagen. Este proceso se puede llevar a cabo mediante irradiación de campo amplio de la muestra (por ejemplo, microscopía óptica estándar y microscopía electrónica de transmisión ) o mediante barrido con un haz fino sobre la muestra (por ejemplo, microscopía de barrido láser confocal y microscopía electrónica de barrido ). La microscopía de sonda de barrido implica la interacción de una sonda de barrido con la superficie del objeto de interés. El desarrollo de la microscopía revolucionó la biología , dio origen al campo de la histología y sigue siendo una técnica esencial en las ciencias biológicas y físicas . La microscopía de rayos X es tridimensional y no destructiva, lo que permite obtener imágenes repetidas de la misma muestra para estudios in situ o 4D, y brinda la capacidad de "ver el interior" de la muestra que se está estudiando antes de sacrificarla por técnicas de mayor resolución. Un microscopio de rayos X 3D utiliza la técnica de la tomografía computarizada ( microCT ), rotando la muestra 360 grados y reconstruyendo las imágenes. La TC normalmente se realiza con una pantalla plana. Un microscopio de rayos X 3D emplea una variedad de objetivos, por ejemplo, de 4X a 40X, y también puede incluir un panel plano.

Historia

Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723)

El campo de la microscopía ( microscopía óptica ) se remonta al menos al siglo XVII. Los primeros microscopios, lupas de lente única con aumento limitado, se remontan al menos al uso generalizado de lentes en anteojos en el siglo XIII [2] , pero los microscopios compuestos más avanzados aparecieron por primera vez en Europa alrededor de 1620 [3] [4] Los primeros practicantes de la microscopía incluyen a Galileo Galilei , quien descubrió en 1610 que podía enfocar de cerca su telescopio para ver objetos pequeños de cerca [5] [6] y Cornelis Drebbel , quien pudo haber inventado el microscopio compuesto alrededor de 1620 [7] [8 ] Antonie van Leeuwenhoek desarrolló un microscopio simple de muy alto aumento en la década de 1670 y a menudo se le considera el primer microscopista y microbiólogo reconocido . [9] [10]

Microscopia óptica

microscopio estereoscópico

La microscopía óptica o de luz implica pasar la luz visible transmitida o reflejada por la muestra a través de una sola lente o varias lentes para permitir una vista ampliada de la muestra. [11] La imagen resultante puede ser detectada directamente por el ojo, plasmada en una placa fotográfica o capturada digitalmente . La lente única con sus accesorios, o el sistema de lentes y equipo de imágenes, junto con el equipo de iluminación, la platina de muestra y el soporte adecuados, conforma el microscopio óptico básico. El desarrollo más reciente es el microscopio digital , que utiliza una cámara CCD para enfocar la exposición de interés. La imagen se muestra en la pantalla de una computadora, por lo que no son necesarios los oculares. [12]

Limitaciones

Las limitaciones de la microscopía óptica estándar ( microscopía de campo brillante ) se encuentran en tres áreas;

En particular, las células vivas generalmente carecen de suficiente contraste para poder estudiarse con éxito, ya que las estructuras internas de la célula son incoloras y transparentes. La forma más común de aumentar el contraste es teñir las estructuras con tintes selectivos, pero esto a menudo implica matar y fijar la muestra. [15] La tinción también puede introducir artefactos , que son detalles estructurales aparentes causados ​​por el procesamiento de la muestra y, por lo tanto, no son características de la muestra. En general, estas técnicas utilizan diferencias en el índice de refracción de las estructuras celulares. La microscopía de campo claro es comparable a mirar a través de una ventana de cristal: no se ve el cristal sino simplemente la suciedad del cristal. Hay una diferencia, ya que el vidrio es un material más denso y esto crea una diferencia en la fase de la luz que lo atraviesa. El ojo humano no es sensible a esta diferencia de fase, pero se han ideado soluciones ópticas inteligentes para convertir esta diferencia de fase en una diferencia de amplitud (intensidad de la luz). [ cita necesaria ]

Técnicas

Para mejorar el contraste de la muestra o resaltar estructuras en una muestra, se deben utilizar técnicas especiales. Se encuentra disponible una gran selección de técnicas de microscopía para aumentar el contraste o etiquetar una muestra.

Campo Claro

La microscopía de campo brillante es la más sencilla de todas las técnicas de microscopía óptica. La iluminación de la muestra se realiza mediante luz blanca transmitida, es decir, se ilumina desde abajo y se observa desde arriba. Las limitaciones incluyen el bajo contraste de la mayoría de las muestras biológicas y la baja resolución aparente debido al desenfoque del material desenfocado. La simplicidad de la técnica y la mínima preparación de la muestra requerida son ventajas significativas. [ cita necesaria ]

Iluminación oblicua

El uso de iluminación oblicua (lateral) le da a la imagen una apariencia tridimensional y puede resaltar características que de otro modo serían invisibles. Una técnica más reciente basada en este método es el contraste de modulación de Hoffmann , un sistema que se encuentra en microscopios invertidos para su uso en cultivos celulares. La iluminación oblicua mejora el contraste incluso en muestras claras; sin embargo, debido a que la luz entra fuera del eje, la posición de un objeto parecerá cambiar a medida que se cambia el enfoque. Esta limitación hace imposibles técnicas como el corte óptico o la medición precisa en el eje z.

Campo oscuro

La microscopía de campo oscuro es una técnica para mejorar el contraste de muestras transparentes sin teñir. [16] La iluminación de campo oscuro utiliza una fuente de luz cuidadosamente alineada para minimizar la cantidad de luz transmitida directamente (no dispersada) que ingresa al plano de la imagen, recogiendo solo la luz dispersada por la muestra. El campo oscuro puede mejorar drásticamente el contraste de la imagen, especialmente de objetos transparentes, y requiere poca configuración del equipo o preparación de muestras. Sin embargo, la técnica adolece de una baja intensidad de luz en la imagen final de muchas muestras biológicas y sigue viéndose afectada por una baja resolución aparente.

Una diatomea bajo la iluminación de Rheinberg

La iluminación de Rheinberg es una variante de la iluminación de campo oscuro en la que se insertan filtros de colores transparentes justo antes del condensador para que los rayos de luz con una apertura alta tengan un color diferente que los de una apertura baja (es decir, el fondo de la muestra puede ser azul mientras que el objeto aparece en rojo autoluminoso). Son posibles otras combinaciones de colores, pero su eficacia es bastante variable. [17]

Tinción de dispersión

La tinción por dispersión es una técnica óptica que da como resultado una imagen coloreada de un objeto incoloro. Esta es una técnica de tinción óptica y no requiere tintes ni tintes para producir un efecto de color. Hay cinco configuraciones de microscopio diferentes que se utilizan en la técnica más amplia de tinción por dispersión. Incluyen tinción de línea de Becke de campo claro, oblicua, de campo oscuro, de contraste de fase y de dispersión objetiva.

Contraste de fase

Micrografía de luz de contraste de fase de cartílago hialino no descalcificado que muestra condrocitos y orgánulos , lagunas y matriz extracelular
En microscopía electrónica : imágenes de contraste de fases.

Técnicas más sofisticadas mostrarán diferencias proporcionales en la densidad óptica. El contraste de fases es una técnica ampliamente utilizada que muestra diferencias en el índice de refracción como diferencia de contraste. Fue desarrollado por el físico holandés Frits Zernike en la década de 1930 (por lo que recibió el Premio Nobel en 1953). El núcleo de una célula, por ejemplo, se verá oscuro contra el citoplasma circundante. El contraste es excelente; sin embargo, no debe usarse con objetos gruesos. Con frecuencia se forma un halo incluso alrededor de objetos pequeños, lo que oscurece los detalles. El sistema consta de un anillo circular en el condensador, que produce un cono de luz. Este cono está superpuesto a un anillo de tamaño similar dentro del objetivo de fase. Cada objetivo tiene un anillo de diferente tamaño, por lo que para cada objetivo se debe elegir otra configuración del condensador. El anillo del objetivo tiene propiedades ópticas especiales: primero reduce la intensidad de la luz directa, pero lo más importante es que crea una diferencia de fase artificial de aproximadamente un cuarto de longitud de onda. A medida que las propiedades físicas de esta luz directa cambian, se produce interferencia con la luz difractada, lo que da como resultado la imagen de contraste de fases. Una desventaja de la microscopía de contraste de fases es la formación de halos (anillo de luz halo).

Contraste de interferencia diferencial

Superior y mucho más caro es el uso del contraste de interferencia . Las diferencias en la densidad óptica se mostrarán como diferencias en el relieve. Según Georges Nomarski , un núcleo dentro de una célula en realidad aparecerá como un glóbulo en el sistema de contraste de interferencia diferencial más utilizado . Sin embargo, hay que tener en cuenta que se trata de un efecto óptico y que el relieve no se parece necesariamente a la forma real. El contraste es muy bueno y la apertura del condensador se puede utilizar completamente abierta, reduciendo así la profundidad de campo y maximizando la resolución.

El sistema consta de un prisma especial ( prisma de Nomarski , prisma de Wollaston ) en el condensador que divide la luz en un haz ordinario y otro extraordinario. La diferencia espacial entre los dos haces es mínima (inferior a la resolución máxima del objetivo). Después de atravesar la muestra, los haces se reúnen mediante un prisma similar en el objetivo.

En una muestra homogénea, no hay diferencia entre los dos haces y no se genera contraste. Sin embargo, cerca de un límite refractivo (por ejemplo, un núcleo dentro del citoplasma), la diferencia entre el haz ordinario y el extraordinario generará un relieve en la imagen. El contraste de interferencia diferencial requiere una fuente de luz polarizada para funcionar; Se deben instalar dos filtros polarizadores en el camino de la luz, uno debajo del condensador (el polarizador) y el otro encima del objetivo (el analizador).

Nota: En los casos en los que el diseño óptico de un microscopio produce una separación lateral apreciable de los dos haces, tenemos el caso de la microscopía de interferencia clásica , que no produce imágenes en relieve, pero que, sin embargo, puede utilizarse para la determinación cuantitativa de espesores de masa. de objetos microscópicos.

Reflexión de interferencia

Una técnica adicional que utiliza interferencia es la microscopía de reflexión de interferencia (también conocida como contraste de interferencia reflejada o RIC). Se basa en la adhesión celular al portaobjetos para producir una señal de interferencia. Si no hay ninguna celda adherida al vidrio, no habrá interferencias.

La microscopía de reflexión de interferencia se puede obtener utilizando los mismos elementos utilizados por DIC, pero sin los prismas. Además, la luz que se detecta se refleja y no se transmite como ocurre cuando se emplea DIC.

Fluorescencia

Las imágenes también pueden contener artefactos . Esta es una micrografía de fluorescencia de escaneo láser confocal de la antera del berro (parte del estambre ). La imagen muestra, entre otras cosas, una bonita estructura roja en forma de collar que fluye justo debajo de la antera. Sin embargo, un estambre de berro intacto no tiene tal collar, esto es un artefacto de fijación: el estambre se ha cortado debajo del marco de la imagen y la epidermis (capa superior de células) del tallo del estambre se ha desprendido, formando una estructura no característica. . Foto: Heiti Paves de la Universidad Tecnológica de Tallin .

Cuando ciertos compuestos se iluminan con luz de alta energía, emiten luz de menor frecuencia. Este efecto se conoce como fluorescencia . A menudo, las muestras muestran su imagen de autofluorescencia característica , basada en su composición química.

Este método es de vital importancia en las ciencias biológicas modernas, ya que puede ser extremadamente sensible y permitir la detección de moléculas individuales. Se pueden utilizar muchos tintes fluorescentes para teñir estructuras o compuestos químicos. Un método potente es la combinación de anticuerpos acoplados a un fluoróforo como en la inmunotinción . Ejemplos de fluoróforos comúnmente utilizados son la fluoresceína o la rodamina .

Los anticuerpos se pueden fabricar a medida para un compuesto químico. Por ejemplo, una estrategia que se utiliza frecuentemente es la producción artificial de proteínas, basadas en el código genético (ADN). Estas proteínas luego pueden usarse para inmunizar conejos, formando anticuerpos que se unen a la proteína. Luego, los anticuerpos se acoplan químicamente a un fluoróforo y se utilizan para rastrear las proteínas en las células en estudio.

Proteínas fluorescentes altamente eficientes como la proteína fluorescente verde (GFP) se han desarrollado utilizando la técnica de biología molecular de fusión genética , un proceso que vincula la expresión del compuesto fluorescente con la de la proteína diana. Esta proteína fluorescente combinada es, en general, no tóxica para el organismo y rara vez interfiere con la función de la proteína en estudio. Las células u organismos genéticamente modificados expresan directamente las proteínas marcadas con fluorescencia, lo que permite el estudio de la función de la proteína original in vivo .

El crecimiento de cristales de proteínas da como resultado cristales de proteínas y de sal. Ambos son incoloros y microscópicos. La recuperación de los cristales de proteínas requiere imágenes que se pueden realizar mediante la fluorescencia intrínseca de la proteína o mediante microscopía de transmisión. Ambos métodos requieren un microscopio ultravioleta ya que la proteína absorbe luz a 280 nm. La proteína también fluorescerá a aproximadamente 353 nm cuando se excita con luz de 280 nm. [18]

Dado que la emisión de fluorescencia difiere en longitud de onda (color) de la luz de excitación, una imagen fluorescente ideal muestra sólo la estructura de interés que fue marcada con el tinte fluorescente. Esta alta especificidad condujo al uso generalizado de la microscopía óptica de fluorescencia en la investigación biomédica. Se pueden utilizar diferentes tintes fluorescentes para teñir diferentes estructuras biológicas, que luego pueden detectarse simultáneamente, sin dejar de ser específicas debido al color individual del tinte.

Para impedir que la luz de excitación llegue al observador o al detector, se necesitan juegos de filtros de alta calidad. Por lo general, constan de un filtro de excitación que selecciona el rango de longitudes de onda de excitación , un espejo dicroico y un filtro de emisión que bloquea la luz de excitación. La mayoría de los microscopios de fluorescencia funcionan en el modo Epi-iluminación (iluminación y detección desde un lado de la muestra) para disminuir aún más la cantidad de luz de excitación que ingresa al detector.

Ver también: microscopio de fluorescencia de reflexión interna total Neurociencia

confocal

La microscopía de barrido láser confocal utiliza un rayo láser enfocado (por ejemplo, 488 nm) que se explora a través de la muestra para excitar la fluorescencia punto por punto. La luz emitida se dirige a través de un orificio para evitar que la luz desenfocada llegue al detector, normalmente un tubo fotomultiplicador . La imagen se construye en una computadora, trazando las intensidades de fluorescencia medidas según la posición del láser de excitación. En comparación con la iluminación completa de la muestra, la microscopía confocal proporciona una resolución lateral ligeramente mayor y mejora significativamente el seccionamiento óptico (resolución axial). Por lo tanto, la microscopía confocal se utiliza habitualmente cuando la estructura 3D es importante.

Una subclase de microscopios confocales son los microscopios de disco giratorio que pueden escanear múltiples puntos simultáneamente en la muestra. Un disco correspondiente con orificios rechaza la luz desenfocada. El detector de luz en un microscopio de disco giratorio es una cámara digital, generalmente EM-CCD o sCMOS .

Microscopía de dos fotones

Un microscopio de dos fotones también es un microscopio de barrido láser, pero en lugar de luz láser ultravioleta, azul o verde, se utiliza un láser infrarrojo pulsado para la excitación. Sólo en el diminuto foco del láser la intensidad es lo suficientemente alta como para generar fluorescencia mediante la excitación de dos fotones , lo que significa que no se genera fluorescencia desenfocada y no es necesario ningún orificio para limpiar la imagen. [19] Esto permite obtener imágenes profundas en el tejido disperso, donde un microscopio confocal no podría recolectar fotones de manera eficiente. [20] Los microscopios de dos fotones con detección de campo amplio se utilizan frecuentemente para obtener imágenes funcionales, por ejemplo, imágenes de calcio , en el tejido cerebral. [21] Varias empresas los comercializan como microscopios multifotónicos , aunque las ventajas de utilizar excitación de 3 fotones en lugar de 2 fotones son marginales.

Microscopía de iluminación de un solo plano y microscopía de fluorescencia de lámina de luz.

Utilizando un plano de luz formado enfocando la luz a través de una lente cilíndrica en un ángulo estrecho o escaneando una línea de luz en un plano perpendicular al eje del objetivo, se pueden tomar secciones ópticas de alta resolución. [22] [23] [24] La iluminación de un solo plano, o iluminación de lámina de luz, también se logra utilizando técnicas de conformación de haz que incorporan expansores de haz de prismas múltiples . [25] [26] Las imágenes se capturan mediante CCD. Estas variantes permiten una captura de imágenes muy rápida y con una relación señal-ruido alta.

Microscopía multifotónica de campo amplio.

La microscopía multifotónica de campo amplio [27] [28] [29] [30] se refiere a una técnica de obtención de imágenes ópticas no lineales en la que se ilumina y se obtienen imágenes de una gran área del objeto sin necesidad de escanear. Se requieren altas intensidades para inducir procesos ópticos no lineales como la fluorescencia de dos fotones o la generación de segundos armónicos . En los microscopios multifotónicos de barrido, las altas intensidades se logran enfocando estrechamente la luz y la imagen se obtiene mediante barrido por haz. En la microscopía multifotónica de campo amplio, las altas intensidades se logran mejor utilizando una fuente de láser pulsado ópticamente amplificada para lograr un gran campo de visión (~100 µm). [27] [28] [29] La imagen en este caso se obtiene como un solo cuadro con una cámara CCD sin necesidad de escaneo, lo que hace que la técnica sea particularmente útil para visualizar procesos dinámicos simultáneamente en todo el objeto de interés. Con la microscopía multifotónica de campo amplio, la velocidad de fotogramas se puede aumentar hasta 1000 veces en comparación con la microscopía de barrido multifotónica . [28] Sin embargo, en el tejido disperso, la calidad de la imagen se degrada rápidamente a medida que aumenta la profundidad.

Deconvolución

La microscopía de fluorescencia es una técnica poderosa para mostrar estructuras específicamente marcadas dentro de un entorno complejo y proporcionar información tridimensional de estructuras biológicas. Sin embargo, esta información se ve confusa por el hecho de que, al iluminarse, todas las estructuras marcadas con fluorescencia emiten luz, independientemente de si están enfocadas o no. Así que una imagen de una determinada estructura siempre queda borrosa por el aporte de luz de estructuras que están desenfocadas. Este fenómeno produce una pérdida de contraste, especialmente cuando se utilizan objetivos con un alto poder de resolución, normalmente objetivos de inmersión en aceite con una alta apertura numérica.

Función de dispersión de puntos modelada matemáticamente de un sistema de imágenes láser de THz pulsado. [31]

Sin embargo, la borrosidad no es causada por procesos aleatorios, como la dispersión de la luz, sino que puede definirse bien por las propiedades ópticas de la formación de imágenes en el sistema de imágenes del microscopio. Si se considera una pequeña fuente de luz fluorescente (esencialmente un punto brillante), la luz procedente de este punto se extiende más desde nuestra perspectiva a medida que el punto se desenfoca más. En condiciones ideales, esto produce una forma de "reloj de arena" de esta fuente puntual en la tercera dimensión (axial). Esta forma se denomina función de dispersión puntual (PSF) del sistema de imágenes del microscopio. Dado que cualquier imagen de fluorescencia se compone de una gran cantidad de pequeñas fuentes de luz fluorescente, se dice que la imagen está "convolucionada por la función de dispersión de puntos". A la derecha se muestra el PSF modelado matemáticamente de un sistema de imágenes pulsadas con láser de terahercios.

La salida de un sistema de imágenes se puede describir mediante la ecuación:

Donde n es el ruido aditivo. [32] Conocer esta función de dispersión de puntos [33] significa que es posible revertir este proceso hasta cierto punto mediante métodos informáticos comúnmente conocidos como microscopía de deconvolución . [34] Hay varios algoritmos disponibles para la deconvolución 2D o 3D. Se pueden clasificar a grandes rasgos en métodos restauradores y no restaurativos . Si bien los métodos no restaurativos pueden mejorar el contraste eliminando la luz desenfocada de los planos focales, sólo los métodos restaurativos pueden reasignar la luz a su lugar de origen adecuado. Procesar imágenes fluorescentes de esta manera puede ser una ventaja sobre la adquisición directa de imágenes sin luz desenfocada, como las imágenes de microscopía confocal , porque las señales de luz que de otro modo se eliminan se convierten en información útil. Para la deconvolución 3D, normalmente se proporciona una serie de imágenes tomadas desde diferentes planos focales (llamada pila Z) más el conocimiento del PSF, que puede derivarse experimental o teóricamente del conocimiento de todos los parámetros contribuyentes del microscopio.

Técnicas de subdifracción

Ejemplo de microscopía de superresolución. Imagen de Her3 y Her2 , objetivo del fármaco contra el cáncer de mama Trastuzumab , dentro de una célula cancerosa.

En los últimos tiempos se han desarrollado multitud de técnicas de microscopía de superresolución que eluden el límite de difracción .

Esto se logra principalmente generando imágenes de una muestra suficientemente estática varias veces y modificando la luz de excitación u observando cambios estocásticos en la imagen. Se utilizan los métodos de deconvolución descritos en la sección anterior, que eliminan el desenfoque inducido por PSF y asignan un origen de luz matemáticamente "correcto", aunque con una comprensión ligeramente diferente de lo que significa el valor de un píxel. Suponiendo que la mayor parte del tiempo , un solo fluoróforo contribuye a una sola mancha en una sola imagen tomada, las manchas en las imágenes se pueden reemplazar con su posición calculada, mejorando enormemente la resolución hasta muy por debajo del límite de difracción.

Para hacer realidad tal suposición, el conocimiento y el control químico de la fotofísica de los fluoróforos es el núcleo de estas técnicas, mediante las cuales se obtienen resoluciones de ~20 nanómetros. [35] [36]

Microscopía amplificada codificada en tiempo en serie

La microscopía amplificada codificada en tiempo en serie (STEAM) es un método de obtención de imágenes que proporciona velocidades de obturación y de fotogramas ultrarrápidas, mediante el uso de amplificación óptica de imágenes para evitar el compromiso fundamental entre sensibilidad y velocidad, y un fotodetector de un solo píxel para eliminar la necesidad de un Limitaciones del conjunto de detectores y del tiempo de lectura [37] El método es al menos 1000 veces más rápido que las cámaras CCD y CMOS de última generación . En consecuencia, es potencialmente útil para aplicaciones científicas, industriales y biomédicas que requieren altas tasas de adquisición de imágenes, incluido el diagnóstico y la evaluación en tiempo real de ondas de choque, microfluidos , MEMS y cirugía láser . [38]

Extensiones

La mayoría de los instrumentos modernos ofrecen soluciones sencillas para la microfotografía y el registro de imágenes electrónicamente. Sin embargo, estas capacidades no siempre están presentes y el microscopista más experimentado puede preferir una imagen dibujada a mano a una fotografía. Esto se debe a que un microscopista con conocimientos en el tema puede convertir con precisión una imagen tridimensional en un dibujo bidimensional preciso. Sin embargo, en una fotografía u otro sistema de captura de imágenes, sólo un plano delgado está bien enfocado. [ cita necesaria ]

La creación de micrografías precisas requiere una técnica microscópica que utiliza un ocular monocular. Es esencial que ambos ojos estén abiertos y que el ojo que no está observando por el microscopio esté concentrado en una hoja de papel en la mesa al lado del microscopio. Con práctica, y sin mover la cabeza ni los ojos, es posible trazar con precisión las formas observadas "viendo" simultáneamente la punta del lápiz en la imagen microscópica. [ cita necesaria ]

Siempre resulta menos cansado observar con el microscopio enfocado de manera que la imagen se vea al infinito y con los dos ojos abiertos en todo momento. [ cita necesaria ]

Otras mejoras

Microespectroscopia: espectroscopia con microscopio.

radiografía

Como la resolución depende de la longitud de onda de la luz. La microscopía electrónica se ha desarrollado desde la década de 1930 y utiliza haces de electrones en lugar de luz. Debido a la longitud de onda mucho más pequeña del haz de electrones, la resolución es mucho mayor.

Aunque es menos común, la microscopía de rayos X también se ha desarrollado desde finales de los años 1940. La resolución de la microscopía de rayos X se encuentra entre la de la microscopía óptica y la microscopía electrónica.

Microscopio de electrones

Hasta la invención de la microscopía de subdifracción, la longitud de onda de la luz limitaba la resolución de la microscopía tradicional a unos 0,2 micrómetros. Para obtener una mayor resolución, en los microscopios electrónicos se utiliza un haz de electrones con una longitud de onda mucho más pequeña.

Los microscopios electrónicos equipados para espectroscopia de rayos X pueden proporcionar análisis elementales cualitativos y cuantitativos. Este tipo de microscopio electrónico, también conocido como microscopio electrónico analítico, puede ser una herramienta muy poderosa para la investigación de nanomateriales. [39]

Microscopía de sonda de barrido

Esta es una técnica de subdifracción. Ejemplos de microscopios de sonda de barrido son el microscopio de fuerza atómica (AFM), el microscopio de efecto túnel , el microscopio de fuerza fotónica y el microscopio de seguimiento de recurrencia . Todos estos métodos utilizan el contacto físico de una punta de sonda sólida para escanear la superficie de un objeto, que se supone que es casi plano.

Fuerza ultrasónica

La microscopía de fuerza ultrasónica (UFM) se ha desarrollado para mejorar los detalles y el contraste de la imagen en áreas de interés "planas" donde las imágenes AFM tienen un contraste limitado. La combinación de AFM-UFM permite generar una imagen microscópica acústica de campo cercano. La punta AFM se utiliza para detectar ondas ultrasónicas y supera la limitación de longitud de onda que se produce en la microscopía acústica. Al utilizar los cambios elásticos debajo de la punta del AFM, se puede generar una imagen con mucho mayor detalle que la topografía del AFM.

La microscopía de fuerza ultrasónica permite el mapeo local de la elasticidad en microscopía de fuerza atómica mediante la aplicación de vibración ultrasónica al voladizo o muestra. Para analizar los resultados de la microscopía de fuerza ultrasónica de manera cuantitativa, se realiza una medición de la curva fuerza-distancia con vibración ultrasónica aplicada a la base del voladizo, y los resultados se comparan con un modelo de la dinámica del voladizo y la interacción punta-muestra basado en el Técnica de diferencias finitas.

Microscopía ultravioleta

Los microscopios ultravioleta tienen dos propósitos principales. La primera es utilizar la longitud de onda más corta de la energía electromagnética ultravioleta para mejorar la resolución de la imagen más allá del límite de difracción de los microscopios ópticos estándar. Esta técnica se utiliza para la inspección no destructiva de dispositivos con características muy pequeñas, como las que se encuentran en los semiconductores modernos. La segunda aplicación de los microscopios UV es la mejora del contraste, donde se mejora la respuesta de las muestras individuales, en relación con su entorno, debido a la interacción de la luz con las moléculas dentro de la propia muestra. Un ejemplo es el crecimiento de cristales de proteínas . Los cristales de proteínas se forman en soluciones salinas. Como tanto los cristales de sal como los de proteínas se forman en el proceso de crecimiento y ambos suelen ser transparentes al ojo humano, no se pueden diferenciar con un microscopio óptico estándar. Como el triptófano de la proteína absorbe luz a 280 nm, la obtención de imágenes con un microscopio UV con filtros de paso de banda de 280 nm simplifica la diferenciación entre los dos tipos de cristales. Los cristales de proteína aparecen oscuros mientras que los cristales de sal son transparentes.

Microscopía infrarroja

El término microscopía infrarroja se refiere a la microscopía realizada en longitudes de onda infrarrojas . En la configuración típica del instrumento, un espectrómetro infrarrojo por transformada de Fourier (FTIR) se combina con un microscopio óptico y un detector de infrarrojos . El detector de infrarrojos puede ser un detector de un solo punto, una matriz lineal o una matriz de plano focal 2D. FTIR proporciona la capacidad de realizar análisis químicos mediante espectroscopia infrarroja y el microscopio y el detector puntual o de matriz permiten que este análisis químico se resuelva espacialmente, es decir, se realice en diferentes regiones de la muestra. Como tal, la técnica también se llama microespectroscopia infrarroja [40] [41] Una arquitectura alternativa llamada Imagen infrarroja directa por láser (LDIR) implica la combinación de una fuente de luz infrarroja sintonizable y un detector de un solo punto en un objetivo volador. Esta técnica se utiliza con frecuencia para imágenes químicas infrarrojas , donde el contraste de la imagen está determinado por la respuesta de regiones de muestra individuales a longitudes de onda IR particulares seleccionadas por el usuario, generalmente bandas de absorción IR específicas y resonancias moleculares asociadas . Una limitación clave de la microespectroscopia infrarroja convencional es que la resolución espacial está limitada por la difracción . En concreto la resolución espacial se limita a una cifra relacionada con la longitud de onda de la luz. Para los microscopios IR prácticos, la resolución espacial está limitada a 1-3 veces la longitud de onda, dependiendo de la técnica y el instrumento específicos utilizados. Para longitudes de onda de infrarrojo medio, esto establece un límite de resolución espacial práctico de ~3-30 μm.

También existen versiones IR de microscopía de subdifracción. [40] [41] Estos incluyen el microscopio óptico de barrido de campo cercano por infrarrojos (NSOM) , [42] la microespectroscopia fototérmica y la espectroscopia infrarroja basada en microscopio de fuerza atómica (AFM-IR) , así como la microscopía óptica de campo cercano de barrido de tipo dispersión ( s-SNOM) [43] y nano-FTIR que proporcionan resolución espacial a nanoescala en longitudes de onda IR.

Microscopía holográfica digital

Células humanas fotografiadas mediante cambio de fase DHM (izquierda) y microscopía de contraste de fase (derecha)

En la microscopía holográfica digital (DHM), los frentes de ondas de interferencia de una fuente de luz coherente (monocromática) se registran en un sensor. La imagen es reconstruida digitalmente por una computadora a partir del holograma grabado . Además de la imagen de campo brillante normal, se crea una imagen de cambio de fase .

DHM puede funcionar tanto en modo de reflexión como de transmisión. En el modo de reflexión, la imagen de cambio de fase proporciona una medición de distancia relativa y, por lo tanto, representa un mapa topográfico de la superficie reflectante. En el modo de transmisión, la imagen de cambio de fase proporciona una medición cuantitativa sin etiquetas del espesor óptico de la muestra. Las imágenes de cambio de fase de células biológicas son muy similares a las imágenes de células teñidas y han sido analizadas con éxito mediante software de análisis de alto contenido .

Una característica única de DHM es la capacidad de ajustar el enfoque después de grabar la imagen, ya que el holograma registra todos los planos de enfoque simultáneamente. Esta característica permite obtener imágenes de partículas en movimiento en un volumen o escanear rápidamente una superficie. Otra característica atractiva es la capacidad de DHM de utilizar ópticas de bajo coste corrigiendo las aberraciones ópticas mediante software.

Patología digital (microscopía virtual)

La patología digital es un entorno de información basado en imágenes habilitado por tecnología informática que permite la gestión de la información generada a partir de una diapositiva digital. La patología digital está habilitada en parte por la microscopía virtual , que es la práctica de convertir portaobjetos de vidrio en portaobjetos digitales que se pueden ver, gestionar y analizar.

Microscopía láser

La microscopía láser es un campo en rápido crecimiento que utiliza fuentes de iluminación láser en diversas formas de microscopía. [44] Por ejemplo, la microscopía láser centrada en aplicaciones biológicas utiliza láseres de pulso ultracorto , en una serie de técnicas denominadas microscopía no lineal, microscopía de saturación y microscopía de excitación de dos fotones . [45]

Desde hace varios años se vienen desarrollando láseres de rayos X de laboratorio de alta intensidad y pulso corto . Cuando esta tecnología llegue a buen término, será posible obtener imágenes tridimensionales ampliadas de estructuras biológicas elementales en estado de vida en un instante definido con precisión. Para un contraste óptimo entre agua y proteínas y para una mejor sensibilidad y resolución, el láser debe sintonizarse cerca de la línea de nitrógeno a aproximadamente 0,3 nanómetros. La resolución estará limitada principalmente por la expansión hidrodinámica que se produce mientras se registra el número necesario de fotones. [46] Por lo tanto, aunque el espécimen es destruido por la exposición, su configuración puede capturarse antes de que explote. [47] [48] [49] [50] [51] [52] [ citas excesivas ]

Los científicos han estado trabajando en diseños prácticos y prototipos de microscopios holográficos de rayos X, a pesar del largo desarrollo del láser apropiado. [53] [54] [55] [56] [57] [58] [59] [60] [ citas excesivas ]

Microscopía fotoacústica

Micrografía fotoacústica de glóbulos rojos humanos.

Una técnica de microscopía que se basa en el efecto fotoacústico , [61] es decir, la generación de (ultra)sonido causado por la absorción de luz. Un rayo láser enfocado y de intensidad modulada se escanea en forma de trama sobre una muestra. El (ultra)sonido generado se detecta mediante un transductor de ultrasonidos. Normalmente se emplean transductores de ultrasonido piezoeléctricos. [62]

El contraste de la imagen está relacionado con el coeficiente de absorción de la muestra . Esto contrasta con la microscopía de campo brillante u oscuro, donde el contraste de la imagen se debe a la transmitancia o dispersión. En principio, el contraste de la microscopía de fluorescencia también es proporcional a la absorción de la muestra. Sin embargo, en microscopía de fluorescencia, el rendimiento cuántico de fluorescencia debe ser distinto de cero para que se pueda detectar una señal. Sin embargo, en la microscopía fotoacústica, cada sustancia absorbente emite una señal fotoacústica que es proporcional a

Aquí está el coeficiente de Grüneisen, es la energía del fotón del láser y es la energía de la banda prohibida de la muestra. Por lo tanto, la microscopía fotoacústica parece muy adecuada como técnica complementaria a la microscopía de fluorescencia, ya que un alto rendimiento cuántico de fluorescencia conduce a altas señales de fluorescencia y un bajo rendimiento cuántico de fluorescencia conduce a altas señales fotoacústicas.

Despreciando los efectos no lineales, la resolución lateral dx está limitada por el límite de difracción de Abbe :

donde es la longitud de onda del láser de excitación y NA es la apertura numérica de la lente del objetivo. El límite de difracción de Abbe se cumple si el frente de onda entrante es paralelo. En realidad, sin embargo, el perfil del rayo láser es gaussiano. Por lo tanto, para calcular la resolución alcanzable, se deben utilizar fórmulas para haces gaussianos truncados. [63]

Microscopía amateur

La Microscopía Amateur es la investigación y observación de especímenes biológicos y no biológicos con fines recreativos. Los coleccionistas de minerales , insectos , conchas marinas y plantas pueden utilizar microscopios como herramientas para descubrir características que les ayuden a clasificar los objetos recolectados. Otros aficionados pueden estar interesados ​​en observar la vida que se encuentra en el agua de los estanques y en otras muestras. Los microscopios también pueden resultar útiles para evaluar la calidad del agua para las personas que mantienen un acuario en casa. La documentación fotográfica y el dibujo de imágenes microscópicas son placeres adicionales. Hay concursos de arte de fotomicrografía . Los participantes de este pasatiempo pueden utilizar portaobjetos microscópicos preparados comercialmente o preparar sus propios portaobjetos.

Si bien la microscopía es una herramienta central en la documentación de especímenes biológicos, a menudo es insuficiente para justificar la descripción de una nueva especie basándose únicamente en investigaciones microscópicas. A menudo son necesarias pruebas genéticas y bioquímicas para confirmar el descubrimiento de una nueva especie. Un laboratorio y acceso a la literatura académica es una necesidad. Hay, sin embargo, una ventaja que tienen los aficionados sobre los profesionales: tiempo para explorar su entorno. A menudo, los aficionados avanzados se asocian con profesionales para validar sus hallazgos y posiblemente describir nuevas especies.

A finales del siglo XIX, la microscopía amateur se convirtió en un pasatiempo popular en Estados Unidos y Europa. Varios "aficionados profesionales" recibían pagos de filántropos para sus viajes de muestreo y exploraciones microscópicas, para entretenerlos el domingo por la tarde (por ejemplo, el especialista en diatomeas A. Grunow, pagado por (entre otros) un industrial belga). El profesor John Phin publicó "Consejos prácticos sobre la selección y uso del microscopio (segunda edición, 1878)" y también fue editor del "American Journal of Microscopy".

Ejemplos de imágenes de microscopía amateur:

Aplicación en ciencia forense

La microscopía tiene aplicaciones en las ciencias forenses. [64] El microscopio puede detectar, resolver y obtener imágenes de las pruebas más pequeñas, a menudo sin ninguna alteración o destrucción. El microscopio se utiliza para identificar y comparar fibras, pelos, tierra y polvo...etc.

En marcas de tinta, manchas de sangre o balas, no se requiere tratamiento de la muestra y la evidencia se muestra directamente en el examen microscópico. Para rastros de una materia particular, la preparación de la muestra debe realizarse antes de que se realice el examen microscópico. [ se necesita aclaración ]

Los microscopios ópticos son los más utilizados en medicina forense, ya que utilizan fotones para formar imágenes; los microscopios que son más aplicables para examinar muestras forenses son los siguientes: [65]

1. El microscopio compuesto

2. El microscopio de comparación

3. El microscopio estereoscópico

4. El microscopio polarizador

5. El micro espectrofotómetro

Esta diversidad de tipos de microscopios en aplicaciones forenses proviene principalmente de sus rangos de aumento, que son (1-1200X), (50-30.000X) y (500-250.000X) para la microscopía óptica, SEM y TEM respectivamente. [sesenta y cinco]

Ver también

Referencias

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Otras lecturas

enlaces externos

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